發(fā)布時間：2017-08-09 16:26

  本文關(guān)鍵詞：miR-124調(diào)控靶基因Foxq1抑制鼻咽癌增殖及轉(zhuǎn)移的分子機制研究

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【摘要】：目的和意義鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我國南方及東南亞地區(qū)常見的一種惡性腫瘤,其發(fā)病與愛波斯坦-巴爾病毒(Epstein Barr Virus, EBV)感染、環(huán)境因素以及基因易感性等因素密切相關(guān)。鼻咽癌為一種來源于鼻咽上皮的高度惡性的腫瘤,具有高度局部轉(zhuǎn)移及早期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移特征。放射治療和輔助性化療雖極大的提高了鼻咽癌治愈率,但總體5年平均生存率仍維持在70%左右。大約30-40%患者診斷為晚期鼻咽癌,其中相當(dāng)一部分患者,經(jīng)過治療后的4年內(nèi)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)。迄今為止,鼻咽癌發(fā)病的分子機制尚未完全闡明。因此,進(jìn)一步研究鼻咽癌的發(fā)病機制及尋找一種可能的早期診斷的分子標(biāo)志物極為迫切。MicroRNA (miRNA)是一類大小約為19-25個核苷酸(nucleotide, nt)的非編碼單鏈小分子RNA,由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的大小約為70-100nt的單鏈RNA前體(pre-miRNA)經(jīng)過Dicer酶剪切加工后生成,通過與靶基因mRNA的3’非編碼區(qū)(3'untranslated region,3'UTR)互補匹配導(dǎo)致該mRNA的降解。大多數(shù)miRNA與底物mRNA不完全配對結(jié)合,通過轉(zhuǎn)錄后抑制翻譯來調(diào)控基因表達(dá)。miRNA基因以單拷貝、多拷貝或基因簇等多種形式存在于基因組中,而且絕大部分定位于基因間隔區(qū),其轉(zhuǎn)錄獨立于其他基因,并不翻譯成蛋白質(zhì),而是在體內(nèi)代謝過程中發(fā)揮多種調(diào)控作用,包括動植物的組織器官發(fā)育、細(xì)胞分化和凋亡、胰島素分泌、脂肪代謝等多種生命活動。正常細(xì)胞的生長、增殖、發(fā)育、分化和死亡是一個高度有序的過程,而腫瘤的形成正是這一高度有序的過程發(fā)生紊亂所造成的,其發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、多階段、多因素參與的復(fù)雜過程,這一過程涉及到多個基因在時間和空間上的協(xié)調(diào)表達(dá)。除了蛋白編碼基因,最近研究發(fā)現(xiàn)miRNA在腫瘤的發(fā)病機制中發(fā)揮及其重要的作用。miRNA作為一類新型基因調(diào)控劑,其表達(dá)水平在多種腫瘤中發(fā)生改變,通過調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯,影響癌細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、運動、浸潤、轉(zhuǎn)移以及血管生成等生物學(xué)特性,發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用,多角度多層次的參與了腫瘤的演進(jìn)。目前研究表明,miRNAs不僅存在組織及細(xì)胞中,同時存在許多體液,包括血清,血漿,唾液,尿液和羊水。通常把血漿或是血清miRNA認(rèn)為是循環(huán)miRNAs。miRNAs在體液的存在可表示無創(chuàng)癌癥生物學(xué)標(biāo)志物。由于失調(diào)的miRNA表達(dá)的早期事件在腫瘤發(fā)生,檢測循環(huán)miRNA水平也可用于早期癌癥診斷和治療反應(yīng)的預(yù)測以及潛在的新病人選擇標(biāo)準(zhǔn)的臨床試驗中的作用。2008年,首次發(fā)現(xiàn)miR-21在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者的血清中表達(dá)上調(diào),且與患者的無復(fù)發(fā)生存期密切相關(guān)。通過檢測的miR-141的血清水平,所以能夠區(qū)分患者患有前列腺癌的健康受試者。在前列腺癌中15血清miRNAs表達(dá)上調(diào),如miR-16, miR-92a和miR-92b等。