本文關(guān)鍵詞：miR-124調(diào)控靶基因Foxq1抑制鼻咽癌增殖及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究

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【摘要】：目的和意義鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我國(guó)南方及東南亞地區(qū)常見(jiàn)的一種惡性腫瘤,其發(fā)病與愛(ài)波斯坦-巴爾病毒(Epstein Barr Virus, EBV)感染、環(huán)境因素以及基因易感性等因素密切相關(guān)。鼻咽癌為一種來(lái)源于鼻咽上皮的高度惡性的腫瘤,具有高度局部轉(zhuǎn)移及早期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移特征。放射治療和輔助性化療雖極大的提高了鼻咽癌治愈率,但總體5年平均生存率仍維持在70%左右。大約30-40%患者診斷為晚期鼻咽癌,其中相當(dāng)一部分患者,經(jīng)過(guò)治療后的4年內(nèi)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)。迄今為止,鼻咽癌發(fā)病的分子機(jī)制尚未完全闡明。因此,進(jìn)一步研究鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制及尋找一種可能的早期診斷的分子標(biāo)志物極為迫切。MicroRNA (miRNA)是一類大小約為19-25個(gè)核苷酸(nucleotide, nt)的非編碼單鏈小分子RNA,由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的大小約為70-100nt的單鏈RNA前體(pre-miRNA)經(jīng)過(guò)Dicer酶剪切加工后生成,通過(guò)與靶基因mRNA的3’非編碼區(qū)(3'untranslated region,3'UTR)互補(bǔ)匹配導(dǎo)致該mRNA的降解。大多數(shù)miRNA與底物mRNA不完全配對(duì)結(jié)合,通過(guò)轉(zhuǎn)錄后抑制翻譯來(lái)調(diào)控基因表達(dá)。miRNA基因以單拷貝、多拷貝或基因簇等多種形式存在于基因組中,而且絕大部分定位于基因間隔區(qū),其轉(zhuǎn)錄獨(dú)立于其他基因,并不翻譯成蛋白質(zhì),而是在體內(nèi)代謝過(guò)程中發(fā)揮多種調(diào)控作用,包括動(dòng)植物的組織器官發(fā)育、細(xì)胞分化和凋亡、胰島素分泌、脂肪代謝等多種生命活動(dòng)。正常細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、發(fā)育、分化和死亡是一個(gè)高度有序的過(guò)程,而腫瘤的形成正是這一高度有序的過(guò)程發(fā)生紊亂所造成的,其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟、多階段、多因素參與的復(fù)雜過(guò)程,這一過(guò)程涉及到多個(gè)基因在時(shí)間和空間上的協(xié)調(diào)表達(dá)。除了蛋白編碼基因,最近研究發(fā)現(xiàn)miRNA在腫瘤的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮及其重要的作用。miRNA作為一類新型基因調(diào)控劑,其表達(dá)水平在多種腫瘤中發(fā)生改變,通過(guò)調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯,影響癌細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、運(yùn)動(dòng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移以及血管生成等生物學(xué)特性,發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用,多角度多層次的參與了腫瘤的演進(jìn)。目前研究表明,miRNAs不僅存在組織及細(xì)胞中,同時(shí)存在許多體液,包括血清,血漿,唾液,尿液和羊水。通常把血漿或是血清miRNA認(rèn)為是循環(huán)miRNAs。miRNAs在體液的存在可表示無(wú)創(chuàng)癌癥生物學(xué)標(biāo)志物。由于失調(diào)的miRNA表達(dá)的早期事件在腫瘤發(fā)生,檢測(cè)循環(huán)miRNA水平也可用于早期癌癥診斷和治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)以及潛在的新病人選擇標(biāo)準(zhǔn)的臨床試驗(yàn)中的作用。2008年,首次發(fā)現(xiàn)miR-21在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者的血清中表達(dá)上調(diào),且與患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存期密切相關(guān)。通過(guò)檢測(cè)的miR-141的血清水平,所以能夠區(qū)分患者患有前列腺癌的健康受試者。在前列腺癌中15血清miRNAs表達(dá)上調(diào),如miR-16, miR-92a和miR-92b等。Tsujiura等研究表明在胃癌患者中,血清miR-21和miR-106B顯著高于正�；颊�,切除胃癌后,血清miR-21和miR-106B表達(dá)較術(shù)前減少。