本文關鍵詞：心肌成纖維細胞來源的exosome在血管緊張素-2誘導的心肌肥大中的作用及機制研究

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【摘要】：研究背景心肌肥大是長期高血壓、冠心病、瓣膜性心臟病、肥厚性心肌病等多種心臟疾病的共同病理過程。心肌肥大的基本特征是心肌細胞體積增大、蛋白質合成速率增加、膠原纖維密度增加、肌節(jié)數量增加與結構重組以及胚胎期基因的重新表達。盡管早期的心肌肥大被認為是一種應激狀態(tài)下的代償反應,但是長期適應不良性心肌肥大往往伴隨著心室擴張、室壁變薄,最終導致心輸出量進行性下降、心力衰竭加重和心源性猝死發(fā)生率的增加。心肌肥大的主要誘發(fā)因素包括機械刺激及多種神經體液因子,前者包括各種壓力負荷、容量負荷的刺激,后者包括兒茶酚胺、Ang Ⅱ、ET-1、心房利鈉肽(ANP)等,另外某些生長因子如表皮生長因子(EGF)、血小板源性生長因子(PDGF)、轉化生長因子(TGF)也可誘導心肌肥大。介導病理性心肌肥大刺激與基因活化的信號通路有多條,其中MAPK途徑起著至關重要的作用。MAPK家族有ERK、JNK、p38三個主要成員。腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin system, RAS),又稱為腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS),對維持人體血壓、電解質與體液平衡、心血管系統發(fā)育與功能意義重大�，F在認為心肌局部RAS在促進心肌重構中的作用,可能較循環(huán)RAS更為重要。目前認為在心肌重構中起主導作用的Ang Ⅱ受體是Ang Ⅱ 1型受體(Ang Ⅱ typel receptor, AT1R), Ang Ⅱ 2型受體(Ang Ⅱ type2 receptor, AT2R)的作用尚存在爭議。RAS持續(xù)激活可使心肌發(fā)生肥大、纖維化和壞死,損害心臟功能,最終導致心臟功能由代償逐漸走向失代償。心肌成纖維細胞約占正常心肌組織細胞總數的60%-70%,體積約占正常心臟體積的三分之一。心肌成纖維細胞除了產生細胞外基質、為心肌細胞提供支持、參與損傷后修復外,還可以通過分泌Ang Ⅱ、TGFβ1、FGF-1、exosome等影響心肌細胞的生長發(fā)育與舒縮功能。Exosome(外泌體)是一種細胞分泌的具有杯狀形態(tài)、直徑約為30-100nm的微囊泡�；舅械募毎寄芊置趀xosome, exosome還天然存在于體液中,攜帶處于不同狀態(tài)下的細胞產生的蛋白質、miRNA、長鏈非編碼RNA(lncRNA)及mRNA等物質。近年來,exosome因其在細胞間訊的重要作用正得到廣泛的關注。本研究旨在從RAS角度揭示心肌成纖維細胞exosome與心肌肥大、心力衰竭的關系。研究目的1.建立心肌成纖維細胞exosome提取體系；2.觀察心肌成纖維細胞exosome對心肌細胞肥大的影響,并探討其機制。研究方法1.細胞培養(yǎng)本實驗采用出生1-3天的SD大鼠心臟分離和培養(yǎng)原代心肌細胞和心肌成纖維細胞作為研究對象。2.Exosome制備與鑒定采用差速離心聯合密度梯度離心法提取exosome;采用透射電鏡與Western blot技術鑒定exosome。3.心肌細胞肥大測定采用心肌細胞平均表面積測量和3H-亮氨酸摻入實驗評估心肌細胞肥大。4.實時定量PCR、Western blot、細胞免疫熒光染色采用2-ΔΔCT坩法測定mRNA目對水平。Western blot、細胞免疫熒光實驗按標準步驟進行。