本文關鍵詞：CUL4B在神經(jīng)膠質細胞瘤中的作用研究

  更多相關文章： Cullin 4B 膠質細胞瘤 shRNA 增生 細胞周期 腫瘤形成

【摘要】：膠質細胞瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的原發(fā)性腫瘤,其發(fā)病率及死亡率均較高,其起源于成熟的神經(jīng)膠質細胞或神經(jīng)干細胞,呈“樹根樣”廣泛的浸潤到周圍組織,導致手術難以徹底的切除,而且有極高的復發(fā)率。病人的存活率取決于腫瘤的類型及腫瘤的惡性程度,根據(jù)WHO的標準,膠質瘤的惡性程度分為四個等級(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ)。其中,Ⅳ型膠質母細胞瘤(GBM)的致死率最高,5年存活率低于10%,其原因在于手術全切除的難度極大,瘤細胞對放化療均不敏感。因此,在現(xiàn)代神經(jīng)外科學界針對膠質瘤的治療策略還存在巨大的挑戰(zhàn)。早在20世紀,科學家就提出膠質瘤是一種分子方面存在缺陷的遺傳病,并且推測可以通過分子治療手段來克服這一難題。目前關于膠質瘤的分子靶向治療已經(jīng)引起人們的關注。Cullin 4B(CUL4B) 是Cullin4B-Ring E3 ligase complex(CRL4B)的組成成分之一。Cullin 4B以CRL4B的形式參與到蛋白質的泛素化進程當中,CRL4B在泛素-蛋白酶途徑中特異性識別底物,泛素化過程在真核生物體內(nèi)是信使RNA被轉譯成蛋白后的重要修飾之一,在體內(nèi),蛋白在酶的催化下被泛素化,然后進入蛋白酶體進行降解。泛素化進程在蛋白質合成與分解的動態(tài)平衡中發(fā)揮著重要的作用,參與到機體的細胞周期,生長發(fā)育和生殖等生理活動中。并且大量的研究報道提示CUL4B在DNA甲基化、蛋白分解以及腫瘤發(fā)生機制中起著重要的作用。而且相關研究提示我們Cullin4B在腦部的發(fā)育中承擔著重要角色。但有關CUL4B在人體腦部腫瘤中作用的相關研究較少,包括膠質瘤。所以我們將CUL4B在膠質瘤中的角色及其相關作用分子進行了初步探討,希望能發(fā)現(xiàn)治療膠質瘤的一個新靶點,為膠質瘤靶向治療的提供一項新策略。本研究首先表征了CUL4B在膠質瘤病變部分以及癌旁周圍腦組織中的表水平情況,然后通過體外實驗培養(yǎng)膠質瘤細胞U87和U251細胞株,并用RNA干擾技術(RNAi)成功建立CUL4B的內(nèi)源性表達降低的膠質瘤母細胞模型,用western blot技術檢測慢病毒是否成功轉染膠質瘤細胞U87和U251,致CUL4B表達水平降低。除此之外,通過CCK-8細胞增殖實驗和結晶紫染色的方法完成了關于CUL4B對細胞生長和細胞集落形成的研究；用流式細胞技術監(jiān)測到CUL4B對U87、U251細胞周期產(chǎn)生的變化；用Transwell檢測方法觀察到CUL4B對U87、U251細胞的細胞遷移運動也起到一定作用；在體內(nèi)試驗中,通過接種shRNA感染的U87、U251膠質瘤細胞,模擬CUL4B對體內(nèi)腫瘤形成的影響,在功能上探究了CUL4B在膠質瘤中的作用.本文同時也研究了下調(diào)CUL4B表達對細胞周期和細胞遷移的調(diào)控因子的影響。實驗一CUL4B在膠質瘤組織與周圍腦組織中的表達情況1.1 CUL4B在膠質瘤中及周圍腦組織中的表達首先,實驗用qPCR的方法測定了15組膠質瘤及周圍腦組織中CUL4B的表達,與同組周圍正常的腦組織相比,14組的膠質瘤病變組織中CUL4B mRNA的表達升高了了3倍以上。該結果表明CUL4B在膠質瘤組織中高表達,可能與腫瘤的發(fā)展有關。實驗二CUL4B在膠質瘤中的作用研究2.1通過慢病毒介導的shRNA降低膠質瘤細胞中的CUL4B表達U87和U251細胞分別感染表達shRNA的慢病毒(Lv-shCon和Lv-shCUL4B),4天后通過熒光顯微鏡檢測綠色熒光蛋白的表達水平變化。Lv-shCon組和Lv-shCUL4 B組中,80%的細胞表達GFP,表明細胞株中慢病毒感染成功。