迄今為止,超過(guò)100個(gè)研究評(píng)估的潛在用途的血清或血漿的miRNA在不同類型的癌癥生物標(biāo)志物。在鼻咽癌中,研究發(fā)現(xiàn)眾多的microRNAs表達(dá)失調(diào),如miR-26a, miR-9, miR-378, miR-10b, miR-144, miR-214等。而這些表達(dá)失調(diào)的microRNAs參與了鼻咽癌的發(fā)生及發(fā)展的過(guò)程。miR-26在鼻咽癌細(xì)胞系及鼻咽癌組織標(biāo)本中表達(dá)下調(diào),靶向EZH2參與抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖及侵襲作用。同樣的,miR-9在鼻咽癌表達(dá)下調(diào),并通過(guò)靶向CXCR4調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。然而,miR-378在鼻咽癌中表達(dá)上調(diào),并通過(guò)靶向TOB2促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖,轉(zhuǎn)移及侵襲能力。miR-10b在鼻咽癌細(xì)胞系中高表達(dá),下調(diào)miR-10b的表達(dá),可抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力。截止2015年,約有32個(gè)microRNA參與鼻咽癌疾病發(fā)生及發(fā)展。miRNAs在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色,且循環(huán)的miRNAs可作為臨床無(wú)創(chuàng)的檢測(cè)的生物學(xué)標(biāo)志物。然而在鼻咽癌中,循環(huán)miRNA研究報(bào)道甚少。因此我們課題組于2013年,利用microRNA-array篩查血漿中的miRNAs表達(dá)譜的改變并通過(guò)qPCR加以驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)鼻咽癌病人的血漿miR-124較非癌病人中表達(dá)明顯下調(diào)。目前為止,miR-124在不同類型腫瘤均有見(jiàn)報(bào)道,但miR-124在鼻咽癌組織表達(dá)情況及扮演什么角色尚未見(jiàn)研究。因此我們選擇miR-124作為我們的研究對(duì)象。miR-124全長(zhǎng)為21nt,首先從小鼠克隆而來(lái),隨后其表達(dá)水平在人類胚胎干細(xì)胞被證實(shí)。2007年,Visvanathan J等發(fā)現(xiàn)在胚胎神經(jīng)系統(tǒng)中,參與了神經(jīng)突的形成；同時(shí)Makeyev EV等證實(shí)了促進(jìn)了神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。在腫瘤研究中,Silber J最早發(fā)現(xiàn)在miR-124多形性膠質(zhì)瘤中及在腦腫瘤干細(xì)胞中表達(dá)明顯降低,同時(shí)證實(shí)miR-124抑制細(xì)胞增殖能力。此后miR-124發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、肝癌、膀胱癌等中表達(dá)下調(diào),發(fā)現(xiàn)miR-124抑制細(xì)胞的增殖,轉(zhuǎn)移,侵襲等能力。但在鼻咽癌中,尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。miR-124的表達(dá)失調(diào)在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中又扮演著何種角色及其分子機(jī)理等一系列問(wèn)題都值得我們深入探討�；趍iR-124的研究現(xiàn)狀及其在鼻咽癌癌變分子機(jī)制中的潛在意義,本課題的研究目的為明確miR-124在鼻咽癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)特性,探討miR-124對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及其在鼻咽癌發(fā)病機(jī)制中所發(fā)揮的重要作用,闡明miR-124在鼻咽癌中發(fā)揮生物學(xué)功能的分子機(jī)理,為深入理解鼻咽癌發(fā)病的分子機(jī)制和尋找新的分子靶向治療靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)。材料和方法1.細(xì)胞培養(yǎng)人鼻咽癌細(xì)胞株5-8F、6-10B、CNE1、CNE2、C666-1、HONE-1和SUNE-1采用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗RPMI 1640培養(yǎng)基,NP69采用KMSF培養(yǎng)基,HK-293T細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下傳代培養(yǎng)。采用對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。2.臨床標(biāo)本收集178例鼻咽癌組織和55例非癌鼻咽上皮組織均來(lái)源于南方醫(yī)院耳鼻喉科標(biāo)本庫(kù),所有標(biāo)本均為鼻咽部活檢組織,經(jīng)病理確診為鼻咽癌,所有患者均尚未接受放化療治療。