發(fā)布時間：2017-08-13 13:06

  本文關(guān)鍵詞：急性脊髓損傷的生物信息學分析及相關(guān)基因HIF-1α的表達分析

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【摘要】：研究背景：脊髓損傷(SCI)一般情況下定義為脊椎脊髓受到傷害而造成其主要功能包括運動,感覺,自主神經(jīng)和反射等功能的完全或者部分的喪失,是臨床上一種常見的嚴重的致殘性損傷,給家庭和社會帶來沉重的負擔。脊髓損傷的病理生理過程的研究對促進其綜合性藥物干預措施的研究至關(guān)重要。繼發(fā)于脊髓原發(fā)損傷的繼發(fā)性損傷所產(chǎn)生的損害遠遠超過了原發(fā)性損傷,是發(fā)生于細胞和分子水平的一個主動調(diào)節(jié)過程,是可以受調(diào)控因素影響的,所以這個過程具有可逆性且可被控制。目前對于SC1的研究主要集中在脊髓損傷后基因表達的變化方面�；蛐酒�(gene chip)又可以稱之為DNA微陣列(DNA microarray),這項技術(shù)是伴隨著人類基因組計劃而產(chǎn)生的,他是目前生命科學領(lǐng)域當中的前沿性生物技術(shù)之一�；蛐酒@著的特點是它所具有的高通量、高集成、多樣化、微型化以及自動化等相關(guān)特性。經(jīng)過最近特別是近十幾年的發(fā)展,基因芯片已經(jīng)在相關(guān)的研究中的基因表達分析、疾病的基因診斷、藥物的基因組學等諸多領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用,并且在未來的相關(guān)生物研究中中具有巨大的研究和應用前景。集合了多種mRNA表達譜的基因芯片可以篩選大鼠脊髓損傷后脊髓內(nèi)的差異表達基因。通過篩選出的相關(guān)基因可以很方便、快速地了解和認識疾病的發(fā)生和發(fā)展過程,為疾病診斷的確定和提供恰當?shù)闹委煼桨柑峁┯辛ι镝t(yī)學技術(shù)的保證�，F(xiàn)在脊髓損傷的動物模型有多種,例如球囊壓迫,擠壓,鉗夾,側(cè)切,全切,脊椎橫斷,挫傷和去除一部份脊髓組織。為更好的模擬脊髓損傷的原發(fā)和繼發(fā)的損傷過程,我們采用大鼠鉗夾實驗模型,應用血管夾(vascular clip)損傷脊髓組織,對脊髓組織進行擠壓但是保持硬脊膜的完整性。所建立的動物模型具有簡單、廉價并且高度可重復性。缺血(ischemia)越來越多的被認為是急性脊髓損傷的病理生理變化的一個焦點,它可能是引起和加重急性脊髓損傷繼發(fā)性損傷的重要原因。低氧誘導因子是迄今發(fā)現(xiàn)的組織細胞在低氧狀態(tài)下誘生的最直接或唯一的調(diào)控因子,是調(diào)節(jié)低氧狀態(tài)下細胞分化和存活的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子。在相關(guān)的脊髓損傷的生物信息學分析中我們發(fā)現(xiàn)HIF-1可能是脊髓損傷中的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子。我們通過自己建立的改良大鼠脊髓損傷動物模型,應用RT-PCR,Western blot,原位雜交,ELISA等檢測方法,檢測損傷后不同時間點HIF-1及其靶基因VEG、EPO的表達并分析它們與脊髓損傷的相關(guān)性和相互之間的相關(guān)性。同時,結(jié)合臨床檢測脊髓損傷患者外周血中的VEG、EPO的表達情況,與動物實驗結(jié)果對比研究,探討HIF-1及其靶基因VEG, EPO在繼發(fā)性脊髓損傷發(fā)生發(fā)展過程中作用,從而為臨床治療脊髓損傷提供理論依據(jù)。目的：1.本實驗的目的為使用集合了多種mRNA表達譜的基因芯片來篩選大鼠脊髓損傷后脊髓內(nèi)的差異表達基因,及脊髓損傷后差異表達的上調(diào)基因和下調(diào)基因。