本文關(guān)鍵詞：番茄紅素保護線粒體DNA減輕心肌缺血再灌注損傷的作用及機制研究

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【摘要】：背景:心血管疾病是人類健康的第一殺手,隨著經(jīng)濟社會的發(fā)展和人口老齡化,我國心血管疾病的患病率持續(xù)增加,心肌梗死的發(fā)生率也日益升高。心肌梗死常常危及生命,盡早有效地恢復(fù)缺血心肌血液供應(yīng),是阻止缺血性心肌損傷的發(fā)展、減小梗死面積進而改善臨床預(yù)后的根本措施。然而,缺血心肌恢復(fù)血液灌注后產(chǎn)生的再灌注損傷往往難以避免。除此之外,再灌注損傷也常常存在于器官移植、體外循環(huán)、休克復(fù)蘇等情況中。近年來,盡管在缺血/再灌注損傷的防治和機制研究中已經(jīng)取得了很大的進展,但如何有效的預(yù)防和減輕缺血/再灌注損傷仍然是臨床工作者們面臨的重要難題。有研究表明氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙在缺血/再灌注損傷中發(fā)揮了重要作用。線粒體DNA易受到氧化應(yīng)激損傷。但缺血/再灌注損傷與線粒體DNA之間的關(guān)系尚不明確。番茄紅素是一種脂溶性的抗氧化劑,屬于類胡蘿卜素中的一種,富含于番茄及其它各種紅色蔬菜和水果之中,常溫下呈紅褐色長針狀晶體。最近有研究表明番茄紅素可以保護線粒體DNA使其免于氧化損傷。前期研究發(fā)現(xiàn)番茄紅素能夠減輕缺氧/復(fù)氧引起的心肌細胞凋亡。本研究旨在探討線粒體DNA損傷在心肌缺血/再灌注損傷中的作用及其可能的機制,以及番茄紅素能否通過保護線粒體DNA減輕心肌缺血/再灌注損傷,同時我們對番茄紅素保護線粒體DNA的機制也進行了探討。方法:1.大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型:結(jié)扎心臟冠狀動脈左前降支,30 min后打開結(jié)扎部位讓心肌重新獲得血液灌注并持續(xù)24 h。H9c2細胞缺血/再灌注損傷的體外模型:將H9c2細胞缺氧6 h,復(fù)氧12 h。為了驗證缺血/再灌注能夠引起線粒體DNA的損傷,通過免疫熒光的方法來檢測心肌組織及H9c2細胞中8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG),并通過COX IV抗體來識別心肌組織中的線粒體,通過線粒體的紅色熒光探針Mitotracker Red來標定H9c2細胞中的線粒體,觀察8-OHd G是否與線粒體重合。同時,通過實時熒光定量PCR來檢測心肌組織及H9c2細胞中線粒體DNA拷貝數(shù)及線粒體DNA基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。2.為了明確在上述缺血/再灌注動物模型和細胞模型中是否存在線粒體功能障礙,通過試劑盒對心肌組織及h9c2細胞中的atp進行檢測。同時,還通過熒光探針jc-1對h9c2細胞線粒體膜電位進行檢測。3.為了明確線粒體dna損傷本身是否能夠?qū)е戮�粒體功能障礙,用低濃度的溴化乙錠處理h9c2細胞來耗竭細胞中的線粒體dna,然后對h9c2細胞的線粒體膜電位,細胞中的atp水平以及細胞存活率進行檢測。同時,對h9c2細胞中線粒體dna拷貝數(shù)及線粒體dna基因轉(zhuǎn)錄水平也進行了檢測。4.為了明確番茄紅素是否能夠通過保護線粒體dna來減輕大鼠心肌的缺血/再灌注損傷。通過2,3,5-氯化三苯基四氮唑(ttc)染色的方法來測定大鼠心肌缺血/再灌注后心臟的梗死面積。收集大鼠血漿,檢測肌鈣蛋白、乳酸脫氫酶以及肌酸激酶等心肌損傷生物標記物。通過tunel染色檢測心肌組織及h9c2細胞中凋亡細胞的比率。通過免疫印跡法檢測水解的caspase-3蛋白的表達量。對h9c2細胞進行annexinv及pi共染色,然后經(jīng)流式細胞儀分析其中凋亡細胞的比率。同時,為了明確番茄紅素對線粒體dna以及線粒體功能的保護作用,也檢測了心肌組織及h9c2細胞中8-ohdg的含量,線粒體dna拷貝數(shù),線粒體dna基因轉(zhuǎn)錄水平,線粒體膜電位以及細胞中atp水平。5.為了探討番茄紅素減輕線粒體dna損傷的機制,對心肌組織及h9c2細胞中的mda,ros以及線粒體內(nèi)超氧化物含量進行了檢測。同時,為了進一步明確番茄紅素保護線粒體dna的作用是否與減輕氧化應(yīng)激有關(guān),在細胞實驗中通過h2o2處理h9c2細胞,造成線粒體dna的氧化損傷,觀察番茄紅素對h2o2引起的線粒體dna損傷及線粒體功能障礙是否具有保護作用。6.為了進一步探討番茄紅素減輕線粒體dna損傷的機制,我們還通過免疫印跡和免疫熒光染色的方法對線粒體轉(zhuǎn)錄因子(調(diào)節(jié)線粒體dna拷貝、轉(zhuǎn)錄以及維持核樣結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵蛋白因子)進行了檢測。結(jié)果:1.在缺血/再灌注的動物實驗和細胞實驗中都發(fā)現(xiàn),缺血/再灌注導(dǎo)致了8-ohdg的大量生成,且大部分與線粒體重合。pcr的結(jié)果提示線粒體dna拷貝數(shù)和基因轉(zhuǎn)錄水平均明顯降低。這些結(jié)果表明心肌的缺血/再灌注損傷與線粒體dna損傷有關(guān)。2.動物實驗和細胞實驗都證實,缺血/再灌注導(dǎo)致細胞內(nèi)atp水平明顯降低。細胞實驗證明,缺血/再灌注后h9c2細胞線粒體膜電位明顯降低。這些結(jié)果表明缺血/再灌注引起了細胞線粒體功能障礙。3.為了明確線粒體dna損傷與線粒體功能障礙的關(guān)系,在細胞實驗中通過向h9c2細胞加入低濃度的溴化乙錠的方法耗竭線粒體中的DNA,觀察其對線粒體功能及細胞存活的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),加入溴化乙錠后細胞中線粒體DNA的拷貝數(shù)和基因轉(zhuǎn)錄水平隨著時間的推移逐漸降低,同時也觀察到細胞中ATP的水平及線粒體膜電位也逐漸降低,而線粒體中超氧物陰離子的濃度卻逐漸增加,細胞活力逐漸下降。這些結(jié)果表明線粒體DNA損傷可以導(dǎo)致線粒體功能障礙,細胞死亡。4.番茄紅素預(yù)處理能使大鼠心肌缺血/再灌注后的心臟梗死面積明顯減少,使血漿中的心肌損傷標記物水平降低。在細胞實驗中番茄紅素能明顯抑制缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的細胞死亡。在動物實驗和細胞實驗中都證明,番茄紅素能使Tunel陽性的細胞數(shù)減少,使激活的caspase-3蛋白的表達量降低,使Annexin V染色陽性的細胞比率降低,表明番茄紅素能夠抑制缺血/再灌注引起的細胞凋亡。同時,在動物實驗和細胞實驗中都發(fā)現(xiàn)番茄紅素能夠有效的防止缺血/再灌注引起的8-OHdG的生成以及線粒體DNA拷貝數(shù)與線粒體DNA基因轉(zhuǎn)錄水平的下降。番茄紅素還防止了缺血/再灌注引起的ATP水平的降低和線粒體膜電位的下降。這些結(jié)果表明番茄紅素可以通過保護線粒體DNA,減輕線粒體功能障礙,抑制細胞凋亡,來減輕大鼠心肌的缺血/再灌注損傷。5.線粒體DNA特別容易受到氧化應(yīng)激損傷。番茄紅素能夠明顯抑制缺血/再灌注引起的MDA以及活性氧的生成。番茄紅素也能夠抑制H2O2引起的線粒體DNA損傷及線粒體功能障礙。6.通過對與線粒體DNA的拷貝、轉(zhuǎn)錄以及維持核樣結(jié)構(gòu)密切相關(guān)的關(guān)鍵蛋白因子Tfam的檢測,發(fā)現(xiàn)缺血/再灌注以后線粒體中Tfam的表達量明顯降低,而番茄紅素能有效的抑制線粒體中Tfam的下降。結(jié)論:本實驗研究結(jié)果表明:線粒體DNA損傷在大鼠心肌缺血/再灌注損傷中發(fā)揮了重要的作用;番茄紅素可通過保護線粒體DNA減輕大鼠心肌的缺血/再灌注損傷,其保護線粒體DNA的作用可能與其減輕線粒體氧化應(yīng)激以及穩(wěn)定線粒體中的Tfam有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：缺血/再灌注 線粒體DNA 番茄紅素 氧化應(yīng)激 線粒體功能
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R54
【目錄】：