qPCR和vestern blotting結果顯示Lv-shCUL4B中內(nèi)源性CUL4B表達受到抑制。與未感染對照組相比,Lv-shCUL4B組U87細胞的CUL4B mRNA水平顯著下降,約77.4%,U251細胞中下降了77.8%,而在Lv-shCon和Con組間在CUL4B mRNA表達水平上沒有出現(xiàn)差別,有統(tǒng)計學意義。免疫印跡實驗亦證實兩種細胞株中CUL4B mRNA的下調(diào)同樣表現(xiàn)在蛋白水平上。因此,慢病毒包裝的shRNA可顯著降低神經(jīng)膠質母細胞瘤中內(nèi)源性CUL4B的表達。2.2下調(diào)CUL4B表達對膠質瘤細胞生長和集落形成的影響慢病毒感染U87和U251細胞,通過CCK-8的檢測評價CUL4B對膠質瘤細胞生長的影響。結果顯示：第5天,與對照組相比,L v-shCUL4B細胞生長明顯受到抑制,U87細胞降低了63.7%,U251細胞降低了45.5%,上述結果提示降低CUL4B的表達可顯著抑制兩種細胞U87、U251的生長過程。慢病毒感染后,U87、U251細胞可見集落形成(結晶紫染色),U87細胞,對照組和Lv-shCon組細胞集落數(shù)量均值高達150,而在Lv-shCUL4B組集落均數(shù)不到30。與此同時,U251細胞,對照組和Lv-shCon組細胞集落均數(shù)為200,而Lv-shCUL4B組集落均數(shù)不到40。這些結果均顯示下調(diào)CUL4B的表達可顯著降低神經(jīng)膠質母細胞瘤(U87、U251)細胞集落的形成過程。2.3下調(diào)CUL4B表達對膠質瘤細胞周期的影響通過流式細胞技術得到的結果觀察U87、U251兩種細胞的細胞周期排布,初步探索CUL4B調(diào)控細胞增殖的機制,發(fā)現(xiàn)處于細胞周期G1期的U87細胞,Con對照組約為50.0%,Lv-shCon對照組約為52.0%,而在Lv-shCUL4B組升高至約82.0%。相反,與Lv-shCon組相比,Lv-shCUL4B組處于S期的U87細胞明顯減少,Con對照組、Lv-shCon對照組和Lv-shCUL4B組分別為40.0%、38.0%、10%。與之類似,由于下調(diào)CUL4B的表達,處于G1期的U251細胞比例上升,處于S期的比例下降。結果顯示下調(diào)CUL4B的表達可通過誘導細胞在G1期停滯從而抑制膠質瘤細胞的生長。2.4下調(diào)CUL4B表達對膠質瘤細胞遷移的影響Transwell檢測試驗發(fā)現(xiàn)U87、U251兩種膠質瘤細胞可以發(fā)生遷移運動,Lv-shCUL4B組U87細胞發(fā)生遷移的細胞平均數(shù)為65,遠遠少于空白組和Lv-shCon的平均數(shù)值,分別為224、210(p0.01)。下調(diào)CUL4B的表達后,U251細胞發(fā)生遷移的數(shù)量亦明顯減少(p0.01),結果顯示,通過下調(diào)CUL4B的表達可阻礙神經(jīng)膠質母細胞瘤細胞的遷移。2.5下調(diào)CUL4B表達對膠質瘤細胞皮下腫瘤形成的影響通過接種慢病毒感染的U87、U251細胞,裸鼠種植異體人神經(jīng)膠質母細胞瘤細胞模擬膠質瘤的模型成功,隨著種植細胞瘤的時間發(fā)展,各組皮下腫瘤形狀慢慢增大,然而與Lv-shCon組對比,Lv-shCUL4B組腫瘤增長速率明顯降低。與Lv-shCon組相比,Lv-shCUL4B組U87細胞種植裸鼠腫瘤重量降低57.7%,U251細胞種植裸鼠腫瘤重量下降75.4%(p0.01),上述體內(nèi)和體外實驗結果進一步顯示,下調(diào)CUL4B的表達可有效的抑制膠質瘤的生長。2.6下調(diào)CUL4B表達對膠質瘤細胞周期和細胞遷移的調(diào)控因子的影響Western blot結果顯示,與空白對照組和Lv-shCon組相比,Lv-shCUL4B組Cyclin D1和MMP-9表達水平下降,p16(INK4A)和PTEN表達水平升高。結果顯示,CUL4B可能是通過調(diào)節(jié)上述調(diào)控蛋白表達量的方式對膠質瘤細胞的生長和代謝起到重要作用。