5.Ang Ⅱ檢測采用酶免疫法(The Enzyme Immunoassay, EIA)檢測心肌細胞培養(yǎng)上清及心肌成纖維細胞exosome中的Ang Ⅱ含量。9.統計學分析數據采用平均數±標準誤形式表示。數據統計采用SPSS 17.0進行,P0.05視為具有統計學差異。研究結果1心肌成纖維細胞條件培養(yǎng)基誘導心肌細胞病理性肥大與對照組相比,心肌成纖維細胞條件培養(yǎng)基(CF CM,50%, V/V)刺激心肌細胞48h明顯增加心肌細胞的表面積、蛋白質合成速率,明顯升高心肌細胞ANP、BNP、βMHC mRNA表達水平,降低α MHC mRNA表達水平。2替米沙坦能夠阻斷心肌成纖維細胞條件培養(yǎng)基誘導的心肌細胞肥大相對對照組,CF CM能夠明顯升高心肌細胞AT1R、AT2R mRNA表達水平。血管緊張素Ⅱ 1型受體(AT1R)拮抗劑替米沙坦(50μ M)能夠完全抑制CF CM誘導的心肌細胞肥大,AT2R拮抗劑PD123319(50μ M)能夠部分抑制心肌成纖維細胞條件培養(yǎng)基誘導的心肌細胞肥大,兩種拮抗劑聯用具有協調作用。3心肌成纖維細胞exosome的分離與鑒定本課題中我們采用差速離心聯合密度梯度離心法從心肌成纖維細胞條件培養(yǎng)基中提取exosome。透射電鏡顯示,獲得的心肌成纖維細胞來源的囊泡符合exosome的特征：具有雙層膜結構與杯狀外形；直徑多數在40-100nm之間,平均70nm。Western blot實驗顯示,該種囊泡表達CD9、CD63、HSP70、TSG101這幾種exosome標志性蛋白,calnexin表達陰性。同時,該囊泡還表達波形蛋白(vimentin),可見實驗中分離獲得的囊泡確實是心肌成纖維細胞來源的exosomeo4心肌成纖維細胞exosome能夠被心肌細胞攝取我們將PKH67綠色熒光標記的exosome與心肌細胞共培養(yǎng),然后使用活細胞共聚焦顯微鏡觀察CF exosome與心肌細胞之間的相互作用,發(fā)現心肌成纖維細胞exosome能夠被心肌細胞攝取。5心肌成纖維細胞exosome能夠促進心肌細胞病理性肥大相對于對照組,50 μ g/ml的CF exosome刺激心肌細胞48小時明顯增加心肌細胞的表面積、蛋白質合成速率,明顯升高心肌細胞ANP、BNP、β MHC mRNA 表達水平,降低a MHC、SERCA2a的mRNA表達水平。另外,10 μ g/ml的CF exosome促心肌細胞肥大能力與Ang Ⅱ(1μM)相當。1-50 μ g/ml的CF exosomes降低SERCA2a mRNA表達水平的作用均強于Ang Ⅱ (1μM)。6去除exosome能夠降低心肌成纖維細胞條件培養(yǎng)基的促肥大能力我們采用110,000g離心過夜的方法將exosome從心肌成纖維細胞條件培養(yǎng)基中盡可能地去除。3H-亮氨酸摻入實驗顯示,去除exosome的CF CM的促肥大能力低于正常CF CM,去除exosome降低了CF CM的促肥大能力。7心肌成纖維細胞exosome能夠激活心肌細胞腎素-血管緊張素系統,增加心肌細胞Ang Ⅱ分泌量相對對照組,心肌成纖維細胞exosome與心肌細胞共培養(yǎng)48h顯著升高了心肌細胞血管緊張素原(AGT)、腎素(renin)、AT1R、AT2R的mRNA表達水平,顯著降低了血管緊張素轉化酶-2(ACE2)的mRNA水平。酶免疫實驗(EIA)數據顯示：相對對照組,心肌成纖維細胞exosome與心肌細胞共培養(yǎng)48h明顯增加了心肌細胞Ang Ⅱ分泌量。8 EIA數據顯示,心肌成纖維細胞來源的exosome中不含有Ang Ⅱ。