Tsujiura等研究表明在胃癌患者中,血清miR-21和miR-106B顯著高于正�；颊�,切除胃癌后,血清miR-21和miR-106B表達(dá)較術(shù)前減少。迄今為止,超過100個研究評估的潛在用途的血清或血漿的miRNA在不同類型的癌癥生物標(biāo)志物。在鼻咽癌中,研究發(fā)現(xiàn)眾多的microRNAs表達(dá)失調(diào),如miR-26a, miR-9, miR-378, miR-10b, miR-144, miR-214等。而這些表達(dá)失調(diào)的microRNAs參與了鼻咽癌的發(fā)生及發(fā)展的過程。miR-26在鼻咽癌細(xì)胞系及鼻咽癌組織標(biāo)本中表達(dá)下調(diào),靶向EZH2參與抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖及侵襲作用。同樣的,miR-9在鼻咽癌表達(dá)下調(diào),并通過靶向CXCR4調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。然而,miR-378在鼻咽癌中表達(dá)上調(diào),并通過靶向TOB2促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖,轉(zhuǎn)移及侵襲能力。miR-10b在鼻咽癌細(xì)胞系中高表達(dá),下調(diào)miR-10b的表達(dá),可抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力。截止2015年,約有32個microRNA參與鼻咽癌疾病發(fā)生及發(fā)展。miRNAs在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色,且循環(huán)的miRNAs可作為臨床無創(chuàng)的檢測的生物學(xué)標(biāo)志物。然而在鼻咽癌中,循環(huán)miRNA研究報道甚少。因此我們課題組于2013年,利用microRNA-array篩查血漿中的miRNAs表達(dá)譜的改變并通過qPCR加以驗證,發(fā)現(xiàn)鼻咽癌病人的血漿miR-124較非癌病人中表達(dá)明顯下調(diào)。目前為止,miR-124在不同類型腫瘤均有見報道,但miR-124在鼻咽癌組織表達(dá)情況及扮演什么角色尚未見研究。因此我們選擇miR-124作為我們的研究對象。miR-124全長為21nt,首先從小鼠克隆而來,隨后其表達(dá)水平在人類胚胎干細(xì)胞被證實。2007年,Visvanathan J等發(fā)現(xiàn)在胚胎神經(jīng)系統(tǒng)中,參與了神經(jīng)突的形成；同時Makeyev EV等證實了促進(jìn)了神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。在腫瘤研究中,Silber J最早發(fā)現(xiàn)在miR-124多形性膠質(zhì)瘤中及在腦腫瘤干細(xì)胞中表達(dá)明顯降低,同時證實miR-124抑制細(xì)胞增殖能力。此后miR-124發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、肝癌、膀胱癌等中表達(dá)下調(diào),發(fā)現(xiàn)miR-124抑制細(xì)胞的增殖,轉(zhuǎn)移,侵襲等能力。但在鼻咽癌中,尚未見文獻(xiàn)報道。miR-124的表達(dá)失調(diào)在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中又扮演著何種角色及其分子機理等一系列問題都值得我們深入探討。基于miR-124的研究現(xiàn)狀及其在鼻咽癌癌變分子機制中的潛在意義,本課題的研究目的為明確miR-124在鼻咽癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)特性,探討miR-124對鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及其在鼻咽癌發(fā)病機制中所發(fā)揮的重要作用,闡明miR-124在鼻咽癌中發(fā)揮生物學(xué)功能的分子機理,為深入理解鼻咽癌發(fā)病的分子機制和尋找新的分子靶向治療靶點奠定理論基礎(chǔ)。材料和方法1.細(xì)胞培養(yǎng)人鼻咽癌細(xì)胞株5-8F、6-10B、CNE1、CNE2、C666-1、HONE-1和SUNE-1采用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗RPMI 1640培養(yǎng)基,NP69采用KMSF培養(yǎng)基,HK-293T細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下傳代培養(yǎng)。