本文關(guān)鍵詞：精子發(fā)生相關(guān)泛素化修飾的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

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【摘要】：越來(lái)越多的夫婦會(huì)面臨不孕不育的困擾。解決這個(gè)問(wèn)題的基礎(chǔ)是在分子水平闡釋配子發(fā)生的分子機(jī)制,其中精子發(fā)生是一個(gè)極其復(fù)雜的細(xì)胞分裂和分化過(guò)程,從精原細(xì)胞的自我更新到正常精子的形成,任何一個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生錯(cuò)誤都可能出現(xiàn)精子發(fā)生異常而導(dǎo)致不育。同其它蛋白質(zhì)修飾一樣,泛素化修飾對(duì)這一過(guò)程的調(diào)控是必不可少的。越來(lái)越多的證據(jù)表明各種泛素系統(tǒng)相關(guān)組分參與了精子發(fā)生的過(guò)程。本課題旨在利用蛋白組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)小鼠睪丸精子發(fā)生中一些重要的泛素化修飾蛋白和泛素化相關(guān)酶,建立并優(yōu)化針對(duì)泛素化修飾特異的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定和定量技術(shù),有助于闡明精子發(fā)生的分子機(jī)制,并為臨床相關(guān)疾病的診斷治療提供候選分子靶標(biāo)。首先利用非富集策略,對(duì)睪丸泛素化修飾蛋白與泛素化調(diào)控酶進(jìn)行鑒定。通過(guò)比較不同的二維分離鑒定蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),發(fā)現(xiàn)第一維使用HP-RP(高pH反相分離)技術(shù)分離效果優(yōu)于SCX(強(qiáng)陽(yáng)離子交換分離),肽段在不同分離組分中的分布比較均勻;此外,質(zhì)譜產(chǎn)生的蛋白定性信息比較多,大大提高了蛋白質(zhì)的可信度。HP-RP分離技術(shù)可以與第二維低pH反相分離正交,用于復(fù)雜樣品的大規(guī)模鑒定。利用這一技術(shù)平臺(tái)構(gòu)建了小鼠睪丸蛋白表達(dá)譜系,單次實(shí)驗(yàn)得到8511種蛋白質(zhì)和88207種不同肽段。我們分析了小鼠睪丸蛋白譜系中泛素化蛋白鑒定情況,結(jié)果只鑒定到109個(gè)泛素化位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于76個(gè)底物蛋白。但是鑒定了274種泛素化酶(E1、E2和E3)和59種去泛素化酶(DUBs)。大量泛素化修飾調(diào)控酶的表達(dá)說(shuō)明精子發(fā)生可能受到復(fù)雜的泛素化修飾調(diào)控。因此,我們構(gòu)建了基于泛素化特征肽(K-GG)富集策略的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái),并成功應(yīng)用于小鼠睪丸精子發(fā)生中泛素化修飾蛋白的鑒定。與未經(jīng)富集的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)相比,該富集策略可以大大提高泛素化肽段在質(zhì)譜儀器中的檢測(cè)效率。通過(guò)2次生物學(xué)重復(fù),一共鑒定到13717個(gè)泛素化修飾位點(diǎn),對(duì)應(yīng)于4200種底物蛋白。生物信息學(xué)分析提示這些泛素化修飾蛋白質(zhì)與RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝通路、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、DNA的損傷修復(fù)、免疫反應(yīng)、內(nèi)吞作用、細(xì)胞周期及凋亡等通路相關(guān),該研究結(jié)果提示蛋白質(zhì)泛素化修飾在精子發(fā)生的過(guò)程中可能發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。最后,為了尋找泛素化修飾定量方法,對(duì)蛋白組學(xué)定量技術(shù)進(jìn)行了研究,構(gòu)建了TMT(串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽)與18O定量技術(shù)平臺(tái)。利用TMT定量技術(shù)研究了精原干細(xì)胞(SSC)增殖、遷移與分化相關(guān)的蛋白表達(dá)差異,并用western驗(yàn)證了定量的準(zhǔn)確性。探討了18O定量技術(shù)的標(biāo)記效率、定量準(zhǔn)確性,并利用18O定量技術(shù)與泛素化富集相結(jié)合的策略進(jìn)行了泛素化修飾位點(diǎn)定量分析,為在睪丸中進(jìn)行泛素化修飾特異的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。綜上所述,成年小鼠睪丸蛋白表達(dá)譜系和泛素化修飾譜系的構(gòu)建及分析,提示了蛋白質(zhì)泛素化修飾在精子發(fā)生中的重要功能。通過(guò)生物信息學(xué)功能注釋初步探討了睪丸泛素化修飾蛋白質(zhì)的生物學(xué)特性及生物學(xué)意義,為進(jìn)一步研究泛素化修飾在精子發(fā)生過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制提供了豐富的資源和研究思路。另外,本研究還構(gòu)建并優(yōu)化了蛋白定量技術(shù)平臺(tái),為后期尋找定量精子發(fā)生關(guān)鍵泛素化修飾蛋白奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：泛素化 精子發(fā)生 睪丸 蛋白質(zhì)組學(xué)
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R321.1
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-9
• 前言9-12
• 第一部分 小鼠睪丸蛋白表達(dá)譜系的構(gòu)建12-33
• 一、研究背景12-13
• 二、實(shí)驗(yàn)材料與方法13-22
• 三、結(jié)果22-30
• 四、討論30-32
• 五、本章小結(jié)32-33
• 第二部分 小鼠睪丸泛素化蛋白譜系的構(gòu)建33-49
• 一、研究背景33-34
• 二、實(shí)驗(yàn)材料與方法34-38
• 三、結(jié)果38-46
• 四、討論46-48
• 五、本章小結(jié)48-49
• 第三部分 蛋白質(zhì)組表達(dá)定量與泛素化修飾定量方法研究49-71
• 一、研究背景49-50
• 二、實(shí)驗(yàn)材料與方法50-55
• 三、結(jié)果55-68
• 四、討論68-69
• 五、本章小結(jié)69-71
• 參考文獻(xiàn)71-79
• 文獻(xiàn)綜述79-101
• 參考文獻(xiàn)91-101
• 附表：小鼠精子發(fā)生中泛素化酶與去泛素化酶101-120
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況120-123
• 致謝123

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中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 馬祖祥;趙維玲;李永柏;高曉潔;楊軍;孫平;李成榮;;特發(fā)性腎病綜合征患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞泛素的表達(dá)及意義[J];中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志;2006年10期

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本文編號(hào)：641502