• 英文縮寫一覽表4-6
• 英文摘要6-10
• 中文摘要10-13
• 第一章 前言13-16
• 第二章 線粒體DNA損傷在心肌缺血/再灌注損傷中的作用16-38
• 2.1 材料與方法16-27
• 2.2 實驗結(jié)果27-35
• 2.3 討論35-36
• 2.4 小結(jié)36-38
• 第三章 番茄紅素通過保護線粒體DNA減輕大鼠心肌缺血/再灌注損傷38-61
• 3.1 材料與方法39-49
• 3.2 實驗結(jié)果49-59
• 3.3 討論59-60
• 3.4 小結(jié)60-61
• 第四章 番茄紅素減輕線粒體DNA損傷的機制研究61-85
• 4.1 材料與方法62-73
• 4.2 實驗結(jié)果73-82
• 4.3 討論82-83
• 4.4 小結(jié)83-85
• 全文總結(jié)85-86
• 參考文獻86-90
• 文獻綜述一 缺血/再灌注損傷機制的研究進展90-97
• 參考文獻93-97
• 文獻綜述二 線粒體DNA與心肌缺血/再灌注損傷97-107
• 參考文獻103-107
• 攻讀博士學(xué)位期間的研究成果107-108
• 致謝108-109

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本文編號：633092