本文關鍵詞：缺氧對人牙周膜成纖維細胞免疫應答的影響及機制研究

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【摘要】：牙周炎是一類嚴重危害人類口腔健康的慢性感染性疾病,在全球有著極高的發(fā)病率,是導致成人牙齒松動直至缺失的首要原因,而近年來的研究表明缺氧環(huán)境能加重牙周炎病變過程,影響牙周組織的防御與修復。盡管當前缺氧對牙周炎作用的研究取得一定進展,但具體機制尚不明確。牙周炎的生物學基礎是牙周組織介導的骨形成和骨吸收失衡,伴隨著牙周組織的的直接破壞和免疫損傷,最終導致牙槽骨的喪失。目前研究認為,除了病原體的直接損傷外,牙周炎的病理損傷主要由病原體誘導牙周組織細胞分泌趨化因子、粘附分子、炎癥因子,異常增高的炎性介質介導免疫細胞黏附移行聚集到炎癥部位,并誘導破骨細胞(Osteoclasts,OC)前體細胞如外周血單個核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMCs)向OC分化,從而造成牙周組織的破壞、降解和吸收。人牙周膜作為牙周組織的一個重要組成成分,主要由人牙周膜成纖維細胞(Human Periodontal Ligament Fibroblasts,h PDLF)所組成。hPDLF不僅參與了牙周組織的改建和再生,同時還具有一定的免疫調節(jié)能力,能與免疫細胞、內皮細胞等相互作用。因此,h PDLF的生物學活性與牙周炎的發(fā)生發(fā)展密切相關。但是,目前關于h PDLF在牙周炎病程中的調節(jié)作用,以及缺氧能否通過影響h PDLF的多種生物學特性,進而加重牙周炎疾病過程仍然很不清楚。在本研究中,我們首先觀察h PDLF對不同細菌LPS產(chǎn)生的免疫應答,從而明確其在牙周組織免疫調節(jié)中的作用;其次我們觀察在常氧和缺氧環(huán)境下,h PDLF內毒素耐受(Endotoxin Tolerance,ET)能力的變化,通過上述結果我們期望證實,在牙周炎早期,缺氧通過破壞hPDLF的ET,促進炎癥因子分泌,從而加重免疫損傷;然后,我們將h PDLF與PBMCs進行共培養(yǎng),觀察在缺氧和常氧條件下,二者相互作用對炎癥因子分泌的影響,從而說明缺氧可以通過增強h PDLF與PBMCs的協(xié)同作用,進一步增強炎癥因子的分泌;最后,我們觀察兩種細胞在共培養(yǎng)條件下,缺氧能否影響hPDLF向成骨分化的能力,以及PBMCs向破骨分化的能力,并對缺氧調節(jié)細胞分化的機制進行初步探討,以期證明,牙周炎發(fā)生時在h PDLF與PBMCs相互作用過程中,缺氧能通過影響兩種細胞分化的能力,加重缺氧環(huán)境下牙周炎的病理損傷。在本研究中,主要分三個部分:第一,我們構建本課題所需要的實驗平臺,包括體外分離培養(yǎng)hpdlf和pbmcs及其鑒定;第二,我們在體外常氧和缺氧環(huán)境下分別構建hpdlf的et模型,對其分泌的細胞因子和表達的tlrs進行檢測;第三,構建hpdlf和pbmcs共培養(yǎng)體系,觀察缺氧環(huán)境是否影響二者炎癥因子的分泌。同時,對兩種細胞分化能力進行檢測,并通過正反向實驗初步探討其分化能力改變的分子機制。我們希望通過我們的研究,更好地認識缺氧在促進牙周炎病理損傷中的作用。