9替米沙坦、PD123319能夠阻斷心肌成纖維細胞exosome的促心肌細胞肥大作用3H-亮氨酸摻入實驗顯示,AT1R拮抗劑替米沙坦、AT2R拮抗劑PD123319能夠濃度依賴性地抑制CF exosome引起的心肌細胞肥大。50μM的替米沙坦與PD123319能夠分別完全阻斷CF exosome引起的心肌細胞肥大,并且二者聯用具有協同作用。10 ERK、JNK、p38通路磷酸化抑制劑能夠抑制心肌成纖維細胞exosome激活的腎素-血管緊張素系統、Ang Ⅱ分泌Western blot實驗結果顯示,CF exosome能夠激活心肌細胞內ERK、JNK、 p38通路。接下來的數據顯示,CF exosome升高心肌細胞AGT、AT1R、AT2R mRNA以及降低ACE2 mRNA的作用能夠被ERK、JNK、p38磷酸化抑制劑所阻斷。另外,CF exosome誘導心肌細胞Ang Ⅱ分泌量增加的作用也可以被ERK、JNK、p38磷酸化抑制劑所阻斷。11抑制ERK、JNK、p38通路磷酸化能夠阻斷心肌成纖維細胞exosome誘導的心肌細胞肥大3H-亮氨酸實驗結果顯示,CF exosome的促心肌細胞肥大作用能夠被ERK、JNK、 p38通路磷酸化抑制劑所阻斷。研究結論1心肌成纖維細胞分泌的exosome能夠通過AngⅡ受體誘導病理性心肌細胞肥大；2心肌成纖維細胞exosome是心肌成纖維細胞誘導病理性心肌細胞肥大的重要途徑；3 ERK、JNK、p38通路磷酸化介導了心肌成纖維細胞exosome誘導的心肌細胞肥大；4心肌成纖維細胞exosome通過激活心肌細胞腎素-血管緊張素系統、促進心肌細胞分泌Ang Ⅱ促進心肌細胞肥大；5心肌成纖維細胞exosome激活腎素-血管緊張素系統依賴于MAPK通路磷酸化；綜上所述,我們發(fā)現心肌成纖維細胞分泌的exosome能夠通過MAPK通路激活心肌細胞腎素-血管緊張素系統,從而誘導心肌細胞產生病理性肥大。研究背景心臟疾病是全世界死亡率最高的疾病’,心力衰竭是各種心臟疾病的終末期階段。目前慢性心衰的防治策略已經從過去單純強心轉變?yōu)槟壳暗恼{節(jié)心肌重構,抑制Ang Ⅱ、兒茶酚胺等神經體液因子的過度激活。心肌重構在組織學上表現為心肌肥大與纖維化；細胞學上表現為心肌細胞肥大、心肌細胞凋亡,心肌成纖維細胞增殖與細胞外基質分泌增加。多種刺激因素均可導致心肌重構,包括機械牽張、壓力負荷及多種神經體液因子如兒茶酚胺、血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ).內皮素-1(ET-1)、心房利鈉肽(ANP)等,某些生長因子如表皮生長因子(EGF)、血小板源性生長因子(PDGF)、轉化生長因子(TGF)也可誘導心肌重構。機械牽張、壓力負荷既可以通過跨膜的細胞外基質受體將刺激信號導入細胞內,也可以通過激活兒茶酚胺、Ang Ⅱ、ET-1等激活心肌細胞肥大與成纖維細胞增殖的相關通路。可見,AngⅡ是心肌重構的重要參與者。Ang Ⅱ可誘導即刻早期反應基因的表達和蛋白質合成的增加,表現為收縮血管,增強心肌收縮力,觸發(fā)心肌肥大、纖維組織和血管增生。然而,這些適應性反應是許多心血管事件的獨立危險因素。在心肌重構的過程中,SERCA2a活性降低是心臟功能失代償、走向心衰的重要機制。轉基因過表達SERCA2a可以調高心臟的泵功能,改善血流動力學狀況,使患者遠期受益。論文Ⅰ中,我們發(fā)現CF exosome能夠促進心肌細胞分泌Ang Ⅱ,降低心肌細胞SERCA2a mRNA表達水平。可見,在體內水平CF exosome可能作為一個種旁分泌途徑參與了Ang Ⅱ誘導的心肌重構。研究目的探索AngⅡ對心肌成纖維細胞exosome的分泌與促肥大作用的影響,闡釋CFexosome在AngⅡ誘導的心肌重構與左心室SERCA2a表達水平降低中的的作用。