本研究經(jīng)南方醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有患者均簽署知情同意書(shū)。3.載體構(gòu)建[1]慢病毒載體pLVTHM/miR-124該載體經(jīng)慢病毒包裝、感染細(xì)胞后可穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-124,通過(guò)Real-time PCR及基因測(cè)序證實(shí)該載體構(gòu)建成功。[2] psicheck.2-Foxql wt 3'UTR和psicheck.2-Foxql mut 3'UTR以正常人外周血基因組DNA為模板,擴(kuò)增Foxql 3'UTR (185bp),將該片段克隆到psicheck.2-control vector,得到重組質(zhì)粒psicheck.2-Foxql wt 3'UTR,然后將該重組質(zhì)粒進(jìn)行定點(diǎn)突變,得到突變質(zhì)粒psicheck.2-Foxql mut 3UTR。[3]過(guò)表達(dá)的Foxq1慢病毒購(gòu)買于上海吉瑪生物技術(shù)有限責(zé)任公司。4.細(xì)胞轉(zhuǎn)染[1] miRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,操作按LipofectamineTM 2000試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。[2] 慢病毒感染將慢病毒懸液感染鼻咽癌細(xì)胞,48h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光(green fluorescent protein, GFP)發(fā)光情況。利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分選獲得GFP陽(yáng)性細(xì)胞,分別建立過(guò)表達(dá)miR-124、過(guò)表達(dá)Foxql鼻咽癌細(xì)胞株。5. miRNA與質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染：操作按LipofectamineTM 2000試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。24孔板中miRNA的轉(zhuǎn)染量為50nM,重組質(zhì)粒psicheck.2-Foxq1 wt 3'UTR和psicheck.2-Foxq1 mut 3'UTR的轉(zhuǎn)染量為100ng。6.熒光定量PCR抽提細(xì)胞和組織的總RNA和小分子RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,采用sybr green法進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過(guò)相對(duì)定量以2-△△Ct值代表基因的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。7. Western blot抽提細(xì)胞總蛋白,采用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定,然后10% SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫雜交、化學(xué)發(fā)光法顯影。8.雙熒光素酶活性檢測(cè)將熒光素酶報(bào)告基因載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染24h后,將細(xì)胞裂解,然后利用GloMaxTM 96 Microplate Luminometer發(fā)光檢測(cè)儀分別測(cè)定Firefly luciferase和Renilla luciferase活性。以Firefly luciferase與Renilla luciferase活性的比值作為熒光素酶的相對(duì)活性,進(jìn)行不同樣品間的比較。9.細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[1] CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)將1x103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中,每孔體積200μl,每組5孔,同時(shí)設(shè)空白對(duì)照,分別培養(yǎng)24h、48h、72h和96h。每孔加入CCK-8溶液10μl,37℃孵育2h后終止孵育,以空白對(duì)照孔調(diào)零,酶標(biāo)儀上450nm測(cè)定各孔吸光度值(OD值),以相對(duì)應(yīng)OD比值表示細(xì)胞增殖能力大小。[2] 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)接種100個(gè)細(xì)胞到12孔板中,保證細(xì)胞分散均勻,培養(yǎng)2周。出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞克隆時(shí),終止培養(yǎng),棄去培養(yǎng)基,多聚甲醛固定后結(jié)晶紫染色,顯微鏡下計(jì)數(shù)形成的克隆數(shù)(≥50個(gè)細(xì)胞為一個(gè)克隆)。平板克隆形成率=形成克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。