本文關(guān)鍵詞：CUL4B在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的作用研究

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【摘要】：膠質(zhì)細(xì)胞瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的原發(fā)性腫瘤,其發(fā)病率及死亡率均較高,其起源于成熟的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞,呈“樹根樣”廣泛的浸潤到周圍組織,導(dǎo)致手術(shù)難以徹底的切除,而且有極高的復(fù)發(fā)率。病人的存活率取決于腫瘤的類型及腫瘤的惡性程度,根據(jù)WHO的標(biāo)準(zhǔn),膠質(zhì)瘤的惡性程度分為四個(gè)等級(jí)(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ)。其中,Ⅳ型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)的致死率最高,5年存活率低于10%,其原因在于手術(shù)全切除的難度極大,瘤細(xì)胞對(duì)放化療均不敏感。因此,在現(xiàn)代神經(jīng)外科學(xué)界針對(duì)膠質(zhì)瘤的治療策略還存在巨大的挑戰(zhàn)。早在20世紀(jì),科學(xué)家就提出膠質(zhì)瘤是一種分子方面存在缺陷的遺傳病,并且推測可以通過分子治療手段來克服這一難題。目前關(guān)于膠質(zhì)瘤的分子靶向治療已經(jīng)引起人們的關(guān)注。Cullin 4B(CUL4B) 是Cullin4B-Ring E3 ligase complex(CRL4B)的組成成分之一。Cullin 4B以CRL4B的形式參與到蛋白質(zhì)的泛素化進(jìn)程當(dāng)中,CRL4B在泛素-蛋白酶途徑中特異性識(shí)別底物,泛素化過程在真核生物體內(nèi)是信使RNA被轉(zhuǎn)譯成蛋白后的重要修飾之一,在體內(nèi),蛋白在酶的催化下被泛素化,然后進(jìn)入蛋白酶體進(jìn)行降解。泛素化進(jìn)程在蛋白質(zhì)合成與分解的動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮著重要的作用,參與到機(jī)體的細(xì)胞周期,生長發(fā)育和生殖等生理活動(dòng)中。并且大量的研究報(bào)道提示CUL4B在DNA甲基化、蛋白分解以及腫瘤發(fā)生機(jī)制中起著重要的作用。而且相關(guān)研究提示我們Cullin4B在腦部的發(fā)育中承擔(dān)著重要角色。但有關(guān)CUL4B在人體腦部腫瘤中作用的相關(guān)研究較少,包括膠質(zhì)瘤。所以我們將CUL4B在膠質(zhì)瘤中的角色及其相關(guān)作用分子進(jìn)行了初步探討,希望能發(fā)現(xiàn)治療膠質(zhì)瘤的一個(gè)新靶點(diǎn),為膠質(zhì)瘤靶向治療的提供一項(xiàng)新策略。本研究首先表征了CUL4B在膠質(zhì)瘤病變部分以及癌旁周圍腦組織中的表水平情況,然后通過體外實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和U251細(xì)胞株,并用RNA干擾技術(shù)(RNAi)成功建立CUL4B的內(nèi)源性表達(dá)降低的膠質(zhì)瘤母細(xì)胞模型,用western blot技術(shù)檢測慢病毒是否成功轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和U251,致CUL4B表達(dá)水平降低。除此之外,通過CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和結(jié)晶紫染色的方法完成了關(guān)于CUL4B對(duì)細(xì)胞生長和細(xì)胞集落形成的研究；用流式細(xì)胞技術(shù)監(jiān)測到CUL4B對(duì)U87、U251細(xì)胞周期產(chǎn)生的變化；用Transwell檢測方法觀察到CUL4B對(duì)U87、U251細(xì)胞的細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)也起到一定作用；在體內(nèi)試驗(yàn)中,通過接種shRNA感染的U87、U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞,模擬CUL4B對(duì)體內(nèi)腫瘤形成的影響,在功能上探究了CUL4B在膠質(zhì)瘤中的作用.本文同時(shí)也研究了下調(diào)CUL4B表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞遷移的調(diào)控因子的影響。實(shí)驗(yàn)一CUL4B在膠質(zhì)瘤組織與周圍腦組織中的表達(dá)情況1.1 CUL4B在膠質(zhì)瘤中及周圍腦組織中的表達(dá)首先,實(shí)驗(yàn)用qPCR的方法測定了15組膠質(zhì)瘤及周圍腦組織中CUL4B的表達(dá),與同組周圍正常的腦組織相比,14組的膠質(zhì)瘤病變組織中CUL4B mRNA的表達(dá)升高了了3倍以上。該結(jié)果表明CUL4B在膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá),可能與腫瘤的發(fā)展有關(guān)。實(shí)驗(yàn)二CUL4B在膠質(zhì)瘤中的作用研究2.1通過慢病毒介導(dǎo)的shRNA降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的CUL4B表達(dá)U87和U251細(xì)胞分別感染表達(dá)shRNA的慢病毒(Lv-shCon和Lv-shCUL4B),4天后通過熒光顯微鏡檢測綠色熒光蛋白的表達(dá)水平變化。Lv-shCon組和Lv-shCUL4 B組中,80%的細(xì)胞表達(dá)GFP,表明細(xì)胞株中慢病毒感染成功。qPCR和vestern blotting結(jié)果顯示Lv-shCUL4B中內(nèi)源性CUL4B表達(dá)受到抑制。