本文關(guān)鍵詞：基于相思子毒素和蓖麻毒素A鏈候選疫苗的研究

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【摘要】：相思子毒素(abrin)與蓖麻毒素(ricin)均為毒性很強(qiáng)的植物源性蛋白毒素,它們?cè)诜肿咏Y(jié)構(gòu)和功能上極其相似,分子結(jié)構(gòu)上它們均屬于A/B鏈結(jié)構(gòu),借助一個(gè)二硫鍵連接,其中A鏈?zhǔn)嵌拘枣?其能在B鏈的介導(dǎo)下進(jìn)入真核細(xì)胞來(lái)阻斷其核糖體上的蛋白質(zhì)合成,從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡;B鏈無(wú)毒,主要功能是與真核細(xì)胞表面的半乳糖殘基特異性的結(jié)合。兩種毒素對(duì)小鼠的半數(shù)致死劑量(LD50)均為納克級(jí)別。植物毒素與病原微生物相比雖然沒(méi)有傳染性,但其來(lái)源更為廣泛且易獲得,特別是蓖麻作為經(jīng)濟(jì)作物在各地有大量種植,且毒素的制備過(guò)程簡(jiǎn)單,國(guó)際社會(huì)早已將其列為B類生物管控物質(zhì),在美國(guó)等西方國(guó)家常有關(guān)于兩種毒素的恐怖事件發(fā)生,其對(duì)我國(guó)社會(huì)公共安全也同樣有著不容忽視的潛在威脅。針對(duì)這兩種毒素檢測(cè)的研究已取得了部分成績(jī),并推出多種檢測(cè)試劑,但是作為防治方面的疫苗研究還一直處于實(shí)驗(yàn)室和臨床研究階段。因此,研究與制備針對(duì)兩種毒素的醫(yī)學(xué)預(yù)防疫苗就具有十分重要的軍事和社會(huì)意義。在此類結(jié)構(gòu)的毒素中,A鏈的免疫原性通常要明顯好于B鏈,但是A鏈具有毒性,不能直接用作疫苗,因此本研究是基于這兩種毒素的A鏈,對(duì)其進(jìn)行各種減毒的改造(包括截短和定點(diǎn)突變),然后通過(guò)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)改造好的基因進(jìn)行重組蛋白的表達(dá),經(jīng)親和純化得到數(shù)個(gè)重組候選疫苗抗原,通過(guò)以下實(shí)驗(yàn)對(duì)它們進(jìn)行一系列的篩選,這些實(shí)驗(yàn)包括:毒性檢測(cè)、免疫動(dòng)物及保護(hù)效果的測(cè)定等,最終篩選出毒性低且免疫原性高的最優(yōu)候選疫苗抗原,為疫苗進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。對(duì)于abrin疫苗研究而言,以實(shí)驗(yàn)室保存的abrin A鏈基因?yàn)槟０?采用PCR方法設(shè)計(jì)5對(duì)不同的引物并擴(kuò)增出5條相互含有重疊序列的截短片段,將擴(kuò)增的5個(gè)基因片段構(gòu)建相應(yīng)的原核表達(dá)載體,并進(jìn)行蛋白可溶性表達(dá)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化,優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)5個(gè)重組的截短A鏈蛋白(t ATA1-5:truncated ATA)里只有t ATA1和t ATA4兩個(gè)蛋白能得到可溶性表達(dá),由于考慮到包涵體蛋白純化過(guò)程的繁瑣以及包涵體蛋白經(jīng)變復(fù)性后天然構(gòu)象可能發(fā)生改變,因此選取這兩個(gè)可溶性蛋白用于下一步實(shí)驗(yàn),利用重組蛋白帶有6×His標(biāo)簽的特性,采用鎳離子親和層析柱對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化,對(duì)純化后的A鏈截短片段重組蛋白進(jìn)行Western blotting實(shí)驗(yàn),分析其抗原性,并對(duì)其進(jìn)行體內(nèi)外的毒性測(cè)定實(shí)驗(yàn),蛋白t ATA1和t ATA4再分別與不同佐劑混合免疫小鼠,共免三次,次間間隔三周,每次免疫后一周取小鼠尾靜脈血并分離血清,用ELISA法對(duì)其進(jìn)行抗體滴度的測(cè)定,小鼠末次免疫一周后,用abrin分別以腹腔注射或呼吸道氣溶膠噴霧兩種途徑對(duì)其攻毒,攻毒后的小鼠每隔24 h觀察并記錄其體重至攻毒后10天,分析得出不同組的小鼠生存率,最后發(fā)現(xiàn)t ATA4免疫后的小鼠對(duì)abrin的抵抗效果明顯好于t ATA1免疫后的小鼠,因此選取t ATA4用于下一步的被動(dòng)保護(hù)實(shí)驗(yàn),將經(jīng)過(guò)蛋白t ATA4三次免疫后小鼠的血清與不同劑量的毒素在體外混合孵育后,經(jīng)腹腔注入未接受任何處理過(guò)的小鼠體內(nèi),每隔24 h記錄小鼠存活狀態(tài)直至攻毒后10天,計(jì)算不同組小鼠的生存率,分析其被動(dòng)保護(hù)的最高劑量。