本文關(guān)鍵詞：IRG1促進(jìn)膠質(zhì)瘤增殖的作用機(jī)制及臨床意義

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【摘要】：研究背景：膠質(zhì)瘤(glioma)是發(fā)生于神經(jīng)外胚層的腫瘤,故亦稱神經(jīng)外胚層腫瘤或神經(jīng)上皮腫瘤,其發(fā)病率占顱腦腫瘤的40-50%。大多數(shù)膠質(zhì)瘤起源于不同類型的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,但由于組織發(fā)生來源及生物學(xué)特征類似,一般都稱為神經(jīng)膠質(zhì)瘤。膠質(zhì)瘤的分類方法很多,各型膠質(zhì)瘤中,以星形細(xì)胞瘤最多,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、室管膜瘤次之[1]。各型膠質(zhì)瘤的好發(fā)部位不同,如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤幾乎均發(fā)生于大腦半球,髓母細(xì)胞瘤發(fā)生于小腦蚓部,室管膜瘤多見于第4腦室,少突膠質(zhì)瘤大多發(fā)生于大腦半球,星形細(xì)胞瘤在成人中多見于大腦半球,而兒童中則多發(fā)生于小腦。膠質(zhì)瘤以男性較多見,特別在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤,男性明顯多于女性。各型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤多見于中年人,室管膜瘤多見于兒童及青年,髓母細(xì)胞瘤幾乎都發(fā)生在兒童。膠質(zhì)瘤的部位與年齡也有一定關(guān)系,如大腦星形細(xì)胞瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤多見于成人,小腦膠質(zhì)瘤(星形細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、室管膜瘤)多見于兒童[2]。膠質(zhì)瘤大多緩慢發(fā)病,自出現(xiàn)癥狀至就診時(shí)間一般為數(shù)周至數(shù)月,少數(shù)可達(dá)數(shù)年。惡性程度高腫瘤患者病史較短,良性腫瘤患者病史較長。腫瘤若有出血或囊變,癥狀會(huì)突然加重,甚至有類似腦血管病的發(fā)病過程。膠質(zhì)瘤的臨床癥狀可分兩方面,一方面是顱內(nèi)壓增高癥狀,如：頭痛、嘔吐、視力減退、復(fù)視、精神癥狀等；另一方面是腫瘤壓迫、浸潤、破壞腦組織所產(chǎn)生的局灶癥狀,早期可表現(xiàn)為刺激癥狀,如局限性癲癇,后期表現(xiàn)為神經(jīng)功能缺失癥狀,如癱瘓。炎癥反應(yīng)(inflammatory reaction)指生物組織受到外傷、出血或病原感染等刺激,激發(fā)的生理反應(yīng)。其中,包括紅腫、發(fā)熱、疼痛等癥狀。炎性反應(yīng)是先天免疫系統(tǒng)為移除有害刺激或病源體及促進(jìn)修復(fù)的保護(hù)措施,并非如后天免疫系統(tǒng)般針對特定病源體[3]。炎癥反應(yīng)并非等同于感染,即使很多時(shí)候炎癥的發(fā)生是因感染而引起,但通常情況下,炎癥是生物體對病源體之反應(yīng)之一,是有益的,是人體的自主防御反應(yīng)；然而,有時(shí)候炎癥可以引起人體自身免疫系統(tǒng)的過敏,進(jìn)而攻擊自身的組織及細(xì)胞。炎癥反應(yīng)是機(jī)體用于對抗感染、組織損傷等有害刺激的一種重要防御機(jī)制,但是在很多情況下過度的炎癥本身就會(huì)對機(jī)體造成損害。炎癥反應(yīng)的發(fā)生刺激中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞吞噬病原菌以及壞死崩解的細(xì)胞碎屑,同時(shí)巨噬細(xì)胞(macrophage)在機(jī)體的非特異免疫功能中發(fā)揮著重要的作用。有研究表明在腫瘤發(fā)生初期,來自健康組織的巨噬細(xì)胞活化后可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長,但是在腫瘤惡化階段,來自瘤體內(nèi)部的巨噬細(xì)胞卻促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長。巨噬細(xì)胞在腫瘤發(fā)生的不同階段扮演著不同的角色。研究發(fā)現(xiàn),腫瘤組織中巨噬細(xì)胞的高度浸潤與腫瘤患者的預(yù)后相關(guān)。有研究表明,化療或者放療成功抑制瘤體生長3個(gè)月后,患者的瘤體局部有活動(dòng)性炎癥出現(xiàn),浸潤細(xì)胞有活化的巨噬細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞、CD3+和CD8+的淋巴細(xì)胞,并繼發(fā)脫髓鞘的改變[4]�？梢娋奘杉�(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在膠質(zhì)瘤的治療中具有重要地位。方法：第一章第一節(jié)對不同種類的膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),QPCR以及Western blot驗(yàn)證IRG1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞中的表達(dá)差異。干擾IRG1觀察其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及遷移的影響。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),通過Western blot檢測細(xì)胞周期蛋白、EMT相關(guān)蛋白及NF-K B相關(guān)通路的蛋白表達(dá)水平,篩查IRG1通過何種機(jī)制促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。