與未感染對(duì)照組相比,Lv-shCUL4B組U87細(xì)胞的CUL4B mRNA水平顯著下降,約77.4%,U251細(xì)胞中下降了77.8%,而在Lv-shCon和Con組間在CUL4B mRNA表達(dá)水平上沒有出現(xiàn)差別,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫印跡實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)兩種細(xì)胞株中CUL4B mRNA的下調(diào)同樣表現(xiàn)在蛋白水平上。因此,慢病毒包裝的shRNA可顯著降低神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中內(nèi)源性CUL4B的表達(dá)。2.2下調(diào)CUL4B表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長和集落形成的影響慢病毒感染U87和U251細(xì)胞,通過CCK-8的檢測評(píng)價(jià)CUL4B對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的影響。結(jié)果顯示：第5天,與對(duì)照組相比,L v-shCUL4B細(xì)胞生長明顯受到抑制,U87細(xì)胞降低了63.7%,U251細(xì)胞降低了45.5%,上述結(jié)果提示降低CUL4B的表達(dá)可顯著抑制兩種細(xì)胞U87、U251的生長過程。慢病毒感染后,U87、U251細(xì)胞可見集落形成(結(jié)晶紫染色),U87細(xì)胞,對(duì)照組和Lv-shCon組細(xì)胞集落數(shù)量均值高達(dá)150,而在Lv-shCUL4B組集落均數(shù)不到30。與此同時(shí),U251細(xì)胞,對(duì)照組和Lv-shCon組細(xì)胞集落均數(shù)為200,而Lv-shCUL4B組集落均數(shù)不到40。這些結(jié)果均顯示下調(diào)CUL4B的表達(dá)可顯著降低神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(U87、U251)細(xì)胞集落的形成過程。2.3下調(diào)CUL4B表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期的影響通過流式細(xì)胞技術(shù)得到的結(jié)果觀察U87、U251兩種細(xì)胞的細(xì)胞周期排布,初步探索CUL4B調(diào)控細(xì)胞增殖的機(jī)制,發(fā)現(xiàn)處于細(xì)胞周期G1期的U87細(xì)胞,Con對(duì)照組約為50.0%,Lv-shCon對(duì)照組約為52.0%,而在Lv-shCUL4B組升高至約82.0%。相反,與Lv-shCon組相比,Lv-shCUL4B組處于S期的U87細(xì)胞明顯減少,Con對(duì)照組、Lv-shCon對(duì)照組和Lv-shCUL4B組分別為40.0%、38.0%、10%。與之類似,由于下調(diào)CUL4B的表達(dá),處于G1期的U251細(xì)胞比例上升,處于S期的比例下降。結(jié)果顯示下調(diào)CUL4B的表達(dá)可通過誘導(dǎo)細(xì)胞在G1期停滯從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長。2.4下調(diào)CUL4B表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的影響Transwell檢測試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)U87、U251兩種膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以發(fā)生遷移運(yùn)動(dòng),Lv-shCUL4B組U87細(xì)胞發(fā)生遷移的細(xì)胞平均數(shù)為65,遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于空白組和Lv-shCon的平均數(shù)值,分別為224、210(p0.01)。下調(diào)CUL4B的表達(dá)后,U251細(xì)胞發(fā)生遷移的數(shù)量亦明顯減少(p0.01),結(jié)果顯示,通過下調(diào)CUL4B的表達(dá)可阻礙神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移。2.5下調(diào)CUL4B表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞皮下腫瘤形成的影響通過接種慢病毒感染的U87、U251細(xì)胞,裸鼠種植異體人神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞模擬膠質(zhì)瘤的模型成功,隨著種植細(xì)胞瘤的時(shí)間發(fā)展,各組皮下腫瘤形狀慢慢增大,然而與Lv-shCon組對(duì)比,Lv-shCUL4B組腫瘤增長速率明顯降低。與Lv-shCon組相比,Lv-shCUL4B組U87細(xì)胞種植裸鼠腫瘤重量降低57.7%,U251細(xì)胞種植裸鼠腫瘤重量下降75.4%(p0.01),上述體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示,下調(diào)CUL4B的表達(dá)可有效的抑制膠質(zhì)瘤的生長。2.6下調(diào)CUL4B表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期和細(xì)胞遷移的調(diào)控因子的影響Western blot結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組和Lv-shCon組相比,Lv-shCUL4B組Cyclin D1和MMP-9表達(dá)水平下降,p16(INK4A)和PTEN表達(dá)水平升高。結(jié)果顯示,CUL4B可能是通過調(diào)節(jié)上述調(diào)控蛋白表達(dá)量的方式對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長和代謝起到重要作用。