采用對數(shù)期生長的細(xì)胞用于實驗。2.臨床標(biāo)本收集178例鼻咽癌組織和55例非癌鼻咽上皮組織均來源于南方醫(yī)院耳鼻喉科標(biāo)本庫,所有標(biāo)本均為鼻咽部活檢組織,經(jīng)病理確診為鼻咽癌,所有患者均尚未接受放化療治療。本研究經(jīng)南方醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),所有患者均簽署知情同意書。3.載體構(gòu)建[1]慢病毒載體pLVTHM/miR-124該載體經(jīng)慢病毒包裝、感染細(xì)胞后可穩(wěn)定過表達(dá)miR-124,通過Real-time PCR及基因測序證實該載體構(gòu)建成功。[2] psicheck.2-Foxql wt 3'UTR和psicheck.2-Foxql mut 3'UTR以正常人外周血基因組DNA為模板,擴增Foxql 3'UTR (185bp),將該片段克隆到psicheck.2-control vector,得到重組質(zhì)粒psicheck.2-Foxql wt 3'UTR,然后將該重組質(zhì)粒進(jìn)行定點突變,得到突變質(zhì)粒psicheck.2-Foxql mut 3UTR。[3]過表達(dá)的Foxq1慢病毒購買于上海吉瑪生物技術(shù)有限責(zé)任公司。4.細(xì)胞轉(zhuǎn)染[1] miRNA瞬時轉(zhuǎn)染：采用陽離子脂質(zhì)體法進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染,操作按LipofectamineTM 2000試劑說明書進(jìn)行。[2] 慢病毒感染將慢病毒懸液感染鼻咽癌細(xì)胞,48h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光(green fluorescent protein, GFP)發(fā)光情況。利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分選獲得GFP陽性細(xì)胞,分別建立過表達(dá)miR-124、過表達(dá)Foxql鼻咽癌細(xì)胞株。5. miRNA與質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染：操作按LipofectamineTM 2000試劑說明書進(jìn)行。24孔板中miRNA的轉(zhuǎn)染量為50nM,重組質(zhì)粒psicheck.2-Foxq1 wt 3'UTR和psicheck.2-Foxq1 mut 3'UTR的轉(zhuǎn)染量為100ng。6.熒光定量PCR抽提細(xì)胞和組織的總RNA和小分子RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,采用sybr green法進(jìn)行PCR擴增,通過相對定量以2-△△Ct值代表基因的相對表達(dá)強度。7. Western blot抽提細(xì)胞總蛋白,采用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測定,然后10% SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫雜交、化學(xué)發(fā)光法顯影。8.雙熒光素酶活性檢測將熒光素酶報告基因載體瞬時轉(zhuǎn)染24h后,將細(xì)胞裂解,然后利用GloMaxTM 96 Microplate Luminometer發(fā)光檢測儀分別測定Firefly luciferase和Renilla luciferase活性。以Firefly luciferase與Renilla luciferase活性的比值作為熒光素酶的相對活性,進(jìn)行不同樣品間的比較。9.細(xì)胞生物學(xué)實驗[1] CCK-8細(xì)胞增殖實驗將1x103個細(xì)胞接種于96孔板中,每孔體積200μl,每組5孔,同時設(shè)空白對照,分別培養(yǎng)24h、48h、72h和96h。每孔加入CCK-8溶液10μl,37℃孵育2h后終止孵育,以空白對照孔調(diào)零,酶標(biāo)儀上450nm測定各孔吸光度值(OD值),以相對應(yīng)OD比值表示細(xì)胞增殖能力大小。[2] 平板克隆形成實驗接種100個細(xì)胞到12孔板中,保證細(xì)胞分散均勻,培養(yǎng)2周。出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞克隆時,終止培養(yǎng),棄去培養(yǎng)基,多聚甲醛固定后結(jié)晶紫染色,顯微鏡下計數(shù)形成的克隆數(shù)(≥50個細(xì)胞為一個克隆)。