研究方法1.細胞培養(yǎng)本實驗采用出生1-3天的SD大鼠心臟分離和培養(yǎng)心肌原代細胞和心肌成纖維細胞作為研究對象。2.Exosome制備與鑒定采用超速離心聯合密度梯度離心法提取exosome;采用透射電鏡、Wetern blot技術鑒定CF exosome。3細胞毒性實驗采用美國羅氏公司生產的乳酸脫氫酶試劑盒檢測藥物對心肌成纖維細胞、心肌細胞的毒性。4心肌成纖維細胞與心肌細胞共培養(yǎng)實驗采用Corning公司生產的transwell 24孔板共培養(yǎng)兩種細胞。成纖維細胞接種在上層培養(yǎng)孔中,心肌細胞接種到明膠處理的下層培養(yǎng)孔中,兩種細胞間隔0.4gm孔徑的薄膜共培養(yǎng)48小時。5.心肌細胞肥大測定采用3H-亮氨酸摻入實驗評估心肌細胞肥大。6.Western blot、實時定量PCRWestern blot、實時定量PCR按標準步驟進行操作。采用2-ΔΔCT法測定mRNA相對水平。7.動物分組52只8周雄性C57BL/6J小鼠隨進分為六組：正常對照組、GW4869注射組、DMA注射組、Ang Ⅱ注射組、Ang Ⅱ注射+GW4869注射組、Ang Ⅱ注射+DMA注射組。通過小鼠肩胛間區(qū)皮下植入滲透壓微量泵注射Ang Ⅱ兩周的方法誘導小鼠產生心肌肥厚,觀察exosome分泌抑制劑GW4869、DMA對正常及Ang Ⅱ誘導的心肌重構小鼠體重、血壓、心率、心臟重量、心肌橫截面積、心肌纖維化比例以、左心室肥大及纖維化相關基因、SERCA2a表達水平的影響。8.血壓和心率測量采用tail-cuff法測量尾動脈收縮伍、舒張壓、平均動脈壓和心率。9.組織學分析使用切片機切出厚度為5μm的石蠟切片,用于麥胚凝集素(WGA)和Masson染色以評價左室心肌組織肥大及纖維化程度。10.統計學分析數據采用平均數±標準誤形式表示。數據統計采用SPSS 17.0進行,P0.05視為具有統計學差異。研究結果1.Ang Ⅱ刺激增加心肌成纖維細胞exosome分泌量Ang Ⅱ (1 μ M)能夠至少使心肌成纖維細胞exosome分泌量增加43%,胰島素(insulin,0.1 μ M)、脂多糖(LPS,0.1 μg/ml)、過氧化氫(H2O2,500 μM)等刺激因子未能改變心肌成纖維細胞的exosome分泌量。3H亮氨酸摻入實驗驗表明,正常培養(yǎng)及上述病理因子刺激的成纖維細胞分泌的exosome促進心肌細胞肥大能力沒有差異。2.替米沙坦、PD123319抑制Ang Ⅱ刺激增加的心肌成纖維細胞exosome分泌量替米沙坦(10μM)、PD123319(10μ M)均能抑制Ang Ⅱ誘導的CF exosome分泌量增加,二者聯用具有協同作用。3H亮氨酸摻入實驗驗表明,正常培養(yǎng)及Ang Ⅱ、替米沙坦、PD123319刺激過的成纖維細胞分泌的exosome促進心肌細胞肥大能力沒有差異。3.GW4869、DMA能夠抑制Ang Ⅱ聯合心肌成纖維細胞共培養(yǎng)誘導的心肌細胞肥大GW4869 (40 μ M)、DMA (100nM)能有效地抑制CF exosome的分泌,并且對心肌細胞與心肌成纖維細胞都不具有毒性。Ang Ⅱ聯合心肌成纖維細胞共培養(yǎng)的促心肌細胞肥大能力明顯高于AngⅡ、CF共培養(yǎng)單種刺激因素；AngⅡ聯合心肌成纖維細胞共培養(yǎng)的促肥大能力能夠被GW4869、DMA明顯抑制,并且GW4869 (40uM)、DMA (100nM)不影響AngⅡ刺激組心肌細胞的CPM值。4腹腔注射GW4869、DMA能夠抑制Ang Ⅱ微量泵注射兩周引起的小鼠心肌肥大經過兩周Ang Ⅱ微量泵皮下注射,小鼠心肌肥大明顯；GW4869、DMA腹腔注射能夠顯著抑制Ang Ⅱ誘導的小鼠心肌肥大,Ang Ⅱ+GW486、AngⅡ+DMA組小鼠HW/BW.