[3] 細(xì)胞周期檢測(cè)采用碘化丙錠(propidium iodide, PI)單染法檢測(cè)細(xì)胞周期分布。將細(xì)胞固定、Rnase A消化、PI染色后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。[4] 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞重懸于無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,每個(gè)Transwell小室中加入細(xì)胞,培養(yǎng)板每孔加入10%胎牛血清培養(yǎng)基,培養(yǎng)24h后取出Transwell小室,固定染色顯微鏡下觀察穿過(guò)膜的細(xì)胞。[5] 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)Matrigel基質(zhì)膠凍融后,向Transwell小室中均勻加入50ul,37℃培育12h后,余操作同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。10.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[1]裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)分別將過(guò)表達(dá)miR-124的lv-miR-124/5-8F和對(duì)照組細(xì)胞lv-miR-Ctrl/5-8F隨機(jī)接種于12只裸鼠后背部皮下,接種細(xì)胞數(shù)為5×105,每組包括6只。每?jī)商煊糜螛?biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)短徑一次,按如下公式計(jì)算腫瘤體積：v=(Dxd2)/2,其中D代表腫瘤最長(zhǎng)徑,而d代表腫瘤最短徑。待腫瘤體積超過(guò)500mm3,將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死,腫瘤組織取出后經(jīng)福爾馬林固定,石蠟包埋,切片后HE染色,光學(xué)顯微鏡觀察。[2]肝癌肺轉(zhuǎn)移模型分別將過(guò)表達(dá)miR-124/Iv-miR-124/5-8F和對(duì)照組細(xì)胞lv-miR-Ctrl/5-8F隨機(jī)接種于10只裸鼠的肝包膜下,接種細(xì)胞數(shù)為1x106,每組包括5只。25天后,給予裸鼠安樂(lè)死后,取出裸鼠的肝臟及雙肺,通過(guò)光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡及免疫組化觀察肝臟及雙肺轉(zhuǎn)移瘤情況。11.免疫組化將石蠟切片進(jìn)行脫蠟、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、血清封閉、抗體孵育、DAB顯色、復(fù)染、透明、封片等步驟進(jìn)行,免疫組化的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行半定量判定。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野,如果核陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞數(shù)超過(guò)50%,則認(rèn)為該樣本陽(yáng)性。然后,按照細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：棕褐色(3分),棕黃色(2分),淡黃色(1分),無(wú)著色(0分)。12.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)皮下成瘤體積的比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析；免疫組化染色強(qiáng)度的比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)；鼻咽癌組織中miR-124和Foxql表達(dá)水平的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析；其他實(shí)驗(yàn)中涉及到兩組數(shù)據(jù)之間的比較均采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn),而三組或三組以上數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析,方差齊性時(shí),采用ANOVA,其多重比較采用LSD法；方差不齊時(shí)采用近似F檢驗(yàn)Welch法,多重比較采用Dunnett T3。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.miR-124在鼻咽癌細(xì)胞株及鼻咽癌組織標(biāo)本中表達(dá)及臨床特征分析熒光定量PCR結(jié)果顯示,在7種鼻咽癌細(xì)胞株,即5-8F、6-10B、CNE1、 CNE2、C666-1、HONE1和SUNE-1, miR-124的表達(dá)均低于永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP69；而在178例非角化未分化型鼻咽癌組織中,miR-124的平均表達(dá)水平要比55例鼻咽慢性炎組織降低60%(t=4.906, P0.001)。miR-124表達(dá)與鼻咽癌患者的性別及年齡無(wú)明顯相關(guān)性。