本文關(guān)鍵詞：中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后谷氨酸的神經(jīng)細(xì)胞毒性作用的機(jī)理研究

  更多相關(guān)文章： 谷氨酸 線粒體功能障礙 神經(jīng)毒性 mfn2蛋白 Calpain蛋白

【摘要】：背景：L-谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的興奮性神經(jīng)傳導(dǎo)遞質(zhì),主要位于大腦皮層和海馬等部位。當(dāng)谷氨酸病理性升高時(shí),其作為一種神經(jīng)毒素可以誘導(dǎo)嚴(yán)重的神經(jīng)元損傷,谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞的過度激活或谷氨酸的過度刺激都將引起細(xì)胞的死亡,這種病理過程被稱為谷氨酸的神經(jīng)毒性。因而谷氨酸被認(rèn)為是“雙刃劍”,既是神經(jīng)遞質(zhì)又可以作為神經(jīng)毒素。而此病理過程廣泛的幾乎存在于所有神經(jīng)系統(tǒng)疾病中,包括腦出血(動脈瘤,高血壓腦出血等),腦缺血,卒中,腦外傷,腦腫瘤以及一些神經(jīng)退行性變疾病例如肌萎縮側(cè)索硬化癥,帕金森病慢性進(jìn)行性舞蹈病等。近年來的研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸的神經(jīng)毒性伴隨著線粒體膜電位的下降以及細(xì)胞內(nèi)活性氧的過度生成,這些線粒體功能障礙指標(biāo)提示谷氨酸的神經(jīng)毒性與線粒體功能可能存在聯(lián)系。線粒體是一種高度動態(tài)的細(xì)胞器,通過不斷的分裂融合保持線粒體動力學(xué)穩(wěn)態(tài)。最近研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)這種穩(wěn)態(tài)被破壞時(shí)會影響到線粒體正常的功能,趨向于分裂導(dǎo)致線粒體碎片產(chǎn)生,線粒體縮短；相反趨向于融合時(shí)導(dǎo)致線粒體變長。線粒體的融合／分裂運(yùn)動主要被一系列線粒體融合／分裂蛋白調(diào)控。這些蛋白主要包括了：分裂蛋白：.dynamin-like protein 1(DLP1,也叫Drp1),以及它的作用因子包括Fis1,Mff, MiD49 and MiD51;融合蛋白：Mitofusin 1 (Mfn1), Mitofusin 2 (Mfn2)以及optic atrophy protein 1(OPA1)。這些蛋白除了調(diào)控線粒體的形態(tài),也在線粒體功能正常運(yùn)行的各個(gè)環(huán)節(jié)上有重要的作用。因而順理成章,目前已有很多研究表明線粒體的分裂／融合穩(wěn)態(tài)的改變可以導(dǎo)致線粒體的功能障礙,引起相關(guān)神經(jīng)疾病。既然谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)毒性與線粒體功能相關(guān),而線粒體功能又與線粒體動力學(xué)穩(wěn)態(tài)相關(guān),那么線粒體的動力學(xué)穩(wěn)態(tài)是否就是谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)毒性的關(guān)鍵一環(huán)呢?為了解決這個(gè)問題,我們分別在大鼠原代神經(jīng)細(xì)胞,小鼠谷氨酸模型,轉(zhuǎn)基因小鼠以及人體上,從體外實(shí)驗(yàn)到體內(nèi)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用轉(zhuǎn)染,RNAi抑制,基因敲出,基因過表達(dá),免疫印跡雜交,PCR,免疫組化,免疫熒光共聚焦,電鏡,LDH,ROS, MMP, OCR, ATP測定等實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行了全方位立體化的探索。目的：通過對大鼠原代神經(jīng)細(xì)胞,谷氨酸灌注小鼠模型,轉(zhuǎn)基因小鼠,人體標(biāo)本的研究,探索谷氨酸的神經(jīng)毒性信號通路,然后找到并證實(shí)介導(dǎo)谷氨酸神經(jīng)毒性的關(guān)鍵蛋白,最終在細(xì)胞內(nèi),細(xì)胞外,動物模型以及人體上闡明并證明谷氨酸的神經(jīng)毒性機(jī)理以及信號通路。方法和材料：抗體、質(zhì)粒、化學(xué)試劑及測量方法購買或獲得質(zhì)粒：MitoDsRed2 (Clontech 公司, Mountain View, CA), Case 12 construct(來自Evrogen公司,Moscow, Russia), GFP-Cre (來自Addgene公司,Cambridge MA)以及GFP/Myc-tagged Mfn2(斯坦福大學(xué)提供).