本文關(guān)鍵詞：鹽酸多奈哌齊在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中抗炎機(jī)制及保護(hù)作用的研究

  更多相關(guān)文章： 鹽酸多奈哌齊 TNF-α 基質(zhì)金屬蛋白酶 抗炎 骨關(guān)節(jié)炎

【摘要】：目的研究不同濃度的鹽酸多奈哌齊(Donepezil)對(duì)OA患者軟骨細(xì)胞生存率的影響,篩選出其最佳的藥物作用濃度,觀察其對(duì)TNF-α產(chǎn)生毒性的拮抗作用;觀察最適濃度的Donepezil對(duì)TNF-α處理后的軟骨細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinase,MMP)13和蛋白聚糖酶ADAMTS-5的基因表達(dá),以及白介素6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)前列腺素E2(PGE2)和NO分泌水平的影響;研究最佳濃度的Donepezil對(duì)TNF-α處理后的軟骨細(xì)胞MAPKs信號(hào)通路(P38、ERK1/2和JNK磷酸化)的影響;研究Donepezil對(duì)TNF-α處理后的STAT1/IRF-1通路的影響;研究構(gòu)建組織工程軟骨,研究Donepezil對(duì)TNF-α造成的組織工程軟骨的過度降解的保護(hù)作用;進(jìn)一步探討Donepezil對(duì)OA軟骨降解的保護(hù)作用和可能涉及的機(jī)制。方法1.實(shí)驗(yàn)步驟1.1細(xì)胞培養(yǎng):從OA患者行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的膝關(guān)節(jié)股骨髁獲取軟骨組織,并進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)和傳代,獲取3-5代細(xì)胞用于進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。1.2設(shè)定六個(gè)Donepezil濃度組(0、5、10、20、40、80μM),和5個(gè)TNF-α濃度組(0、2.5、5、10、20ng/ml),觀察各濃度組Donepezil對(duì)軟骨細(xì)胞生存的影響,然后篩選出對(duì)細(xì)胞毒性最大的TNF-α的濃度。1.3以Donepezil預(yù)處理,繼而以TNF-α處理人軟骨細(xì)胞,q-PCR法測定MMP-13和ADAMTS-5的mRNA表達(dá)狀況,并酶聯(lián)免疫吸附法測定細(xì)胞上清液中的IL-1β、IL-6、PGE2的含量,Greiss法測定細(xì)胞上清液的NO的含量。1.4以TNF-α處理人軟骨細(xì)胞,以Donepezil干預(yù),Western Blot法檢測MAPKs通路(p38、ERK1/2、JNK)的磷酸化狀況。1.5以TNF-α處理人軟骨細(xì)胞,以Donepezil為干預(yù),以化學(xué)制劑SB203580(p38 inhibitor),PD98059(ERK1/2 inhibitor),分別阻斷p38、ERK1/2、JNK通路,ELISA檢測細(xì)胞IL-1β、IL-6、PEG2的分泌情況,Greiss法測定細(xì)胞上清液的NO的含量。1.6以TNF-α處理人軟骨細(xì)胞,以donepezil干預(yù),觀察其對(duì)stat1/irf-1通路的影響。1.7將軟骨細(xì)胞接種在多孔納米plla支架上,構(gòu)建組織工程軟骨,以TNF-α處理人軟骨細(xì)胞,以donepezil干預(yù),通過safranino染色來觀察細(xì)胞支架復(fù)合物的蛋白聚糖表達(dá)情況,通過免疫組化染色和wb觀察復(fù)合物中的ii型膠原,通過dmmb法測量復(fù)合物中糖胺聚糖(gag)含量,通過免疫熒光觀察復(fù)合物中的軟骨細(xì)胞的sox-9的表達(dá),以此觀察donepezil預(yù)防TNF-α所造成的軟骨細(xì)胞基質(zhì)降解的情況。結(jié)果1.1donepezil對(duì)軟骨細(xì)胞活力的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:20μm以下的donepezil對(duì)細(xì)胞的活力無任何影響(p0.05,與對(duì)照組相比較)。40、80μm濃度組對(duì)細(xì)胞生長有抑制作用(p0.05,與對(duì)照組細(xì)胞比較)。而TNF-α濃度組(0、2.5、5、10、20ng/ml)中,10ng/ml的TNF-α對(duì)細(xì)胞活性抑制的最為明顯。和單純TNF-α處理組比較,以donepezil干預(yù)可大大提高細(xì)胞的活性(p0.05)。1.2donepezil對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞的mmp-13mrna和adamts-5的影響。軟骨細(xì)胞以10、20μmdonepezil預(yù)處理24h再加入10ng/ml的TNF-α收集細(xì)胞行q-pcr。單純TNF-α處理組相比,donepezil組的mmp-13mrna和adamts-5表達(dá)水平明顯降低。1.3donepezil對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞上清液中的il-1β、il-6、pge2和no的分泌的影響。軟骨細(xì)胞以10、20μmdonepezil預(yù)處理24h加入10ng/ml的TNF-α,刺激72h收集細(xì)胞上清液行elisa檢測和greiss檢測。結(jié)果顯示,與TNF-α處理組相比,donepezil可使TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生的il-1β、il-6、pge2和no的分泌顯著性下降。1.4donepezil對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞的stat1/irf、p-p38、p-erk1/2和p-jnk表達(dá)的影響。TNF-α誘導(dǎo)組的p38、erk1/2和jnk的磷酸化明顯增加。而經(jīng)donepezil干預(yù)后,p38和erk1/2的通路的磷酸化明顯受到抑制,而donepezil對(duì)jnk通路的磷酸化并沒有影響。1.5donepezil以及mapks(erk,p38)通路抑制劑對(duì)il-1β、il-6、pge2和no的影響。1.6免疫熒光顯示,TNF-α的刺激會(huì)引起irf-1因子的表達(dá),irf-1的sirna可,而donepezil的干預(yù)可以抑制stat1因子的上調(diào),進(jìn)而抑制irf-1通路的激活。irf-1的上調(diào)可特異性的引起MMP-13的表達(dá),而Donepezil可特異性的削弱由IRF-1上調(diào)引起的MMP-13的表達(dá)。1.7 Donepezil對(duì)TNF-a導(dǎo)致的組織工程軟骨復(fù)合物基質(zhì)降解的保護(hù)作用免疫組化結(jié)果顯示,Donepezil干預(yù)組復(fù)合物比單純TNF-α處理組的II型膠原特異性染色更強(qiáng)。Safranin O染色提示Donepezil干預(yù)組的蛋白多聚糖的積累多于單純TNF-α處理組。且DMMB法測的Donepezil干預(yù)組的糖胺聚糖(GAG)同樣多于單純TNF-α處理組(P0.01)。經(jīng)過Donepezil干預(yù)后的軟骨支架復(fù)合物的SOX-9的表達(dá)明顯多于單純TNF-α處理組。結(jié)論1.10、20μM濃度的Donepezil對(duì)細(xì)胞的生長無影響,可作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干預(yù)濃度,10ng/mL的TNF-α對(duì)軟骨細(xì)胞的毒性最大,可作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的負(fù)性處理因素,且Donepezil的干預(yù)可以逆轉(zhuǎn)TNF-α造成的軟骨細(xì)胞的活力下降。2.Donepezil可以顯著的下調(diào)由TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生的MMP-13和ADAMTS-5的mRNA的表達(dá)。3.Donepezil可以顯著的下調(diào)由TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-1β、IL-6、PGE2和NO的分泌增加。4.Donepezil可以抑制TNF-α導(dǎo)致的MAPK-p38和ERK1/2的磷酸化。但是對(duì)TNF-α引起的JNK通路的活化沒有任何作用。5.和其它信號(hào)通路抑制劑相比,Donepezil可以抑制的由TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎性因子較為廣泛,這可能與Donepezil參與多信號(hào)通路抑制調(diào)控,通過多靶點(diǎn)抑制炎癥發(fā)展有關(guān)。6.TNF-α可以通過激活STAT1途徑提高IRF-1的表達(dá),進(jìn)而上調(diào)MMP-13的分泌,而這一通路可被Donepezil抑制。7.Donepezil可以抑制TNF-α導(dǎo)致的細(xì)胞基質(zhì)的降解。
【關(guān)鍵詞】：鹽酸多奈哌齊 TNF-α 基質(zhì)金屬蛋白酶 抗炎 骨關(guān)節(jié)炎
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R684.3
【目錄】：