平板克隆形成率=形成克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。[3] 細(xì)胞周期檢測采用碘化丙錠(propidium iodide, PI)單染法檢測細(xì)胞周期分布。將細(xì)胞固定、Rnase A消化、PI染色后,流式細(xì)胞儀檢測。[4] 細(xì)胞遷移實驗 將細(xì)胞重懸于無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,每個Transwell小室中加入細(xì)胞,培養(yǎng)板每孔加入10%胎牛血清培養(yǎng)基,培養(yǎng)24h后取出Transwell小室,固定染色顯微鏡下觀察穿過膜的細(xì)胞。[5] 細(xì)胞侵襲實驗Matrigel基質(zhì)膠凍融后,向Transwell小室中均勻加入50ul,37℃培育12h后,余操作同細(xì)胞遷移實驗。10.動物實驗[1]裸鼠皮下成瘤實驗分別將過表達(dá)miR-124的lv-miR-124/5-8F和對照組細(xì)胞lv-miR-Ctrl/5-8F隨機接種于12只裸鼠后背部皮下,接種細(xì)胞數(shù)為5×105,每組包括6只。每兩天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長短徑一次,按如下公式計算腫瘤體積：v=(Dxd2)/2,其中D代表腫瘤最長徑,而d代表腫瘤最短徑。待腫瘤體積超過500mm3,將實驗動物處死,腫瘤組織取出后經(jīng)福爾馬林固定,石蠟包埋,切片后HE染色,光學(xué)顯微鏡觀察。[2]肝癌肺轉(zhuǎn)移模型分別將過表達(dá)miR-124/Iv-miR-124/5-8F和對照組細(xì)胞lv-miR-Ctrl/5-8F隨機接種于10只裸鼠的肝包膜下,接種細(xì)胞數(shù)為1x106,每組包括5只。25天后,給予裸鼠安樂死后,取出裸鼠的肝臟及雙肺,通過光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡及免疫組化觀察肝臟及雙肺轉(zhuǎn)移瘤情況。11.免疫組化將石蠟切片進(jìn)行脫蠟、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉、抗體孵育、DAB顯色、復(fù)染、透明、封片等步驟進(jìn)行,免疫組化的檢測結(jié)果進(jìn)行半定量判定。隨機選取5個高倍視野,如果核陽性的腫瘤細(xì)胞數(shù)超過50%,則認(rèn)為該樣本陽性。然后,按照細(xì)胞染色強度進(jìn)行評分：棕褐色(3分),棕黃色(2分),淡黃色(1分),無著色(0分)。12.統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,CCK-8細(xì)胞增殖實驗和動物實驗皮下成瘤體積的比較采用析因設(shè)計的方差分析；免疫組化染色強度的比較采用Mann-Whitney U檢驗；鼻咽癌組織中miR-124和Foxql表達(dá)水平的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析；其他實驗中涉及到兩組數(shù)據(jù)之間的比較均采用兩獨立樣本的t檢驗,而三組或三組以上數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析,方差齊性時,采用ANOVA,其多重比較采用LSD法；方差不齊時采用近似F檢驗Welch法,多重比較采用Dunnett T3。P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1.miR-124在鼻咽癌細(xì)胞株及鼻咽癌組織標(biāo)本中表達(dá)及臨床特征分析熒光定量PCR結(jié)果顯示,在7種鼻咽癌細(xì)胞株,即5-8F、6-10B、CNE1、 CNE2、C666-1、HONE1和SUNE-1, miR-124的表達(dá)均低于永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP69；而在178例非角化未分化型鼻咽癌組織中,miR-124的平均表達(dá)水平要比55例鼻咽慢性炎組織降低60%(t=4.906, P0.001)。miR-124表達(dá)與鼻咽癌患者的性別及年齡無明顯相關(guān)性。我們發(fā)現(xiàn)miR-124與臨床分期密切相關(guān),臨床分期越晚,miR-124的表達(dá)水平越低。同時也與患者的T分期相關(guān),T分期越晚,miR-124的表達(dá)水平越低。