通過neomycin/kanamycin抑制基因在MitoDsRed2序列中利用核定位信號(GFP-Cre質(zhì)粒中的NLS-Cre)增加Cre序列成功構(gòu)建MitoDsRed2/Cre雙啟動子質(zhì)粒.克隆mitoDsRed2并導(dǎo)入pLVX-Puro (Clontech公司,Mountain View, CA)質(zhì)粒用NLS-Cre替代puromycin抑制基因成功構(gòu)建MitoDsRed2/Cre雙啟動子慢病毒。利用第三代慢病毒包裝盒(包裝系統(tǒng)：pMDLg/pRRE和pRSV-Rev;包裹質(zhì)粒：Addgene公司,Cambridge MA 的pMD2.G)成功制備慢病毒。以下抗體應(yīng)用于本實(shí)驗(yàn)包括mouse anti-VDAC1/rabbit anti-Mff/Spectrin抗體(來自Abcam公司,Cambridge, MA), rabbit anti-Calpainl,Calpain 2 and cleaved caspase-3抗體(來自Cell signaling公司,Danvers,MA),rabbit anti-Mfn1/mouse anti-Mfn2抗體(來自Santa Cruz, Dallas公司,Texas),mouse anti-HB9抗體(來自D SHB公司,Iowa City, IA),mouse anti-GFAP抗體(來自Invitrogen公司,Grand Island, NY), rabbit anti-Ibal抗體(來自Wako,Richmond, VA) mouse anti-DLP1/OPA1/Tom20抗體(來自BD公司,Franklin Lakes, NJ)以及mouse anti-actin/rabbit anti-MAP2抗體(來自Millipore公司,Billerica, MA).谷氨酸(來自Sigma公司,St. Louis, MO) and MK-801/Calpeptin/BAPTA-AM/Z-VAD-FMK制劑(來自Tocris公司,Minneapolis, MN).利用ATP Colorimetric/Fluorometric試劑盒(來自Biovision公司,Milpitas,CA)測定ATP水平。運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞以60,000個(gè)細(xì)胞/孔的密度培養(yǎng),其氧消耗量的測定由Seahorse XF24 Analyzer (Seahorse Bioscience公司,North Billerica,MA)完成.在不同的時(shí)間點(diǎn)分別注射ATP合成抑制劑oligomycin(1μM),解偶聯(lián)劑FCCP(4μM)and復(fù)合物Ⅰ抑制劑antimycin A (1μM)和rotenone (1μM)。得到數(shù)據(jù)后,裂解細(xì)胞并測定細(xì)胞總蛋白,氧消耗量根據(jù)總蛋白不同進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化量化。通過Cytotoxicity Detection試劑盒(LDH; Roche公司,Nutley, NJ)或Cell Proliferation試劑盒(MTT法；Roche公司,Nutley, NJ)測定細(xì)胞死亡和生存率。通過細(xì)胞普羅匹定碘化物測定神經(jīng)細(xì)胞存活率。 帶有普羅匹定碘化物陽性細(xì)胞核或者可見的細(xì)胞核碎片或神經(jīng)突碎片的神經(jīng)細(xì)胞計(jì)作壞死神經(jīng)細(xì)胞,而普羅匹定碘化物陰性的細(xì)胞核并且具有完整的神經(jīng)細(xì)胞核輪廓或者神經(jīng)突的神經(jīng)元計(jì)為存貨細(xì)胞。原代神經(jīng)細(xì)胞的分離原代神經(jīng)細(xì)胞分離(應(yīng)用大鼠腦組織或胚胎或)利用鼠Thy-1.2基因表達(dá)盒將Thyl-Mfn2注射入C57BL/6N鼠受精卵內(nèi)成功構(gòu)建mfn2過表達(dá)小鼠。根據(jù)美國動物保健和使用委員會(IACUC)制定的指南處理適宜懷孕時(shí)間的Sprague-Dawley母鼠(大鼠)(Harlan or Charles River)或者C57BL/6N母鼠(小鼠),成功從E13-15母鼠(大鼠)/E12-14母鼠(小鼠)胚胎中分離原代運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞,從E18母鼠(大鼠)胚胎中分離原代神經(jīng)細(xì)胞。