本文關(guān)鍵詞：大鼠腦缺血—再灌注損傷時SGK1信號途徑在海馬神經(jīng)元保護的機制研究

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【摘要】：目的：本課題采用體內(nèi)與體外相結(jié)合的實驗設(shè)計,研究大鼠腦缺血-再灌注損傷時SGK1信號途徑在海馬神經(jīng)元保護中的病理生理作用,旨在闡明SGK1信號途徑在腦缺血-再灌注損傷時大鼠海馬神經(jīng)元保護中的作用機制。方法：采用1日齡SD大鼠的海馬神經(jīng)細胞,通過對海馬神經(jīng)細胞的培養(yǎng),以海馬神經(jīng)元特異性抗MAP2抗體免疫熒光反應(yīng)檢測海馬神經(jīng)元細胞培養(yǎng)的結(jié)果；對海馬神經(jīng)元細胞進行了2小時的氧糖剝奪實驗而建立氧糖剝奪海馬神經(jīng)細胞模型,以Annexin V FITC/PI流式細胞術(shù)檢測不同處理組大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡改變,應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測不同細胞分組中SGK1的的表達；以pLV-IRES-DsRed為載體,構(gòu)建SGK1過表達慢病毒載體,通過過表達SGK1慢病毒載體對不同細胞分組進行感染,提取總RNA,然后再進行逆轉(zhuǎn)錄,以熒光定量PCR技術(shù)檢測SGK1慢病毒載體在不同細胞組中RNA表達的消長變化；通過提取不同細胞組中的總蛋白,并通過Western blot技術(shù)檢測SGK1蛋白的表達,為了進一步檢測SGK1在蛋白水平的過表達調(diào)控細胞凋亡的模式,我們采用PI3K抑制劑LY294002對細胞進行干預(yù),并用流式細胞儀檢測細胞凋亡的數(shù)據(jù)變化。為揭示體內(nèi)SGK1表達對神經(jīng)細胞是否存在保護作用,我們構(gòu)建了SD大鼠腦缺血-再灌注損傷模型,并于建模前的兩周進行SGK1慢性病毒過表達質(zhì)粒的注射,建模前15分鐘時進行PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理,此后,分別觀察神經(jīng)元凋亡SGK1及其他相關(guān)基因的蛋白表達變化；基于組織免疫熒光技術(shù)檢測了腦缺血-再灌注(I/R)對整個大鼠腦部的損傷的范圍和程度進行了分析和評估。結(jié)果：對體外培養(yǎng)的神經(jīng)細胞進行120分鐘的氧糖剝奪,構(gòu)建氧糖剝奪神經(jīng)細胞模型,和正常組相比,細胞凋亡數(shù)量存在顯著差異(P0.01)；在對氧糖剝奪神經(jīng)細胞進行10分鐘、30分鐘和60分鐘的缺血后恢復(fù)發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細胞凋亡數(shù)量呈現(xiàn)逐漸增加趨勢,且每組均和正常者存在顯著差異(P0.01),而SGK1的表達量則是逐漸下降,和正常組之間均有顯著差異(P0.01),提示SGK1可能對氧糖剝奪再恢復(fù)造成的神經(jīng)細胞損傷有一定的抗損傷作用；通過構(gòu)建SGK1過表達質(zhì)粒,并對細胞進行處理,我們發(fā)現(xiàn),和空載體組相比,在120分鐘氧糖剝奪組和60分鐘氧糖恢復(fù)組,SGK1過表達組細胞凋亡數(shù)量相對空載體組明顯減少,與空載體組之間具有顯著差異(P0.01),提示SGK1的表達對氧糖剝奪再供應(yīng)組具有保護作用；通過PI3K抑制劑LY294002對氧糖剝奪120分鐘后進行60分鐘的恢復(fù)供應(yīng)組進行SGK1過表達組進行LY294002預(yù)處理,與正常組相比,經(jīng)LY294002處理的SGK1過表達組細胞凋亡數(shù)量和未處理組之間具有顯著差異(P0.01),證明SGK1的表達在一定程度上系通過PI3K/Akt/GSK3 β信號通路介導(dǎo)的。我們通過大腦中動脈線栓法構(gòu)建了SD大鼠腦缺血再灌注模型,并重復(fù)了上述實驗,我們在構(gòu)建的動物模型中重復(fù)得到了和細胞實驗相一致的結(jié)果。我們細胞實驗和動物模型實驗均證實了：隨著神經(jīng)細胞氧糖供應(yīng)不足,神經(jīng)細胞會出現(xiàn)凋亡的趨勢,而SGK1的表達則呈現(xiàn)下降趨勢；通過構(gòu)建的SGK1過表達質(zhì)粒對實驗組進行處理發(fā)現(xiàn),SGK1的過表達可以顯著的減少神經(jīng)細胞凋亡的數(shù)量,提示SGK1的表達可以對神經(jīng)細胞因氧糖供應(yīng)不足導(dǎo)致的細胞凋亡起到一定的抗凋亡作用；而通過對氧糖剝奪的SD大鼠海馬神經(jīng)元細胞模型及腦缺血SD大鼠模型進行的PI3K抑制劑LY294002處理發(fā)現(xiàn),SGK1蛋白的過表達受到抑制,而因SGK1過表達受到抑制的相關(guān)蛋白的表達也得以逆轉(zhuǎn),提示SGK1調(diào)控神經(jīng)元細胞凋亡的信號途徑且與PI3K/Akt/GSK3 β通路有關(guān)。結(jié)論：①SGK1的表達可以有效的減少氧糖剝奪SD大鼠海馬神經(jīng)元細胞及腦缺血-再灌注大鼠導(dǎo)致的神經(jīng)元細胞的凋亡；②缺血-再灌注損傷時SGK1信號途徑在大鼠海馬神經(jīng)元的保護中具有重要作用；③SGK1調(diào)控神經(jīng)元細胞凋亡的分子機制與PI3K/Akt/GSK3β信號通路的激活有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：海馬 氧糖剝奪 腦缺血-再灌注 SGK1 信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 凋亡 大鼠
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R743.3
【目錄】：