我們發(fā)現(xiàn)miR-124與臨床分期密切相關(guān),臨床分期越晚,miR-124的表達(dá)水平越低。同時(shí)也與患者的T分期相關(guān),T分期越晚,miR-124的表達(dá)水平越低。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,miR-124在鼻咽癌細(xì)胞和組織中表達(dá)下調(diào),且與鼻咽癌的臨床分期、T分期密切相關(guān),為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能提供了初步依據(jù)。2.miR-124過(guò)表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響選取鼻咽癌細(xì)胞株5-8F和6-10B作為細(xì)胞學(xué)模型,研究miR-124表達(dá)改變對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。首先,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-124 mimics和miR-Ctrl,熒光定量PCR檢測(cè)miR-124表達(dá)的改變,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在5-8F和6-10B中轉(zhuǎn)染miR-124 mimics后,miR-124的表達(dá)分別增高了114.15倍和60.99倍;該結(jié)果顯示,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-124 mimics可有效上調(diào)miR-124的表達(dá)。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞周期檢測(cè)觀察miR-124表達(dá)改變對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖能力的影響。CCK6-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染miR-124 mimics 96h后,5-8F和6-10B細(xì)胞的生長(zhǎng)速度分別降低了36.5%和40.3%(5-8F:F=214.753,P0.001; 6-10B:F=220.420, P0.001)。細(xì)胞周期分布顯示,在5-8F細(xì)胞中,與對(duì)照組相比,miR-124 mimics轉(zhuǎn)染后使G1期細(xì)胞比例顯著增高17.4%(t=25.860,P0.001),S期細(xì)胞比例顯著減少(t=19.452,P0.001)。在6-10B細(xì)胞中,與對(duì)照組相比,miR-124 mimics轉(zhuǎn)染后使G1期細(xì)胞比例顯著增高16%(t=20.086,P0.001),S期細(xì)胞比例顯著減少(t=14.769,P0.001),G2+M期細(xì)胞比例無(wú)顯著改變。該結(jié)果表明,miR-124過(guò)表達(dá)通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1期阻滯,抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖。通過(guò)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)評(píng)估過(guò)表達(dá)miR-124對(duì)5-8F及6-10B細(xì)胞轉(zhuǎn)移功能影響。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-124過(guò)表達(dá)使5-8F及6-10B遷移能力下降76%(t=30.948,P0.001)、54% (t=20.100,P0.001)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),miR－124過(guò)表達(dá)使5-8F及6-10B侵襲能力下降65.8%(t=26.929,P0.001)、62.6% (t=19.759,P0.001)。結(jié)果表明,miR-124過(guò)表達(dá)抑制鼻咽細(xì)胞株的遷移及侵襲能力。在此結(jié)果的基礎(chǔ)上,為了進(jìn)一步研究miR-124對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的生物特性的影響。我們構(gòu)建miR-124慢病毒表達(dá)載體,依據(jù)慢病毒載體所攜帶的GFP標(biāo)記,采用流式細(xì)胞儀分選(fluorescence activated cell sorter, FACS)獲得GFP陽(yáng)性細(xì)胞群,建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-124的鼻咽癌細(xì)胞株lv-miR-124/5-8F和lv-miR-124/6-10B。利用穩(wěn)定表達(dá)的miR-124的細(xì)胞株,通過(guò)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了miR-124過(guò)表達(dá)對(duì)癌細(xì)胞克隆形成能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-124過(guò)表達(dá)使5-8F和6-10B細(xì)胞的克隆形成率分別降低46%(t=7.190,P=0.002)和33%(t=4.051,P=0.015)。