對(duì)于ricin疫苗研究而言,第一步通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)ricin A鏈上幾個(gè)關(guān)鍵的毒性位點(diǎn)進(jìn)行了定點(diǎn)突變,第二步設(shè)計(jì)引物將A鏈序列C末端的第199-267位氨基酸進(jìn)行截除,截除后的基因片段按同樣的方法借助原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行表達(dá)和純化,重組蛋白命名為mt RTA(mutated and truncated RTA),后續(xù)實(shí)驗(yàn)方法同t ATA4后續(xù)實(shí)驗(yàn)方法;對(duì)于研究同時(shí)針對(duì)abrin和ricin兩種毒素的二聯(lián)疫苗而言,主要是基于已篩選出來(lái)的t ATA4和mt RTA兩個(gè)候選抗原,分為兩種形式:一是以嵌合表達(dá)形式的二聯(lián)疫苗記為“mt RTA-t ATA4”,二是以物理混合形式的二聯(lián)疫苗記為“mt RTA+t ATA4”,借助原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)重組蛋白進(jìn)行表達(dá)和純化,再按同樣的方法對(duì)純化好的抗原蛋白進(jìn)行Western blotting實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)外毒性實(shí)驗(yàn)、小鼠的免疫與攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)、小鼠的被動(dòng)保護(hù)實(shí)驗(yàn)等一系列實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過(guò)PCR、雙酶切與測(cè)序驗(yàn)證,構(gòu)建的含有不同目的基因的原核表達(dá)載體均與預(yù)期結(jié)果完全一致,蛋白t ATA4的基因序列全長(zhǎng)564 bp,共編碼188個(gè)氨基酸,蛋白mt RTA的基因序列全長(zhǎng)594bp,共編碼198個(gè)氨基酸,重組蛋白t ATA4與mt RTA的相對(duì)分子質(zhì)量均約為22k Da,其在大腸桿菌中經(jīng)培養(yǎng)條件優(yōu)化后能以上清和包涵體沉淀兩種形式表達(dá),將上清中可溶性形式表達(dá)的蛋白液經(jīng)鎳離子親和層析柱純化后,進(jìn)行Western blotting實(shí)驗(yàn)證實(shí)這兩種蛋白均具有良好的抗原性,體內(nèi)外毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),經(jīng)改造后的A鏈重組蛋白的毒性較天然毒素和未改造的A鏈重組蛋白已大大降低,即使單次注射劑量達(dá)到1mg時(shí)(相當(dāng)于正常單次免疫劑量10μg的100倍),小鼠也沒(méi)產(chǎn)生明顯的不適癥狀。將重組蛋白分別與鋁佐劑或SPO1佐劑混合后免疫小鼠,經(jīng)過(guò)免疫后的小鼠血清中可檢測(cè)到特異性的Ig G抗體,且在三免后小鼠血清抗體效價(jià)均可達(dá)到1:106,攻毒實(shí)驗(yàn)分別采取兩種途徑:腹腔注射攻毒與呼吸道氣溶膠噴霧攻毒。經(jīng)t ATA4免疫后的小鼠對(duì)abrin經(jīng)腹腔或呼吸道途徑攻毒的最高完全抵抗劑量分別為40或30×LD50,同時(shí)將經(jīng)過(guò)完整免疫后小鼠的血清與不同劑量但相同體積(250μL)的abrin在體外混合,再對(duì)未經(jīng)任何處理的小鼠進(jìn)行腹腔注射的被動(dòng)攻毒,結(jié)果顯示免疫血清能完全保護(hù)未經(jīng)免疫的小鼠抵抗20×LD50的abrin腹腔攻毒。