一、hpdlf和pbmcs的分離培養(yǎng)及鑒定1.hpdlf的分離培養(yǎng)及鑒定:沿冠根單向刮下根中1/3的牙周膜組織,0.1%i型膠原酶消化后進行組織塊培養(yǎng);細胞約10-14d可見大量透明纖維條索樣細胞從組織塊中爬出,細胞呈長梭形,免疫組化鑒定結果:小鼠抗人vimentin陽性,小鼠抗人cytokeratin陰性,表明hpdlf的間葉源性,而非上皮來源,結合取材部位、細胞形態(tài)學特征和組織來源可以證明我們分離培養(yǎng)的細胞即為hpdlf。2.pbmcs的分離培養(yǎng)及鑒定:采用ficoll-hypaque梯度密度離心法分離外周血細胞,經(jīng)低速離心后細胞分4層,其中第2層為環(huán)狀乳白色單個核細胞,即為pbmcs,giemsa染色對pbmcs分離純度進行檢測。二、缺氧條件下,hpdlf的et能力降低1.常氧條件下,hpdlf的et模型構建:分兩次加入pglps或者eclps刺激hpdlf,其中初次加入兩種細菌lps的劑量范圍從0ng/ml-1000ng/ml,而再次加入兩種lps的劑量為1000ng/ml。對細胞培養(yǎng)上清炎癥因子濃度檢測發(fā)現(xiàn):第一,兩種細菌lps初次刺激可以誘導6種炎癥因子(il-8、il-6、il-1β、tnf-α、il-10以及il-12p70)表達上調,其中以il-8和il-6水平增加最為顯著;第二,兩種細菌lps再次刺激后,il-8和il-6濃度顯著下降,提示兩種lps均可以誘導hpdlf產(chǎn)生et。同時,我們對hpdlf在接受lps刺激后,其tlr2和tlr4在mrna和蛋白水平的表達進行了檢測,發(fā)現(xiàn)hpdlf產(chǎn)生et后,tlr2和tlr4表達均下調,這說明兩種lps再次刺激時可以通過hpdlf表達的tlr2和tlr4下調,誘導細胞產(chǎn)生et。2.缺氧條件下,hpdlfet能力的變化:利用常氧條件下建立的hpdlfet平臺,我們對缺氧條件下,兩種細菌lps誘導hpdlf炎癥因子的分泌進行了檢測。結果發(fā)現(xiàn),與常氧條件不同的是,雖然缺氧條件下,兩種lps初次刺激均可以誘導il-6和il-8濃度上調,但是再次刺激后,細胞并未出現(xiàn)et現(xiàn)象。同時,對再次刺激時hpdlf表達的tlr2和tlr4進行檢測后發(fā)現(xiàn),與初次刺激相比,兩種lps再次刺激后,兩種tlr表達量并沒有變化。這說明缺氧可以破壞hpdlf的et,保持細胞對外界病原刺激物的持續(xù)反應性,從而維持炎癥因子的高水平分泌。三、缺氧條件下,hpdlf與pbmcs共培養(yǎng)時炎癥因子分泌,以及分化能力檢測1.共培養(yǎng)時,細胞培養(yǎng)上清炎癥因子濃度檢測:hpdlf與pbmcs共培養(yǎng)24h后,收集上清進行炎癥因子檢測。結果發(fā)現(xiàn),在常氧和缺氧共培養(yǎng)條件下,除了il-12p70沒有檢測到分泌外,其它5種炎癥因子(il-8、il-6、il-1β、tnf-α以及il-10)濃度均明顯上升。其中il-8、il-6以及il-12p70常氧和缺氧條件下表達基本一致,tnf-α表達缺氧強于常氧,而il-1β和il-10表達常氧高于缺氧,這說明氧濃度能夠對兩種細胞分泌炎癥因子的種類和濃度進行調節(jié)。與pbmcs單獨培養(yǎng)相比,在缺氧和常氧培養(yǎng)條件下,tnf-α無論是兩種細胞間接共培養(yǎng)或直接共培養(yǎng),其炎癥因子分泌均呈下降趨勢,其中缺氧條件下降低更為顯著,其它細胞因子的變化則沒有統(tǒng)計學差異。缺氧共培養(yǎng)是否依賴其它種類的炎性介質增強免疫損傷,尚需進一步研究證實。2.