為進(jìn)一步研究miR-124過(guò)表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤的能力影響,我們還將lv-miR-124/5-8F細(xì)胞接種裸鼠皮下,建立鼻咽癌異位移植瘤模型。結(jié)果表明,接種后第7天成瘤的能力出現(xiàn)顯著性差異,lv-miR-124/5-8F細(xì)胞所形成的腫瘤體積顯著小于對(duì)照細(xì)胞(P0.001)。至第15天,接種lv-miR-124/5-8F細(xì)胞形成的腫瘤體積比對(duì)照組細(xì)胞的腫瘤體積降低(t=-6.149,P0.001),且免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-124過(guò)表達(dá)后顯著降低了Ki-67和PCNA的表達(dá)(Ki67:Z=3.878, P0.001; PCNA:Z=5.300, P0.001)。此外,我們建立了肝包膜下移植瘤肺癌轉(zhuǎn)移模型評(píng)估m(xù)iR-124過(guò)表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移的能力影響。結(jié)果表明,肝包膜下種植lv-miR-124/5-8F,25天后,肝臟局部轉(zhuǎn)移及肺轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)明顯較對(duì)照組lv-Ctrl/5-8F減少。以上結(jié)果顯示,miR-124參與了鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制,其表達(dá)失調(diào)與鼻咽癌細(xì)胞的體外增殖及轉(zhuǎn)移能力和體內(nèi)成瘤及轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān),在鼻咽癌中扮演候選抑癌基因角色。3.miR-124抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移相關(guān)分子機(jī)理的探討利用PicTar、TargetScan和PITA三大數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miR-124進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),我們從眾多的靶基因中選擇出來(lái)27個(gè)與腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因。在lv-miR-124/5-8F細(xì)胞中,利用PCR檢測(cè)候選的27個(gè)靶基因發(fā)現(xiàn),Foxq1較其他26個(gè)基因明顯下調(diào),同時(shí)Westernbolting實(shí)驗(yàn)證實(shí)了過(guò)表達(dá)miR-124下調(diào)Foxq1的表達(dá)。我們檢測(cè)了7株鼻咽癌細(xì)胞株及NP69中Foxq1的mRNA水平及蛋白水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在鼻咽癌細(xì)胞株中,Foxql的表達(dá)較NP69明顯上調(diào)。因此選擇Foxq1為miR-124的候選靶基因,結(jié)果可靠。于是,我們構(gòu)建了重組質(zhì)粒psicheck.2-wt Foxql 3'UTR和突變質(zhì)粒psicheck.2-mut Foxql 3'UTR,以便進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。將上述重組質(zhì)粒和miR-124 mimics、miR-Ctrl共轉(zhuǎn)染5-8F及HK-293T細(xì)胞,檢測(cè)熒光素酶活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)psicheck.2-wt3'UTR和miR-124 mimics共轉(zhuǎn)染可顯著降低熒光素酶的活性(t=7.744,P0.001),表明miR-124與Foxq1 3'UTR可特異性結(jié)合。在以上結(jié)果的基礎(chǔ)上,轉(zhuǎn)染shFoxq1下調(diào)5-8F的Foxq1表達(dá),觀察Foxq1下調(diào)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移及轉(zhuǎn)移的能力影響。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Foxq1沉默后使5-8F細(xì)胞的增殖能力降低35%(F=43.89,P0.001),細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)表明,Foxql沉默后使5-8F細(xì)胞的遷移能力降低33.9%(t=13.155,P0.001),細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)表明,Foxq1沉默后使5-8F細(xì)胞的侵襲能力降低44.9%(t=-17.13,P0.001), Foxq1沉默后與miR-124過(guò)表達(dá)引起類似的抑制作用。與此同時(shí),Foxq1沉默后使6-10B細(xì)胞取得相似的結(jié)果。