本文關(guān)鍵詞：迷迭香酸對(duì)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的帕金森病模型的保護(hù)作用及機(jī)制研究

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【摘要】：帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一種多發(fā)于中老年的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,以運(yùn)動(dòng)不能、肌僵直、靜止性震顫及姿勢(shì)反射障礙為特征性表現(xiàn),其病理學(xué)特征是中腦黑質(zhì)(substantia nigra,SN)多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元脫失,殘存的神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)路易小體(Lewy bodies,LBs)。而alpha-突觸核蛋白是LBs的主要成分,其基因錯(cuò)義突變(A53T,A30P,E46K)能夠?qū)е录易逍訮D。研究已經(jīng)證實(shí)alpha-突觸核蛋白的異常聚集是PD發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵因素,因此研究降低alpha-突觸核蛋白的分子或藥物成為治療PD的重要策略。迷迭香酸(rosmarinic acid,RA)是一種水溶性的多酚羥基化合物,廣泛分布于植物中,由一分子咖啡酸和一分子3,4-二羥基苯基乳酸(即丹參素)縮合而成。迷迭香酸是天然的抗氧化劑,具有抗炎、抗菌、抗病毒和免疫抑制等多種生物活性。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究工作表明,迷迭香酸對(duì)6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)誘導(dǎo)的PD大鼠SN的DA能神經(jīng)元具有保護(hù)作用,其機(jī)制可能與抗氧化、降低SN鐵水平有關(guān)。在離體實(shí)驗(yàn)中,迷迭香酸也可以通過(guò)抗氧化作用拮抗神經(jīng)毒素1-甲基-4苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridium,MPP+)和6-OHDA導(dǎo)致的DA能神經(jīng)元的損傷。但其確切的神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)制仍不清楚。由于alpha-突觸核蛋白在PD發(fā)病機(jī)制中的重要作用,其錯(cuò)義突變和異常聚集能夠?qū)е翫A能神經(jīng)元的退行性改變,而氧化應(yīng)激能夠?qū)е耡lpha-突觸核蛋白的異常聚集,提示迷迭香酸可能通過(guò)其抗氧化作用抑制alpha-突觸核蛋白的異常聚集。研究也證實(shí)迷迭香酸在體外可以抑制alpha-突觸核蛋白纖維的生成,但是迷迭香酸在PD中的保護(hù)作用是否與抑制alpha-突觸核蛋白的聚集有關(guān)及可能的機(jī)制尚不清楚。魚(yú)藤酮是一種常用的除草劑和殺蟲(chóng)劑,能夠通過(guò)血腦屏障,通過(guò)抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物I的活性,從而導(dǎo)致SN DA能神經(jīng)元的能量合成障礙,進(jìn)而引起神經(jīng)元的死亡。因此,魚(yú)藤酮被用于PD模型的制備。與其他的PD動(dòng)物模型相比,魚(yú)藤酮制備的PD模型具有明顯的優(yōu)勢(shì),它能夠模擬PD的病理性特征變化,包括SN DA能神經(jīng)元數(shù)目的降低和殘存神經(jīng)元內(nèi)的alpha-突觸核蛋白的聚集。因此,本實(shí)驗(yàn)選用魚(yú)藤酮制備的PD模型,應(yīng)用免疫熒光、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blots、流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù),研究了迷迭香酸對(duì)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的alpha-突觸核蛋白聚集的作用,并深入探討其可能的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.魚(yú)藤酮處理C57BL/6小鼠56天后,小鼠在旋轉(zhuǎn)棒上的停留時(shí)間縮短46%,與對(duì)照組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);20 mg/kg及50 mg/kg迷迭香酸預(yù)保護(hù)組小鼠在旋轉(zhuǎn)棒上的停留時(shí)間分別增加83%和79%,與魚(yú)藤酮組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.魚(yú)藤酮處理C57BL/6小鼠56天后,小鼠SN DA能神經(jīng)元數(shù)目減少42%,與對(duì)照組相比,差別有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001);SN區(qū)酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的表達(dá)降低28%,與對(duì)照組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。20 mg/kg及50 mg/kg迷迭香酸預(yù)保護(hù)組小鼠SN DA能神經(jīng)元數(shù)目與魚(yú)藤酮組相比分別增加28%和41%,SN區(qū)TH表達(dá)與魚(yú)藤酮處理組相比分別增加15%和30%,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.魚(yú)藤酮處理C57BL/6小鼠56天后,小鼠SN區(qū)alpha-突觸核蛋白的表達(dá)增加37%,與對(duì)照組相比,差別有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001);20 mg/kg及50 mg/kg迷迭香酸預(yù)保護(hù)組小鼠SN區(qū)alpha-突觸核蛋白的表達(dá)分別降低19%和22%,與魚(yú)藤酮組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.500 nmol/L魚(yú)藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后,細(xì)胞存活率降低33%,與對(duì)照組相比,差別有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001);而10-5~10-10 mol/L迷迭香酸預(yù)處理組細(xì)胞存活率分別增加18%、21%、14%、10%、18%和14%,與魚(yú)藤酮組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.500 nmol/L魚(yú)藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后,細(xì)胞線粒體跨膜電位差(mitochondrial transmembrane potential,ΔΨm)降低10%,與對(duì)照組相比,差別有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001);細(xì)胞內(nèi)B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、磷酸化Bcl-x1/Bcl-2相關(guān)死亡啟動(dòng)子(Bcl-xl/Bcl-2-associated death promoter,Bad)的表達(dá)分別降低56%和40%,與對(duì)照組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。10-9、10-5 mol/L迷迭香酸預(yù)處理組細(xì)胞ΔΨm分別升高8%和6%,與魚(yú)藤酮組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001);細(xì)胞內(nèi)Bcl-2的表達(dá)分別增加61%和76%,p-Bad的表達(dá)分別增加46%和51%,與魚(yú)藤酮組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6.500 nmol/L魚(yú)藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后,細(xì)胞內(nèi)alpha-突觸核蛋白m RNA的表達(dá)增加3.44倍,與對(duì)照組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);10-9、10-5 mol/L迷迭香酸預(yù)處理組細(xì)胞alpha-突觸核蛋白m RNA表達(dá)分別降低66%和52%,與魚(yú)藤酮組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。