經(jīng)mt RTA免疫后的小鼠對(duì)ricin經(jīng)腹腔或呼吸道途徑攻毒的最高完全抵抗劑量分別為40或20×LD50,同時(shí)將經(jīng)過(guò)完整免疫后的小鼠血清按上述方法進(jìn)行小鼠的被動(dòng)保護(hù)實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示免疫血清能完全保護(hù)未經(jīng)免疫的小鼠抵抗25×LD50的ricin腹腔攻毒。對(duì)于二聯(lián)疫苗而言,小鼠的免疫與攻毒實(shí)驗(yàn)證實(shí),以物理混合形式的二聯(lián)疫苗效果明顯好于以嵌合表達(dá)形式的二聯(lián)疫苗,經(jīng)“mt RTA+t ATA4”免疫后的小鼠能完全抵抗ricin或abrin的劑量分別為10或20×LD50,對(duì)于兩種毒素混合攻毒的最高抵抗劑量為10×LD50。本研究成功的設(shè)計(jì)、構(gòu)建、表達(dá)和篩選了重組蛋白候選疫苗抗原t ATA4和mt RTA,實(shí)現(xiàn)了這兩種蛋白在原核系統(tǒng)中的可溶性表達(dá)。通過(guò)抗原性及體內(nèi)外毒性實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),所獲得的候選疫苗抗原具有良好的抗原性,以及對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和動(dòng)物的低毒或無(wú)毒性,同時(shí)小鼠的免疫與攻毒實(shí)驗(yàn)也證實(shí)這兩種疫苗候選抗原具有良好的免疫刺激作用和免疫保護(hù)效果,以上結(jié)果為abrin和ricin疫苗下一步的臨床實(shí)驗(yàn)做好了準(zhǔn)備。
【關(guān)鍵詞】：相思子毒素 截短疫苗 蓖麻毒素 突變體疫苗 體內(nèi)外毒性
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 中英文縮略詞表5-6
• 摘要6-9
• ABSTRACT9-12
• 前言12-16
• 參考文獻(xiàn)14-16
• 第一章 相思子毒素A鏈蛋白抗原的制備、安全性和免疫保護(hù)效果的評(píng)價(jià)16-64
• 引言16-17
• 1 實(shí)驗(yàn)材料17-21
• 2 實(shí)驗(yàn)方法21-35
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-60
• 4 小結(jié)與討論60-62
• 參考文獻(xiàn)62-64
• 第二章 蓖麻毒素A鏈蛋白抗原的制備、安全性和免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)64-96
• 引言64-65
• 1 實(shí)驗(yàn)材料65-66
• 2 實(shí)驗(yàn)方法66-76
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果76-93
• 4 小結(jié)與討論93-94
• 參考文獻(xiàn)94-96
• 第三章 蓖麻毒素、相思子毒素A鏈二聯(lián)蛋白抗原的制備及免疫保護(hù)效果的評(píng)價(jià)96-109
• 引言96
• 1 實(shí)驗(yàn)材料96
• 2 實(shí)驗(yàn)方法96-101
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果101-107
• 4 小結(jié)與討論107-109
• 全文總結(jié)109-110
• 綜述110-119
• 參考文獻(xiàn)116-119
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷119-120
• 致謝120-121

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 章金勇;張曉麗;鄒全明;;肉毒毒素及其疫苗研究進(jìn)展[J];中國(guó)生物制品學(xué)雜志;2007年12期

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本文編號(hào)：617033