隨后,我們干擾Foxq1觀察其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的抑制作用是否與過(guò)表達(dá)miR-124一致,結(jié)果發(fā)現(xiàn),干擾Foxq1可以取得與過(guò)表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移及轉(zhuǎn)移類似的結(jié)果。此外,我們?cè)贗v-miR-124/5-8F細(xì)胞中進(jìn)一步過(guò)表達(dá)Foxq1,結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染96h后Foxq1過(guò)表達(dá)可顯著逆轉(zhuǎn)miR-124的增殖抑制作用(F=36.7,P0.001)；同時(shí),Foxq1過(guò)表達(dá)可顯著逆轉(zhuǎn)miR-124的遷移抑制作用(t=20.65,P0.001)及侵襲抑制作用(t=14.313,P0.001)。該結(jié)果表明,miR-124抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的生物學(xué)功能是通過(guò)調(diào)控Foxq1的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。4.鼻咽癌組織標(biāo)本中Foxq1與miR-124表達(dá)之間的相關(guān)性利用PCR在178例非角化未分化型鼻咽癌組織中,Foxq1的平均表達(dá)水平要比55例鼻咽慢性炎組織升高60%(t=16.910,P0.001)。我們發(fā)現(xiàn)Foxq1與臨床分期密切相關(guān),臨床分期越晚,Foxq1的表達(dá)水平越高。同時(shí)也與患者的T分期相關(guān),T分期越晚,Foxq1的表達(dá)水平越高。miR-124的表達(dá)水平與Foxq1表達(dá)水平密切相關(guān)(r=-0.565,P0.001)。同時(shí),組織免疫組化實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Foxq1隨著臨床分期的增加表達(dá)增加,與PCR結(jié)果類似(r=-0.605, P0.001)。Foxq1組織中免疫組化的水平與miR-124表達(dá)密切相關(guān)。綜合以上結(jié)果,闡明了miR-124通過(guò)調(diào)控靶基因Foxq1抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移。結(jié)論1.miR-124在鼻咽癌細(xì)胞株和組織中表達(dá)下調(diào),且與鼻咽癌的臨床分期,T分期成負(fù)性相關(guān)性。2. miR-124在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移及轉(zhuǎn)移能力；同時(shí),在裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)中,抑制鼻咽癌的細(xì)胞增殖能力,在肝癌肺轉(zhuǎn)移模型中,抑制鼻咽癌的轉(zhuǎn)移能力,發(fā)揮候選抑癌基因的功能。3.在鼻咽癌細(xì)胞系中,Foxq1表達(dá)上調(diào),同時(shí)促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移及轉(zhuǎn)移能力；miR-124靶向Foxq1調(diào)節(jié)鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移及轉(zhuǎn)移能力。4. Foxq1在鼻咽癌組織中表達(dá)上調(diào),與臨床分期及T分期成正性相關(guān)；與miR-124表達(dá)呈負(fù)性相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：鼻咽癌 miR-124 Foxq1 增殖 轉(zhuǎn)移
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R739.63
【目錄】：

• 摘要3-14
• ABSTRACT14-31
• 前言31-36
• 技術(shù)路錢36-37
• 第一章 鼻咽癌中miR-124表達(dá)特性的鑒定37-51
• 一、材料與方法37-41
• 二、結(jié)果41-47
• 三、討論47-51
• 第二章 miR-124表達(dá)失調(diào)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響51-83
• 一、材料與方法51-62
• 二、結(jié)果62-78
• 三、討論78-83
• 第三章 miR-124抑制鼻咽癌增殖及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理83-120
• 一、材料與方法83-94
• 二、結(jié)果94-115
• 三、討論115-120
• 第四章 鼻咽癌組織miR-124與Foxq1表達(dá)的相關(guān)性120-129
• 一、材料和方法120-121
• 二、結(jié)果121-125
• 三、討論125-129
• 參考文獻(xiàn)129-136
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文136-137
• 英文縮寫(xiě)注解137-138
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)證明138-139
• 全文小結(jié)139-140
• 致謝140-141

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本文編號(hào)：646235