左心室心肌細胞橫截面積較Ang Ⅱ組明顯降低。AngⅡ+GW4869、Ang Ⅱ+DMA組小鼠左心室胚胎基因ANP、BNP、βMHC mRNA表達水平較Ang Ⅱ組明顯降低,a MHC mRNA表達水平較Ang Ⅱ組明顯升高。5腹腔注射GW4869、DMA能夠抑制Ang Ⅱ微量泵注射兩周引起的小鼠心肌纖維化經過兩周Ang Ⅱ微量泵皮下注射,小鼠心肌纖維化明顯；GW4869、DMA腹腔注射能夠顯著抑制Ang Ⅱ誘導的小鼠心肌纖維化,Ang Ⅱ+GW4869、Ang Ⅱ+DMA組小鼠左心室纖維化比例以及膠原Ⅰ、膠原Ⅲ、TGFβ1、CTGF mRNA表達水平較Ang Ⅱ組明顯降低。6腹腔注射GW4869、DMA緩解Ang Ⅱ微量泵注射兩周引起的小鼠左心室SERCA2a表達水平降低經過兩周Ang Ⅱ微量泵皮下注射,小鼠左心室SERCA2a蛋白及mRNA表達水平明顯降低；GW4869、DMA腹腔注射能夠顯著抑制Ang Ⅱ的上述效應,AngⅡ+GW4869、Ang Ⅱ+DMA組小鼠SERCA2a蛋白及mRNA表達水平較Ang Ⅱ組明顯升高。研究結論1.Ang Ⅱ能夠通過血管緊張素Ⅰ受體增加心肌成纖維細胞exosome分泌；2.腹腔注射exosome分泌抑制劑GW4869或者DMA能夠緩解AngⅡ微量泵注射誘導的小鼠心肌肥大；3.腹腔注射exosome分泌抑制劑GW4869或者DMA能夠緩解AngⅡ微量泵注射誘導的小鼠心肌纖維化；4.腹腔注射exosome分泌抑制劑GW4869或者DMA能夠緩解AngⅡ微量泵注射誘導的小鼠心肌SERCA2a表達降低�？傊�,CF exosome作為一種旁分泌途徑參與了Ang Ⅱ微量泵注射誘導的小鼠心肌重構。
【關鍵詞】：心肌成纖維細胞 外泌體 血管緊張素-2 心肌重構 腎素-血管緊張素系統 心肌成纖維細胞 外泌體 血管緊張素-2 心肌重構 腎素-血管緊張素系統
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R542.2
【目錄】：

• 第一部分：心肌成纖維細胞來源的exosome通過激活腎素-血管緊張素系統促進心肌細胞肥大8-58
• 中文摘要8-13
• Abstract13-16
• 符號說明16-20
• 前言20-23
• 材料與方法23-35
• 研究結果35-38
• 討論38-41
• 結論41-42
• 創(chuàng)新點42
• 局限性42-43
• 附圖表43-55
• 參考文獻55-58
• 第二部分：心肌成纖維細胞exosome作為一種旁分泌途徑參與血管緊張素-2誘導的心肌重構58-101
• 中文摘要58-62
• 英文摘要62-65
• 符號說明65-68
• 前言68-70
• 材料與方法70-77
• 研究結果77-82
• 討論82-84
• 結論84
• 創(chuàng)新點84-85
• 局限性85-86
• 附圖86-98
• 參考文獻98-101
• 英文文章1101-137
• 英文文章2137-154
• 致謝154-155
• 學位論文評閱及答辯情況表155

【參考文獻】

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1 顧東風 ,黃廣勇 ,吳錫桂 ,段秀芳 ,何江 ,Paul K Whelton ,Stephen Mac Mahon;中國心力衰竭流行病學調查及其患病率[J];中華心血管病雜志;2003年01期

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本文編號：639678