本研究通過實時定量PCR技術檢測了膠質母細胞瘤組織中CUL4B呈現(xiàn)高表達狀態(tài),研究顯示CUL4B參與膠質細胞瘤的發(fā)生發(fā)展。用慢病毒轉染技術成功建立CULB4的內(nèi)源性表達降低細胞模型,探究CUL4B與膠質瘤細胞增殖,集落形成,細胞周期及皮下腫瘤形成的關系,研究顯示CUL4B參與神經(jīng)膠質細胞瘤的增殖,形成及細胞周期等過程中。結果顯示通過表達shRNA的慢病毒下調(diào)CUL4B的表達,可顯著抑制細胞增生及細胞集落的形成,上述兩種細胞系中Cyclin D1表達下調(diào),p16表達上調(diào)從而使腫瘤細胞停滯在G1期,與此同時,腫瘤抑制因子PTEN的表達增加。進一步通過膠質瘤種植裸鼠模型發(fā)現(xiàn),CUL4B的丟失可減輕體內(nèi)腫瘤的形成,而且下調(diào)CUL4B的表達可抑制MMP-9的表達,從而阻止腫瘤細胞發(fā)生轉移。因此下調(diào)CUL4B的表達有可能成為靶向治療膠質瘤的一種新方法,其作用有待于進一步的研究。
【關鍵詞】：Cullin 4B 膠質細胞瘤 shRNA 增生 細胞周期 腫瘤形成
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R739.41
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• ABSTRACT10-15
• 符號說明15-16
• 前言16-19
• 實驗材料19-27
• 一、實驗用細胞與臨床病理組織19
• 二、主要的實驗用試劑與耗材19-21
• 三、主要實驗用儀器設備21-22
• 四、主要試劑及配制方法22-27
• 實驗一 CUL4B在膠質瘤組織與周圍腦組織中的表達情況27-34
• 1.1 實驗材料27
• 1.2 實驗方法27-30
• 1.3 實驗內(nèi)容與結果30-31
• 1.4 討論31-34
• 實驗二 CUL4B在膠質瘤中的作用研究34-51
• 2.1 實驗材料34-35
• 2.2 實驗方法35-42
• 2.3 實驗內(nèi)容與結果42-46
• 2.3.1 通過shRNA轉染降低膠質瘤細胞中的CUL4B的表達42-43
• 2.3.2 下調(diào)CUL4B的表達對細胞生長和集落形成的影響43-44
• 2.3.3 下調(diào)CUL4B的表達對細胞周期的影響44
• 2.3.4 下調(diào)CUL4B的表達對神經(jīng)膠質母細胞瘤細胞遷移的影響44-45
• 2.3.5 體內(nèi)實驗：CUL4B對膠質瘤生長的影響45-46
• 2.3.6 下調(diào)CUL4B的表達對細胞周期和細胞遷移的調(diào)控因子的影響46
• 2.4 討論46-51
• 結論51-52
• 參考文獻52-57
• 文獻綜述57-69
• 參考文獻64-69
• 致謝69-70
• 博士期間發(fā)表的論文70-71
• 外文文章71-103
• 附件103

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 René-Olivier Mirimanoff;;High-grade gliomas: reality and hopes[J];Chinese Journal of Cancer;2014年01期

2 Zhi-Kun Qiu;Dong Shen;Yin-Sheng Chen;Qun-Ying Yang;Cheng-Cheng Guo;Bing-Hong Feng;Zhong-Ping Chen;;Enhanced MGMT expression contributes to temozolomide resistance in glioma stem-like cells[J];Chinese Journal of Cancer;2014年02期

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本文編號：659221