2.建立一種改良大鼠脊髓損傷模型,并評價其可重復性及可操作性；3.探究低氧誘導因子及其靶基因在脊髓損傷后的缺氧耐受及血管新生相關(guān)的病理生理過程中的表達。方法：1.1選擇NCBI基因表達數(shù)據(jù)庫的基因芯片數(shù)據(jù)(Gene Expression Omnibus,GEO,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).選取GSE2270基因芯片表達數(shù)據(jù)。1.2使用R語言的limma數(shù)據(jù)包,通過與相應的對照組對比,確定脊髓損傷后的差異表達基因(DEGs)。1.3采用Cytoscape軟件及其插件對DEGs進行GO富集分析。1.4 使用DAVID(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, http://www.david.niaid.nih.gov)網(wǎng)絡工具,通過超幾何分布法,對差異表達基因(DEGs)進行通路功能富集分析,計算在通路中的P值。所得數(shù)據(jù)與KEGG通路數(shù)據(jù)庫進行匹配。1.5使用DiRE數(shù)據(jù)庫分析富集在細胞通路上的DEGs,尋找每一個細胞通路上的調(diào)控元件。2.采用鉗夾法建立大鼠急性脊髓損傷實驗模型。采用神經(jīng)行為學評價BBB評分體系評價模型的神經(jīng)功能,采用HE染色和尼氏染色評價脊髓損傷脊髓的病理變化。3.1通過RT-PCR方法檢測脊髓損傷后不同時相HIF-1α mRNA的變化。3.2原位雜交及免疫組化方法分析脊髓損傷后不同時相脊髓組織內(nèi)HIF-1α mRNA和蛋白的表達情況。3.3采用Western blot及TU N EL染色方法分析不同時相AI F和Caspase-3蛋白的表達水平,觀察脊髓內(nèi)神經(jīng)細胞凋亡情況。3.4采用ELISA方法檢測臨床脊髓損傷患者外周血內(nèi)VEGF EPO的表達情況。結(jié)果：1.通過生物信息學分析,共確定了173個差異表達基因(DEGs),其中130個上調(diào)基因,43個下調(diào)基因。這些DEGs富集于不同的GO,如損傷應答、炎癥應答和免疫應答等。通過DEGs的通路富集分析,8條通路被顯著富集,如細胞外基質(zhì)(ECM)受體相互作用通路,Toll樣受體(TLR)信號通路等。在每一條通路中,都有顯著的調(diào)控元件和調(diào)控因子,其中缺氧誘導因子、同源框蛋白BEL1是兩個含量最高的調(diào)控因子,RAC2是處于焦點位置的調(diào)控因子。通過分析確定了幾個關(guān)鍵基因,HIF1, BAC2, CD44, 和ARPC1B,它們都通過不同的通路參與SCI疾病的進展。2.鉗夾大鼠急性脊髓損傷實驗模型的建立,實驗組的BBB評分同對照組相比,各組間差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。對照組HE和尼氏染色基本正常,實驗組顯示隨著缺血時間延長,脊髓病理學變化逐漸加重,脊髓灰質(zhì)前角神經(jīng)元更明顯,主要表現(xiàn)為神經(jīng)元尼氏體淡染或消失。3.1 RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),正常的脊髓中HIF-1α保持在較低水平；脊髓損傷后6-72小時,HIF-1α的表達明增加；1周后,其表達開始下降。HIF-1α mRNA的表達是與脊髓損傷后缺血程度相互平行,尤其是在傷后2-3天HIF-1α的表達達到峰值。3.2損傷脊髓組織原位雜交顯示：幾乎所有的損傷區(qū)域神經(jīng)元細胞都表達HIF-α mRNA的,而在正常的脊髓表達非常弱。3.3免疫組化顯示損傷脊髓內(nèi)HIF。1α蛋白的表達明顯增加,其趨勢和HIF-1α mRNA的表達基本一致,但是蛋白的表達要比mRNA的表達要早。