本研究通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中CUL4B呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài),研究顯示CUL4B參與膠質(zhì)細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展。用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)成功建立CULB4的內(nèi)源性表達(dá)降低細(xì)胞模型,探究CUL4B與膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖,集落形成,細(xì)胞周期及皮下腫瘤形成的關(guān)系,研究顯示CUL4B參與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的增殖,形成及細(xì)胞周期等過程中。結(jié)果顯示通過表達(dá)shRNA的慢病毒下調(diào)CUL4B的表達(dá),可顯著抑制細(xì)胞增生及細(xì)胞集落的形成,上述兩種細(xì)胞系中Cyclin D1表達(dá)下調(diào),p16表達(dá)上調(diào)從而使腫瘤細(xì)胞停滯在G1期,與此同時(shí),腫瘤抑制因子PTEN的表達(dá)增加。進(jìn)一步通過膠質(zhì)瘤種植裸鼠模型發(fā)現(xiàn),CUL4B的丟失可減輕體內(nèi)腫瘤的形成,而且下調(diào)CUL4B的表達(dá)可抑制MMP-9的表達(dá),從而阻止腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此下調(diào)CUL4B的表達(dá)有可能成為靶向治療膠質(zhì)瘤的一種新方法,其作用有待于進(jìn)一步的研究。
【關(guān)鍵詞】：Cullin 4B 膠質(zhì)細(xì)胞瘤 shRNA 增生 細(xì)胞周期 腫瘤形成
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R739.41
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• ABSTRACT10-15
• 符號(hào)說明15-16
• 前言16-19
• 實(shí)驗(yàn)材料19-27
• 一、實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞與臨床病理組織19
• 二、主要的實(shí)驗(yàn)用試劑與耗材19-21
• 三、主要實(shí)驗(yàn)用儀器設(shè)備21-22
• 四、主要試劑及配制方法22-27
• 實(shí)驗(yàn)一 CUL4B在膠質(zhì)瘤組織與周圍腦組織中的表達(dá)情況27-34
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料27
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法27-30
• 1.3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與結(jié)果30-31
• 1.4 討論31-34
• 實(shí)驗(yàn)二 CUL4B在膠質(zhì)瘤中的作用研究34-51
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料34-35
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法35-42
• 2.3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與結(jié)果42-46
• 2.3.1 通過shRNA轉(zhuǎn)染降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的CUL4B的表達(dá)42-43
• 2.3.2 下調(diào)CUL4B的表達(dá)對(duì)細(xì)胞生長和集落形成的影響43-44
• 2.3.3 下調(diào)CUL4B的表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期的影響44
• 2.3.4 下調(diào)CUL4B的表達(dá)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞遷移的影響44-45
• 2.3.5 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：CUL4B對(duì)膠質(zhì)瘤生長的影響45-46
• 2.3.6 下調(diào)CUL4B的表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞遷移的調(diào)控因子的影響46
• 2.4 討論46-51
• 結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-57
• 文獻(xiàn)綜述57-69
• 參考文獻(xiàn)64-69
• 致謝69-70
• 博士期間發(fā)表的論文70-71
• 外文文章71-103
• 附件103

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 René-Olivier Mirimanoff;;High-grade gliomas: reality and hopes[J];Chinese Journal of Cancer;2014年01期

2 Zhi-Kun Qiu;Dong Shen;Yin-Sheng Chen;Qun-Ying Yang;Cheng-Cheng Guo;Bing-Hong Feng;Zhong-Ping Chen;;Enhanced MGMT expression contributes to temozolomide resistance in glioma stem-like cells[J];Chinese Journal of Cancer;2014年02期

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本文編號(hào)：659221