上述實驗結(jié)果表明,miR-124在鼻咽癌細(xì)胞和組織中表達(dá)下調(diào),且與鼻咽癌的臨床分期、T分期密切相關(guān),為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能提供了初步依據(jù)。2.miR-124過表達(dá)對鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響選取鼻咽癌細(xì)胞株5-8F和6-10B作為細(xì)胞學(xué)模型,研究miR-124表達(dá)改變對鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。首先,瞬時轉(zhuǎn)染miR-124 mimics和miR-Ctrl,熒光定量PCR檢測miR-124表達(dá)的改變,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在5-8F和6-10B中轉(zhuǎn)染miR-124 mimics后,miR-124的表達(dá)分別增高了114.15倍和60.99倍;該結(jié)果顯示,瞬時轉(zhuǎn)染miR-124 mimics可有效上調(diào)miR-124的表達(dá)。通過CCK-8實驗和細(xì)胞周期檢測觀察miR-124表達(dá)改變對鼻咽癌細(xì)胞增殖能力的影響。CCK6-8實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染miR-124 mimics 96h后,5-8F和6-10B細(xì)胞的生長速度分別降低了36.5%和40.3%(5-8F:F=214.753,P0.001; 6-10B:F=220.420, P0.001)。細(xì)胞周期分布顯示,在5-8F細(xì)胞中,與對照組相比,miR-124 mimics轉(zhuǎn)染后使G1期細(xì)胞比例顯著增高17.4%(t=25.860,P0.001),S期細(xì)胞比例顯著減少(t=19.452,P0.001)。在6-10B細(xì)胞中,與對照組相比,miR-124 mimics轉(zhuǎn)染后使G1期細(xì)胞比例顯著增高16%(t=20.086,P0.001),S期細(xì)胞比例顯著減少(t=14.769,P0.001),G2+M期細(xì)胞比例無顯著改變。該結(jié)果表明,miR-124過表達(dá)通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1期阻滯,抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖。通過細(xì)胞遷移實驗及細(xì)胞侵襲實驗評估過表達(dá)miR-124對5-8F及6-10B細(xì)胞轉(zhuǎn)移功能影響。細(xì)胞遷移實驗結(jié)果顯示,miR-124過表達(dá)使5-8F及6-10B遷移能力下降76%(t=30.948,P0.001)、54% (t=20.100,P0.001)。細(xì)胞侵襲實驗發(fā)現(xiàn),miR－124過表達(dá)使5-8F及6-10B侵襲能力下降65.8%(t=26.929,P0.001)、62.6% (t=19.759,P0.001)。結(jié)果表明,miR-124過表達(dá)抑制鼻咽細(xì)胞株的遷移及侵襲能力。在此結(jié)果的基礎(chǔ)上,為了進(jìn)一步研究miR-124對鼻咽癌細(xì)胞的生物特性的影響。我們構(gòu)建miR-124慢病毒表達(dá)載體,依據(jù)慢病毒載體所攜帶的GFP標(biāo)記,采用流式細(xì)胞儀分選(fluorescence activated cell sorter, FACS)獲得GFP陽性細(xì)胞群,建立穩(wěn)定過表達(dá)miR-124的鼻咽癌細(xì)胞株lv-miR-124/5-8F和lv-miR-124/6-10B。利用穩(wěn)定表達(dá)的miR-124的細(xì)胞株,通過平板克隆形成實驗檢測了miR-124過表達(dá)對癌細(xì)胞克隆形成能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-124過表達(dá)使5-8F和6-10B細(xì)胞的克隆形成率分別降低46%(t=7.190,P=0.002)和33%(t=4.051,P=0.015)。為進(jìn)一步研究miR-124過表達(dá)對鼻咽癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤的能力影響,我們還將lv-miR-124/5-8F細(xì)胞接種裸鼠皮下,建立鼻咽癌異位移植瘤模型。結(jié)果表明,接種后第7天成瘤的能力出現(xiàn)顯著性差異,lv-miR-124/5-8F細(xì)胞所形成的腫瘤體積顯著小于對照細(xì)胞(P0.001)。