線粒體的純化及蛋白質(zhì)印記分析在細(xì)胞中加入1xLysis buffer(Cell Signaling公司, Danvers,MA)和 1 mM PMSF(Sigma公司,St. Louis, M O)以及蛋白酶抑制劑(Sigma公司,St. Louis, MO)提取總蛋白.用SDS-PAGE溶解同樣體積的總蛋白然后轉(zhuǎn)到Immobilon-P (Millipore公司,Billerica, MA)膜.10%的脫脂牛奶封閉后,用一抗二抗進(jìn)行孵育,蛋白膜用Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore公司,Billerica, MA)顯影劑進(jìn)行顯影曝光.谷氨酸灌注小鼠動物模型的建立所有小鼠的手術(shù)及手術(shù)過程嚴(yán)格按照美國NIH指南進(jìn)行,并且依據(jù)動物護(hù)理及使用協(xié)會IACUC的規(guī)定進(jìn)行操作。迷你滲透性泵(2001模型,Alzet公司,C upertino,CA；液體泵速率1μl/小時(shí))接入2cm的大腦注入管(腦注入盒,Alzet公司,Cupertino, CA)并在其中分別泵入模擬腦脊液aCSF(成分：124 mM NaCl,25 mM NaHCO3,10 mM D-glucose,2.5 mM KCl,1 mM MgC12,2 mM CaC12和1 mM NaH2PO4,并用NaOH調(diào)節(jié)pH到7.2-7.4)或者aCSF溶解10 mM谷氨酸。并依據(jù)使用說明在37度環(huán)境下通宵注射藥物。小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫組織化學(xué)和免疫熒光檢測成功構(gòu)建免疫熒光小鼠,以便于利用線粒體特征蛋白Tom20和VDA C1更好的觀察運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)線粒體的形態(tài)。簡要介紹過程如下：用蒸餾水沖洗3次組織切片放置于1x抗原decloaker(Biocare公司,Concord, CA)試劑中。在22psi氣壓下加熱至125度10秒,然后在0 psi氣壓下冷卻至90度30秒,利用Biocare公司的高壓鍋進(jìn)行抗原修復(fù)。隨后用10%的羊血清Decloaking Chamber對切片封閉30分鐘,并在1%羊血清的PBS中孵育一抗過夜。第二天(NGS, St. Louis, MO)PBS沖洗3次后用10%的羊血清孵育10分鐘,然后加入熒光顯影二抗公司,(Invitrogen室溫避光孵育2小時(shí),最后切片用PBS清洗,用Grand Island, NY)(1:300)染色,再次用PBS洗3次,加入熒光介質(zhì)油DAPI公司,(Southern Biotech小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的電鏡檢測Birmingham, AL)。EM固定液通過心臟灌注法(the quarter strength Karnovsky-1.25% DMSO mixture)輸入小鼠體內(nèi)5分鐘后迅速取出脊髓并放置于EM固定液中室溫15分鐘,更換新鮮EM固定液繼續(xù)固定2小時(shí)。PBS清洗后組織塊用室溫固定2小時(shí)。組織切片清洗后浸泡在酸化的0.5%1% osmium-1.25% ferrocyanide mixture溶液中.再次沖洗后組織塊在濃度依次上升的酒精中脫水,最后包uranylacetate裹在樹脂中Poly/Bed 812公司,(Polysciences較薄的切片隨后Warrington, PA).用2%酸化染色并用uranyl acetate電鏡觀Gatan single tilt,Gatan US4000 4kx4k CCD察公(Gatan司,體外鈣蛋白酶切割實(shí)驗(yàn)Pleasanton, CA)。100ug純化線粒體蛋白以及l(fā)ug重組Mfn2蛋白公司,(Origen e分別與人紅細(xì)胞純化Rockville, MD)公司,u-calpain(calpain-1) (Biovision蛋白在Milpitas, CA)30度孵育30分鐘。以提前與calpain-Ⅰ或者PMSF度孵育5分鐘為抑calpeptin30制組。最后添加含有62.5T和nM Tris-HCl,4% SDS,10% glycerol,50 mM DT.8)的SDS樣本液停止反應(yīng).樣本經(jīng)過100度10分鐘0.1% bromophenol blue (pH 6變性煮沸,加入1/6的反應(yīng)蛋白量進(jìn)行免疫印跡分析。結(jié)果：1.在神經(jīng)細(xì)胞中谷氨酸可導(dǎo)致線粒體破裂2.在神經(jīng)細(xì)胞中,Mfn2的缺失可導(dǎo)致線粒體和神經(jīng)細(xì)胞的毒性3.