第一章第二節(jié)體內(nèi)實(shí)驗(yàn),通過對裸鼠皮下注射sh-IRG1以及慢病毒攜帶IRG1的膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251及SHG-44,以注射空白載體作為對照,觀察注射膠質(zhì)瘤細(xì)胞40天后腫瘤的生長情況。在體觀察IRG1表達(dá)受抑制后對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力的影響。第二章臨床資料統(tǒng)計(jì)分析IRG1表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者病程進(jìn)展及預(yù)后的關(guān)系。取人腦膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織做對比,通過Western blot比較IRG1的表達(dá)水平,觀察IRG1表達(dá)水平的高低與患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：第一章第一節(jié)圖1顯示IRG1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中起著重要的作用。在多株神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株A172、U87、SHG-4、17-105、H4、U118MG和u-373MG中,我們通過RT-PCR和免疫印跡檢測IRG1的mRNA水平和蛋白水平。圖1所見在U251、SHG-44、TJ-105和H4神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中IRG1 mRNA及蛋白質(zhì)水平明顯高于A251、U118MG和u-373細(xì)胞株。更重要的是通過和瘤旁組織組織對比,發(fā)現(xiàn)IRG1的蛋白高表達(dá)于膠質(zhì)瘤組織(圖1D)。選用siRNA技術(shù),特異性敲低IRG1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá),同時(shí)采用si-IRG1-1及si-IRG1-2對IRG1的表達(dá)進(jìn)行敲低,結(jié)果顯示si-IRG1-2敲低效果比si-IRG1-1更佳(圖3a-b及圖4),因此,選用si-IRG1-2作為IRGl敲低的工具進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過si-IRG1-1以及si-IRG1-2對U251以及SHG-44細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,后續(xù)MTT結(jié)果提示(圖5)敲低IRG1表達(dá)可以抑制43%的SHG-44細(xì)胞的增殖(P0.01),然而過表達(dá)IRGl可以促進(jìn)54%的SHG-44細(xì)胞的增殖(P0.01)。EUD實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖6)顯示過表達(dá)IRG1可以使得U251以及SHG-44細(xì)胞的增殖百分比從23%及25%增加至64%及62%,而通過si-IRG1-2敲低IRG1可以使U251和SHG-44細(xì)胞的增殖百分率由23%及25%下降至6%及9%。隨后,我們檢測了轉(zhuǎn)染si-IRG1-2膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期分布。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示轉(zhuǎn)染了si-IRG1-2的U251和SHG-44細(xì)胞與轉(zhuǎn)染si-NC的對照組細(xì)胞相比,膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期分布變化為以G1期為主,少部分分布在S期,P0.01(圖7)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示si-IRG1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制部分是因?yàn)镚1期阻滯�？寺⌒纬蓪�(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染了si-IRG1的U251及SHG-44細(xì)胞與轉(zhuǎn)染si-NC的對照組細(xì)胞相比,克隆面積更小,差異明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01,圖8)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示IRG1敲低可以減少神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移(圖9)。在EDU實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)敲低內(nèi)源性IRG1表達(dá)組與si-NC對照組相比,IRG1敲低可明顯減少U251及SHG-44細(xì)胞的遷移及侵襲,(P0.05,圖10及圖11)。對穩(wěn)轉(zhuǎn)IRG1基因的U251及SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期蛋白以及上皮間轉(zhuǎn)化的相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)敲低內(nèi)源性IRG1表達(dá)可激活腫瘤抑制因子pRB以及致癌性細(xì)胞周期轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子E2F1的表達(dá),同時(shí)下調(diào)腫瘤抑制周期依賴激酶阻斷劑p21的表達(dá),抑制周期依賴因子CDK4以及CDK6的酶活性(圖12)。