兩種細胞共培養(yǎng)條件下,hpdlf向ob分化以及pbmcs向oc分化能力檢測:通過alp和trap染色,分別觀察hpdlf與pbmcs共培養(yǎng)條件下,兩種細胞分化能力的變化。結果發(fā)現(xiàn),缺氧、共培養(yǎng)時hpdlf向ob分化的能力減弱,而pbmcs向oc分化能力增強,單一培養(yǎng)的pbmcs沒有形成典型的oc,這說明oc的形成需要兩種細胞的相互作用,牙周炎發(fā)生時在pbmcs與hpdlf相互作用過程中,缺氧可以通過抑制hpdlf向ob分化,促進pbmcs向oc分化,從而增強牙周組織病理損傷。3.缺氧影響兩種細胞分化的機制探討:我們首先檢測了hpdlf中轉錄因子hif-1α和nf-κb的表達,發(fā)現(xiàn)在缺氧3h時hpdlf中hif-1α蛋白表達上調,進一步通過抑制或增強hif-1α的表達,我們初步探討了hif-1α在調節(jié)兩種細胞分化中的作用。結果發(fā)現(xiàn),yc-1抑制hif-1α表達后,hpdlf向ob分化受到抑制,而pbmc向oc分化能力增強,而在hpdlf中過表達hif-α則促進其向ob分化。這說明缺氧時hif-1α的表達起保護性作用,缺氧在調節(jié)hpdlf與pbmcs分化過程中,并不是以hif-1α依賴的方式促進破骨分化,缺氧促進破骨分化加重牙周組織損傷的調節(jié)機制還需進一步深入的研究。本研究成功分離培養(yǎng)hpdlf和pbmcs,并對二者進行了鑒定;我們發(fā)現(xiàn)lps能夠調節(jié)hpdlf中tlr2和tlr4的表達,誘導自身et的產(chǎn)生,而缺氧則可以破壞et。這提示在缺氧影響牙周炎病變的過程中,外源性病原刺激物可能直接作用于et減弱或缺失的hpdlf,從而增強炎癥因子分泌,加重牙周組織免疫損傷。隨后我們對hpdlf與PBMCs在缺氧條件下的相互作用進行了探討,發(fā)現(xiàn)hPDLF向OB分化能力減弱,而PBMCs向OC分化能力增強。進一步研究發(fā)現(xiàn),缺氧時雖然h PDLF的HIF-1α表達上調,但并不參與這一調控過程。本研究首次證實了LPS能誘導hPDLF產(chǎn)生ET,并在一定程度上揭示了缺氧增強牙周炎損傷的機制,并進一步認識hPDLF的生物學特性,同時為各種病理刺激下,干預牙周炎疾病的進展提供了新的理論基礎。
【關鍵詞】：人牙周膜成纖維細胞 外周血單個核細胞 內毒素耐受 缺氧
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R781.4
【目錄】：

• 縮略語表4-7
• 英文摘要7-12
• 中文摘要12-16
• 第一章 前言16-19
• 第二章 細胞的原代分離培養(yǎng)及鑒定19-32
• 2.1 材料和方法19-26
• 2.2 結果26-28
• 2.3 討論28-32
• 第三章 缺氧對h PDLF的免疫學特性的影響及機制初探32-53
• 3.1 材料和方法32-43
• 3.2 結果43-47
• 3.3 討論47-53
• 第四章 缺氧對h PDLF與PBMCs相互作用的影響及機制初探53-79
• 4.1 材料和方法53-69
• 4.2 結果69-74
• 4.3 討論74-79
• 全文結論79-81
• 參考文獻81-88
• 文獻綜述TLRs信號通路在牙周組織中的作用88-115
• 參考文獻102-115
• 研究生期間發(fā)表文章115-116
• 致謝116

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