VEGF、EPO在正常脊髓組織中表達呈現(xiàn)一個低水平,在脊髓損傷的大鼠模型中損傷后的24小時表達開始增加,48-72小時中達到峰值并且逐漸下降。3.4應用Western blots印跡技術(shù)檢測對照組和實驗組大鼠的脊髓的AIF和caspase-3蛋白的表達水平。傷后6小時組AIF、caspase-3蛋白的表達顯著增加,3 d時達高峰,7 d凋亡相關(guān)基因表達逐日減少。TUNEL染色檢測各組脊髓神經(jīng)細胞凋亡情況。對照組手術(shù)組中只觀察到少數(shù)TUNEL陽性細胞。然而,在損傷后6小時組、12小時、24小時組觀察到具有高熒光信號的較多TUNEL陽性細胞,3d時凋亡細胞量最多,7d開始減少。3.5脊髓損傷患者外周血ELISA法檢測HIF-1α調(diào)控下游基因VEGF、EPO在外周血的表達明顯的升高,與正常人外周血比較差異有明顯的統(tǒng)計學意義。結(jié)論：1.經(jīng)基因本體及其富集的通路研究發(fā)現(xiàn),SCI主要與炎癥和免疫有關(guān)。CD44可能是脊髓損傷進展過程中免疫應答的刺激因子。在脊髓損傷發(fā)病機制中RAC2與HIF1有明顯的相互作用,并起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。ARPC1B在調(diào)節(jié)細胞骨架和活性中起基礎(chǔ)性作用。2.經(jīng)過我們改良的脊髓損傷模型可以模擬不同程度的脊髓損傷,并且可靠、簡單具有高度重復性,病理改變穩(wěn)定。3.研究表明在脊髓損傷后,HIF-1a通過增加蛋白的穩(wěn)定性和上調(diào)轉(zhuǎn)錄活性,其蛋白表達增加。隨著HIF-1a表達的上調(diào)其相應的靶基因EPO和VEGF也隨之表達增加。結(jié)合病理過程發(fā)現(xiàn)HIF-1a表達上調(diào)可能參與了脊髓損傷后的低氧耐受、細胞凋亡和血管微環(huán)境的重建。4.我們的研究證實在急性損傷后脊髓細胞可能通過細胞凋亡造成脊髓組織的損害,這可能和臨床上相關(guān)的神經(jīng)癥狀后遺癥相關(guān)。但是脊髓組織可以通過自身的的HIF-1 Q及其靶基因等的時序性表達以幫助脊髓組織度過這種損傷的環(huán)境。
【關(guān)鍵詞】：脊髓損傷 生物信息學分析 低氧誘導因子 動物模型 表達方式
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R651.2
【目錄】：

• 中文摘要8-12
• 英文摘要12-17
• 符號說明17-18
• 第一部分 大鼠急性脊髓損傷中的表達譜及生物信息學分析18-30
• 前言18-19
• 1.1 實驗目的19-20
• 1.2 材料與方法20-21
• 1.3 結(jié)果21-22
• 1.4 討論22-26
• 1.5 結(jié)論26-27
• 1.6 附圖表27-30
• 第二部分 改良大鼠急性脊髓損傷模型的再評價及應用研究30-42
• 前言30
• 2.1 資料和方法30-34
• 2.2 結(jié)果34-35
• 2.3 討論35-39
• 2.4 附圖表39-42
• 第三部分 HIF-1α及其相關(guān)基因在大鼠急性脊髓損傷和臨床SCI患者外周血中的實驗研究42-66
• 3.1 資料與方法43-54
• 3.2 結(jié)果54-56
• 3.3 討論56-61
• 3.4 結(jié)論61-62
• 3.5 附圖表62-66
• 參考文獻66-76
• 致謝76-77
• 攻讀博士期間發(fā)表的論文77-78
• 外文論文Ⅰ78-92
• 外文論文Ⅱ92-106
• 論文評閱及答辨情況表106

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 盧e，

本文編號：667414