魚(yú)藤酮組細(xì)胞內(nèi)alpha-突觸核蛋白的聚集較對(duì)照組明顯增多。而10-9、10-5 mol/L迷迭香酸預(yù)處理可以拮抗魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的alpha-突觸核蛋白的聚集。7.500 nmol/L魚(yú)藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后,細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì)(reactive oxide species,ROS)的生成增加139%,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的表達(dá)降低42%,與對(duì)照組相比,差別有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。10-9、10-5mol/L迷迭香酸預(yù)處理組細(xì)胞ROS的生成分別減少57%和75%,與魚(yú)藤酮組相比,差別有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001);細(xì)胞內(nèi)SOD的表達(dá)分別增加35%和32%,與魚(yú)藤酮組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。8.500 nmol/L魚(yú)藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后,細(xì)胞內(nèi)血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)的表達(dá)降低50%,與對(duì)照組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001);10-9、10-5 mol/L迷迭香酸預(yù)處理組細(xì)胞內(nèi)HO-1表達(dá)分別增加52%和37%,與魚(yú)藤酮組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。9.500 nmol/L魚(yú)藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后,細(xì)胞核內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子NF2E2相關(guān)因子2(NF2E2-related factor 2,Nrf2)的表達(dá)增加71%,與對(duì)照組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);10-9、10-5 mol/L迷迭香酸預(yù)處理組細(xì)胞核內(nèi)Nrf2的表達(dá)分別增加25%和40%,與魚(yú)藤酮組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。10.500 nmol/L魚(yú)藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后,細(xì)胞內(nèi)缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)、缺氧誘導(dǎo)因子2α(hypoxia-inducible factor-2α,HIF-2α)的表達(dá)分別降低76%和37%,與對(duì)照組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);10-9 mol/L迷迭香酸預(yù)處理組細(xì)胞內(nèi)的HIF-1α、HIF-2α的表達(dá)分別增加39%和43%,與魚(yú)藤酮組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。11.500 nmol/L魚(yú)藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后,細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)的表達(dá)降低44%,與對(duì)照組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001);10-9、10-5 mol/L迷迭香酸預(yù)處理組細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)分別降低33%和33%,與魚(yú)藤酮組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。12.500 nmol/L魚(yú)藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后,細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)酶(extracellular signal regulated kinases,ERKs)的磷酸化水平降低77%,與對(duì)照組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001);10-9、10-5 mol/L迷迭香酸預(yù)處理組細(xì)胞內(nèi)ERK1/2的磷酸化水平分別增加75%和100%,與魚(yú)藤酮組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。MEK特異性抑制劑PD98059(10μM)預(yù)處理0.5 h后與迷迭香酸以及魚(yú)藤酮共同孵育24 h,可以完全阻斷迷迭香酸誘導(dǎo)的HO-1、HSP70的上調(diào),細(xì)胞內(nèi)HO-1、HSP70的表達(dá)分別減少30%和25%,與10-9 M迷迭香酸/魚(yú)藤酮組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。上述結(jié)果表明:迷迭香酸能夠保護(hù)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的PD小鼠模型,其保護(hù)作用的機(jī)制可能與其降低魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的PD小鼠SN的alpha-突觸核蛋白的表達(dá)有關(guān);體外實(shí)驗(yàn)的機(jī)制研究證實(shí)迷迭香酸可以通過(guò)保護(hù)線粒體功能,上調(diào)Bcl-2以及p-Bad的表達(dá),從而拮抗魚(yú)藤酮引起的細(xì)胞凋亡。迷迭香酸可能通過(guò)其抗氧化作用降低魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的alpha-突觸核蛋白的表達(dá),并通過(guò)MEK/ERK通路上調(diào)HO-1及HSP70的表達(dá),抑制alpha-突觸核蛋白的異常聚集,促進(jìn)異常alpha-突觸核蛋白的降解,從而降低alpha-突觸核蛋白的蛋白水平,并證實(shí)其上調(diào)HO-1的機(jī)制可能與上調(diào)Nrf2以及HIF-1α的表達(dá)有關(guān)。以上結(jié)果提示迷迭香酸可能通過(guò)抑制α-突觸核蛋白的表達(dá)并增強(qiáng)其蛋白降解,從而降低魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的alpha-突觸核蛋白的蛋白水平,并抑制魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡而發(fā)揮其在PD中的神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)所研究的迷迭香酸對(duì)DA能神經(jīng)元的保護(hù)作用及其可能機(jī)制的初步探討,為PD的防治提供全新的研究結(jié)果和藥物防治的新策略。
【關(guān)鍵詞】：帕金森病 魚(yú)藤酮 alpha-突觸核蛋白 迷迭香酸
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R742.5;R-332
【目錄】：