• 英文縮寫一覽表5-7
• 英文摘要7-11
• 中文摘要11-14
• 第一章 前言14-17
• 1.1 研究背景14-16
• 1.2 課題設(shè)計(jì)思路與技術(shù)路線16-17
• 第二章 軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)和Donepezil對(duì)軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用17-24
• 2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>17
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料17-18
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法18-20
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果20-22
• 2.5 討論22-23
• 2.6 小結(jié)23-24
• 第三章 Donepezil對(duì)TNF-α 誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用24-38
• 3.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>24
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料24-26
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法26-32
• 3.4 結(jié)果32-36
• 3.5 討論36-37
• 3.6 小結(jié)37-38
• 第四章 Donepezil對(duì)軟骨細(xì)胞的抗炎保護(hù)作用的機(jī)制研究38-54
• 4.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>38
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料38-44
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法44-50
• 4.4 結(jié)果50-51
• 4.5 討論51-53
• 4.6 小結(jié)53-54
• 第五章 Donepezil可抑制由TNF-α 介導(dǎo)的干擾素調(diào)節(jié)因子-1（IRF-1）54-65
• 5.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>54
• 5.2 實(shí)驗(yàn)材料54-56
• 5.3 實(shí)驗(yàn)方法56-60
• 5.4 結(jié)果60-64
• 5.5 討論64
• 5.6 小結(jié)64-65
• 第六章 Donepezil對(duì)TNF-α 誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞基質(zhì)降解的保護(hù)作用65-80
• 6.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>65
• 6.2 實(shí)驗(yàn)材料65-71
• 6.3 實(shí)驗(yàn)方法71-76
• 6.4 結(jié)果76-78
• 6.5 討論78-79
• 6.6 小結(jié)79-80
• 全文結(jié)論80-81
• 參考文獻(xiàn)81-84
• 文獻(xiàn)綜述一 骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制與治療進(jìn)展84-94
• 參考文獻(xiàn)88-94
• 文獻(xiàn)綜述二 骨關(guān)節(jié)炎的藥物治療94-100
• 參考文獻(xiàn)98-100
• 在讀期間發(fā)表論文情況100-101
• 致謝101

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 馬春輝;閻作勤;郭常安;張光健;;凋亡相關(guān)基因Bax和bcl-2在骨關(guān)節(jié)炎軟骨中的作用[J];中華關(guān)節(jié)外科雜志(電子版);2007年04期

，

本文編號(hào)：653005