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：Mfn2過表達(dá)可以阻斷谷氨酸介導(dǎo)的線粒體功能障礙和神經(jīng)細(xì)胞死亡4.動物實(shí)驗(yàn)：Mfn2過表達(dá)可以保護(hù)線粒體和神經(jīng)細(xì)胞免于谷氨酸所引起的細(xì)胞毒性5.谷氨酸作用于神經(jīng)細(xì)胞后通過激活Calpain來實(shí)現(xiàn)對mfn2的剪切6.在人體標(biāo)本中驗(yàn)證了谷氨酸所介導(dǎo)的calpain的激活,mfn2的剪切,以及線粒體的破裂結(jié)論：谷氨酸介導(dǎo)calpain的激活剪切mfn2后,可引起線粒體功能障礙及運(yùn)動障礙,最終出現(xiàn)谷氨酸的神經(jīng)毒性并導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的死亡。通過阻斷mfn2的剪切可以在細(xì)胞模型及動物模型上阻斷谷氨酸所介導(dǎo)的神經(jīng)毒性。創(chuàng)新性及意義：谷氨酸的神經(jīng)毒性作用廣泛存在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中包括腦出血,卒中,腦腫瘤,中樞系統(tǒng)感染,并且與相關(guān)疾病的發(fā)生有密切的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)從體內(nèi)到體外,從細(xì)胞模型到動物模型再到人體模型均證實(shí)了谷氨酸所介導(dǎo)的mfn2剪切所導(dǎo)致的神經(jīng)毒性,意義重大,相關(guān)信號通路將可能成為未來幾年的研究熱
【關(guān)鍵詞】：谷氨酸 線粒體功能障礙 神經(jīng)毒性 mfn2蛋白 Calpain蛋白
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R741
【目錄】：

• 中文摘要8-13
• 英文摘要13-19
• 符號說明19-21
• 前言及綜述21-25
• 第一部分 谷氨酸神經(jīng)毒性對線粒體的影響25-33
• 引言25
• 材料及方法25-27
• 結(jié)果27-31
• 討論和小結(jié)31-32
• 結(jié)果小結(jié)32
• 結(jié)論小結(jié)32-33
• 第二部分 谷氨酸誘導(dǎo)神經(jīng)毒性與線粒體動力學(xué)蛋白的關(guān)系33-51
• 引言33
• 材料及方法33-40
• 結(jié)果40-49
• 討論和小結(jié)49-50
• 結(jié)果小結(jié)50
• 結(jié)論小結(jié)50-51
• 第三部分 調(diào)節(jié)線粒體動力學(xué)蛋白能否抑制谷氨酸所介導(dǎo)的神經(jīng)毒性?51-80
• 引言51
• 材料及方法51-58
• 結(jié)果58-77
• 討論和小結(jié)77-79
• 結(jié)果小結(jié)79
• 結(jié)論小結(jié)79-80
• 第四部分 谷氨酸介導(dǎo)神經(jīng)毒性的信號通路80-100
• 引言80
• 實(shí)驗(yàn)方法80-84
• 結(jié)果84-96
• 討論和小結(jié)96-97
• 結(jié)果小結(jié)97-98
• 結(jié)論小結(jié)98-100
• 第五部分 在人體標(biāo)本中驗(yàn)證谷氨酸介導(dǎo)神經(jīng)毒性在相關(guān)疾病中的信號通路100-112
• 引言100
• 材料與方法100
• 結(jié)果100-110
• 討論及小結(jié)110-111
• 結(jié)果小結(jié)111
• 結(jié)論小結(jié)111-112
• 討論總結(jié)112-115
• 參考文獻(xiàn)115-123
• 致謝123-124
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文目錄124-125
• 英文文章一125-160
• 英文文章二160-181
• 附表181

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 韓玉霞;魏欣冰;李霞;丁燕;辛華;丁華;;絞股藍(lán)總皂苷對谷氨酸所致大鼠海馬組織損傷的保護(hù)作用[J];山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2008年05期

2 孫蓉;張作平;黃偉;呂麗莉;尹建偉;;麝香酮對谷氨酸所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)及作用機(jī)制研究[J];中國中藥雜志;2009年13期

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本文編號：675437