• 摘要2-6
• Abstract6-12
• 引言12-15
• 材料和方法15-26
• 1. 動(dòng)物準(zhǔn)備15
• 2. 轉(zhuǎn)棒儀實(shí)驗(yàn)15
• 3. SN區(qū)TH染色15-17
• 4. 免疫印跡法測(cè)定SN區(qū)TH、alpha-突觸核蛋白水平。17-18
• 5. 細(xì)胞培養(yǎng)18-19
• 6. 細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì)（reactive oxygen species，ROS）的檢測(cè)19-20
• 7. 線粒體跨膜電位（mitochondrial transmembrane potential，△Ψm）的檢測(cè)20-21
• 8. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)alpha-突觸核蛋白mRNA的水平21-23
• 9. 熒光雙標(biāo)檢測(cè)alpha-突觸核蛋白聚集23-24
• 10. HO-1，，Nrf2，SOD，HIF-1α，HIF-2α，HSP70，Bcl-2，p-Bad，p-ERK和p-JNK蛋白表達(dá)的檢測(cè)24-25
• 11. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理25-26
• 結(jié)果26-43
• 1. 迷迭香酸對(duì)魚(yú)藤酮模型小鼠體重和旋轉(zhuǎn)行為的影響26-27
• 2. 迷迭香酸對(duì)魚(yú)藤酮模型小鼠SN DA能神經(jīng)元的影響27-28
• 3. 迷迭香酸對(duì)魚(yú)藤酮模型小鼠SN TH、alpha-突觸核蛋白表達(dá)的影響28-30
• 4. 迷迭香酸對(duì)魚(yú)藤酮處理的SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響30
• 5. 迷迭香酸對(duì)魚(yú)藤酮處理的SH-SY5Y細(xì)胞 ΔΨm的影響30-31
• 6. 迷迭香酸對(duì)魚(yú)藤酮處理的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、p-Bad表達(dá)的影響31-33
• 7. 迷迭香酸對(duì)魚(yú)藤酮處理的SH-SY5Y細(xì)胞alpha-突觸核蛋白mRNA表達(dá)和聚集的影響33-34
• 8. 迷迭香酸對(duì)魚(yú)藤酮處理的SH-SY5Y細(xì)胞ROS生成的影響34-35
• 9. 迷迭香酸對(duì)魚(yú)藤酮處理的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)SOD表達(dá)的影響35-36
• 10. 迷迭香酸對(duì)魚(yú)藤酮處理的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)HO-1 表達(dá)的影響及機(jī)制36-39
• 11. 迷迭香酸對(duì)魚(yú)藤酮處理的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)HSP70表達(dá)的影響及機(jī)制39-43
• 討論43-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-54
• 綜述54-70
• 參考文獻(xiàn)61-70
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果70-72
• 縮略詞表72-74
• 致謝74-75

【共引文獻(xiàn)】

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1 劉瀚e

本文編號(hào)：682000