• 英文縮寫詞表7-9
• 中文摘要9-11
• ABSTRACT11-12
• 序言12-17
• 第一章 體外實驗部分SGK1在缺血大鼠海馬神經(jīng)元保護中的作用機制17-69
• 第一節(jié) 前言17-19
• 第二節(jié) 實驗材料與方法19-43
• 一. 實驗材料19-43
• (一) 主要儀器19-20
• (二) 主要試劑及其配方20-25
• (三) 實驗方法25-42
• (四）統(tǒng)什學(xué)分析42-43
• 第三節(jié) 結(jié)果43-57
• 一. SD大鼠海馬神經(jīng)元細胞的培養(yǎng)及鑒定結(jié)果43-45
• 二. 氧糖剝奪誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡及SGK1表達情況45-47
• 三. SGK1基因蛋白水平的過表達對氧糖剝奪的SD大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡的影響47-53
• 四. SGK1通過PI3K/Akt/GSK3β通路介導(dǎo)細胞的抗凋亡作用53-57
• 第四節(jié) 討論57-60
• 第五節(jié) 本章小結(jié)60-61
• 第六節(jié) 參考文獻61-69
• 第二章 體內(nèi)實驗部分SGK1在大鼠腦缺血-再灌注損傷中的細胞保護作用69-98
• 第一節(jié) 前言69-72
• 第二節(jié) 實驗材料與方法72-82
• 一. 實驗材料72-82
• (一) 主要儀器72
• (二) 主要試劑及其配方72-76
• (三) 主要實驗方法76-81
• (四) 統(tǒng)計學(xué)分析81-82
• 第三節(jié) 結(jié)果82-88
• 一. 大鼠腦缺血-再灌注模型制備及動物的分組82
• 二. 腦缺血-再灌注對細胞凋亡和SGK1表達水平的影響82-84
• 三. 腦缺血-再灌注時SGK1及PI3K信號途徑對細胞保護的影響84-88
• 第四節(jié) 討論88-92
• 第五節(jié) 本章小結(jié)92-93
• 第六節(jié) 參考文獻93-98
• 第三章 小結(jié)與展望98-99
• 綜述99-110
• 參考文獻104-110
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的論文及所獲獎勵110-125
• 致謝125-126

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

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本文編號：671394