再次,我們的結(jié)果提示抑制IRG1可降低EMT標(biāo)記基因snail、n-鈣黏素、波形蛋白的表達(dá),增加上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-鈣粘素的表達(dá)水平(圖13)。眾多實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NF-K B靶基因編碼的細(xì)胞因子以及生長因子的分泌對NF-K B激活有重要的作用。NF-K B信號通路包括了NF-K B抑制蛋白IK Bs,它是通過IKK途徑磷酸化而降解。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示敲低IRG1的表達(dá)可降低NF-K B、 IkBa以及維持腫瘤中NF-K B活性的STAT3水平(圖14)。這些結(jié)果表明下調(diào)IRG1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)可以抑制NF-K B介導(dǎo)的信號通路。第一章第二節(jié)通過小鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)檢測IRG1在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的生物學(xué)效應(yīng)。圖6A-B顯示注射敲低IRG1的U251細(xì)胞的裸鼠中腫瘤平均體積與對照組相比明顯減少(60%,P0.05,圖15a-b)。對腫瘤重量的分析顯示,接種轉(zhuǎn)染了sh-IRG1的腫瘤細(xì)胞的瘤體比轉(zhuǎn)染sh-vector組瘤體的重量更輕(P0.05,圖16)。這些結(jié)果再次驗(yàn)證了前述的細(xì)胞實(shí)驗(yàn),說明IRG1高表達(dá)能促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。第二章膠質(zhì)瘤細(xì)胞胞漿中IRG1的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后情況密切相關(guān)。IRG1免疫組化切片來源于78個(gè)膠質(zhì)瘤組織塊以及16個(gè)正常腦組織塊,免疫組化染色顯示IRG2在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中有不同程度的表達(dá)(圖17C-F),但在瘤旁組織中表達(dá)很弱或者不表達(dá)(圖17A-B)。IRG1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的亞定位大部分在胞漿中,少部分在細(xì)胞核中。圖表七顯示IRG1高表與膠質(zhì)瘤患者的病理改變密切相關(guān),Ⅲ-Ⅳ級與Ⅰ-Ⅱ級膠質(zhì)瘤患者相比,IGRl的表達(dá)增高更為顯著,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。Kaplan-Meier生存分析顯示,與IRG1高表達(dá)患者相比,IRGl低表達(dá)患者具有更長的無進(jìn)展生存時(shí)間(P0.05)。表八顯示IRG1在膠質(zhì)瘤及正常腦組織中的高表達(dá)率分別為75.6%、37.5%,二者差異明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006)。結(jié)論：1.IRG1在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)高于正常腦組織。2.IRG1表達(dá)與膠質(zhì)瘤的臨床分級相關(guān),可作為膠質(zhì)瘤患者預(yù)后評估的獨(dú)立因素。3.IRG1與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),其高表達(dá)能促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖及侵襲。4.IRG1促進(jìn)膠質(zhì)瘤增殖的作用機(jī)制可能與細(xì)胞周期因子、EMT因子及NF-κB信號通路相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：膠質(zhì)瘤 免疫炎癥 免疫反應(yīng)性高血糖素1 信號通路
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.4
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-21
• 第一章 IRG1在膠質(zhì)瘤中的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制21-69
• 第一節(jié) IRG1在膠質(zhì)瘤中的體外生物學(xué)功能及其作用機(jī)制22-63
• 一、實(shí)驗(yàn)材料22-24
• 二、方法24-38
• 三、結(jié)果38-57
• 四、討論57-63
• 第二節(jié) IRG1在膠質(zhì)瘤中的體內(nèi)生物學(xué)功能63-69
• 一、實(shí)驗(yàn)材料63-64
• 二、方法64-65
• 三、結(jié)果65-67
• 四、討論67-69
• 第二章 IRG1在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及其預(yù)后意義69-80
• 一、實(shí)驗(yàn)材料69-70
• 二、方法70-72
• 三、結(jié)果72-76
• 四、討論76-80
• 全文小結(jié)80-82
• 參考文獻(xiàn)82-99
• 縮略語99-100
• 綜述100-106
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表論文情況106-107
• 致謝107-109
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)審稿證明109

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本文編號：662010