至第15天,接種lv-miR-124/5-8F細(xì)胞形成的腫瘤體積比對照組細(xì)胞的腫瘤體積降低(t=-6.149,P0.001),且免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-124過表達(dá)后顯著降低了Ki-67和PCNA的表達(dá)(Ki67:Z=3.878, P0.001; PCNA:Z=5.300, P0.001)。此外,我們建立了肝包膜下移植瘤肺癌轉(zhuǎn)移模型評估m(xù)iR-124過表達(dá)對鼻咽癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移的能力影響。結(jié)果表明,肝包膜下種植lv-miR-124/5-8F,25天后,肝臟局部轉(zhuǎn)移及肺轉(zhuǎn)移個數(shù)明顯較對照組lv-Ctrl/5-8F減少。以上結(jié)果顯示,miR-124參與了鼻咽癌的發(fā)病機制,其表達(dá)失調(diào)與鼻咽癌細(xì)胞的體外增殖及轉(zhuǎn)移能力和體內(nèi)成瘤及轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān),在鼻咽癌中扮演候選抑癌基因角色。3.miR-124抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移相關(guān)分子機理的探討利用PicTar、TargetScan和PITA三大數(shù)據(jù)庫對miR-124進(jìn)行靶基因預(yù)測,我們從眾多的靶基因中選擇出來27個與腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因。在lv-miR-124/5-8F細(xì)胞中,利用PCR檢測候選的27個靶基因發(fā)現(xiàn),Foxq1較其他26個基因明顯下調(diào),同時Westernbolting實驗證實了過表達(dá)miR-124下調(diào)Foxq1的表達(dá)。我們檢測了7株鼻咽癌細(xì)胞株及NP69中Foxq1的mRNA水平及蛋白水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在鼻咽癌細(xì)胞株中,Foxql的表達(dá)較NP69明顯上調(diào)。因此選擇Foxq1為miR-124的候選靶基因,結(jié)果可靠。于是,我們構(gòu)建了重組質(zhì)粒psicheck.2-wt Foxql 3'UTR和突變質(zhì)粒psicheck.2-mut Foxql 3'UTR,以便進(jìn)行雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灐⑸鲜鲋亟M質(zhì)粒和miR-124 mimics、miR-Ctrl共轉(zhuǎn)染5-8F及HK-293T細(xì)胞,檢測熒光素酶活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)psicheck.2-wt3'UTR和miR-124 mimics共轉(zhuǎn)染可顯著降低熒光素酶的活性(t=7.744,P0.001),表明miR-124與Foxq1 3'UTR可特異性結(jié)合。在以上結(jié)果的基礎(chǔ)上,轉(zhuǎn)染shFoxq1下調(diào)5-8F的Foxq1表達(dá),觀察Foxq1下調(diào)對鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移及轉(zhuǎn)移的能力影響。CCK-8實驗結(jié)果表明,Foxq1沉默后使5-8F細(xì)胞的增殖能力降低35%(F=43.89,P0.001),細(xì)胞遷移實驗表明,Foxql沉默后使5-8F細(xì)胞的遷移能力降低33.9%(t=13.155,P0.001),細(xì)胞侵襲實驗表明,Foxq1沉默后使5-8F細(xì)胞的侵襲能力降低44.9%(t=-17.13,P0.001), Foxq1沉默后與miR-124過表達(dá)引起類似的抑制作用。與此同時,Foxq1沉默后使6-10B細(xì)胞取得相似的結(jié)果。隨后,我們干擾Foxq1觀察其對鼻咽癌細(xì)胞的抑制作用是否與過表達(dá)miR-124一致,結(jié)果發(fā)現(xiàn),干擾Foxq1可以取得與過表達(dá)對鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移及轉(zhuǎn)移類似的結(jié)果。此外,我們在Iv-miR-124/5-8F細(xì)胞中進(jìn)一步過表達(dá)Foxq1,結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染96h后Foxq1過表達(dá)可顯著逆轉(zhuǎn)miR-124的增殖抑制作用(F=36.7,P0.001)；同時,Foxq1過表達(dá)可顯著逆轉(zhuǎn)miR-124的遷移抑制作用(t=20.65,P0.001)及侵襲抑制作用(t=14.313,P0.001)。該結(jié)果表明,miR-124抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的生物學(xué)功能是通過調(diào)控Foxq1的表達(dá)來實現(xiàn)的。4.鼻咽癌組織標(biāo)本中Foxq1與miR-124表達(dá)之間的相關(guān)性利用PCR在178例非角化未分化型鼻咽癌組織中,Foxq1的平均表達(dá)水平要比55例鼻咽慢性炎組織升高60%(t=16.910,P0.001)。我們發(fā)現(xiàn)Foxq1與臨床分期密切相關(guān),臨床分期越晚,Foxq1的表達(dá)水平越高。同時也與患者的T分期相關(guān),T分期越晚,Foxq1的表達(dá)水平越高。miR-124的表達(dá)水平與Foxq1表達(dá)水平密切相關(guān)(r=-0.565,P0.001)。同時,組織免疫組化實驗證實了Foxq1隨著臨床分期的增加表達(dá)增加,與PCR結(jié)果類似(r=-0.605, P0.001)。Foxq1組織中免疫組化的水平與miR-124表達(dá)密切相關(guān)。綜合以上結(jié)果,闡明了miR-124通過調(diào)控靶基因Foxq1抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移。結(jié)論1.miR-124在鼻咽癌細(xì)胞株和組織中表達(dá)下調(diào),且與鼻咽癌的臨床分期,T分期成負(fù)性相關(guān)性。2. miR-124在體外細(xì)胞實驗抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移及轉(zhuǎn)移能力；同時,在裸鼠皮下成瘤實驗中,抑制鼻咽癌的細(xì)胞增殖能力,在肝癌肺轉(zhuǎn)移模型中,抑制鼻咽癌的轉(zhuǎn)移能力,發(fā)揮候選抑癌基因的功能。3.在鼻咽癌細(xì)胞系中,Foxq1表達(dá)上調(diào),同時促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移及轉(zhuǎn)移能力；miR-124靶向Foxq1調(diào)節(jié)鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移及轉(zhuǎn)移能力。4. Foxq1在鼻咽癌組織中表達(dá)上調(diào),與臨床分期及T分期成正性相關(guān)；與miR-124表達(dá)呈負(fù)性相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：鼻咽癌 miR-124 Foxq1 增殖 轉(zhuǎn)移
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.63
【目錄】：

• 摘要3-14
• ABSTRACT14-31
• 前言31-36
• 技術(shù)路錢36-37
• 第一章 鼻咽癌中miR-124表達(dá)特性的鑒定37-51
• 一、材料與方法37-41
• 二、結(jié)果41-47
• 三、討論47-51
• 第二章 miR-124表達(dá)失調(diào)對鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響51-83
• 一、材料與方法51-62
• 二、結(jié)果62-78
• 三、討論78-83
• 第三章 miR-124抑制鼻咽癌增殖及轉(zhuǎn)移的分子機理83-120
• 一、材料與方法83-94
• 二、結(jié)果94-115
• 三、討論115-120
• 第四章 鼻咽癌組織miR-124與Foxq1表達(dá)的相關(guān)性120-129
• 一、材料和方法120-121
• 二、結(jié)果121-125
• 三、討論125-129
• 參考文獻(xiàn)129-136
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文136-137
• 英文縮寫注解137-138
• 統(tǒng)計學(xué)證明138-139
• 全文小結(jié)139-140
• 致謝140-141

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本文編號：646235