本文關(guān)鍵詞：Gankyrin正反饋調(diào)控Nrf2在肝細(xì)胞癌中發(fā)揮抗氧化作用

  更多相關(guān)文章： gankyrin Nrf2 Keap1 肝細(xì)胞癌 ROS

【摘要】：肝癌是臨床常見腫瘤之一,在我國患者的平均年齡為44歲。肝癌化療效果差、高復(fù)發(fā)、高轉(zhuǎn)移、預(yù)后差,在惡性腫瘤中肝癌死亡率城市統(tǒng)計(jì)占第三位,農(nóng)村則占第二位。近年來轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)迅猛發(fā)展,針對(duì)特定癌基因的靶向性治療方法被認(rèn)為是最具發(fā)展?jié)摿Φ母伟┲委熓侄�。目�?肝癌發(fā)病機(jī)制、靶向治療基因和有效治療方法是目前的重要研究方向。ROS的對(duì)細(xì)胞具有雙重作用,適宜濃度的ROS的存在對(duì)細(xì)胞的正常生理活動(dòng)非常必要,ROS能夠作為信號(hào)分子參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及受損的細(xì)胞器清除等過程。然而,高濃度的ROS能夠與影響細(xì)胞內(nèi)多種生物大分子(脂類、DNA及蛋白質(zhì))的穩(wěn)定性進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。生理情況下,ROS水平由一個(gè)程序性誘導(dǎo)的抗氧化系統(tǒng)嚴(yán)格控制使其維持較低的濃度,發(fā)揮其正常生理功能而不會(huì)損傷細(xì)胞。機(jī)體內(nèi)的ROS水平升高與人類的衰老及多種疾病如腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、炎癥以及心腦血管疾病等的發(fā)生均有密切聯(lián)系。ROS在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移和侵襲過程中均有重要作用。NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)是調(diào)控細(xì)胞防御氧化應(yīng)激和親電子物質(zhì)刺激的核心轉(zhuǎn)錄因子。Nrf2能夠通過上調(diào)一系列抗氧化酶基因及解毒酶等基因的表達(dá)從而維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)。Nrf2在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中也具有雙重作用,一方面,KEAP1-NRF2-ARE途徑介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)能夠保護(hù)細(xì)胞免受外界刺激導(dǎo)致的損傷,尤其是DNA損傷,因此具有一定的抗癌作用;另一方面,在多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了Nrf2高表達(dá),并且Nrf2與腫瘤細(xì)胞耐藥性密切相關(guān)。Gankyrin是人類26S蛋白酶體的一個(gè)非ATP酶調(diào)節(jié)亞基,2000年Fujita等從人類肝癌組織高表達(dá)的基因中篩選得到,其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)包括五個(gè)ankyrin重復(fù)序列以及N端和C端各半個(gè)ankyrin序列。在肝癌早期就能檢測(cè)到gankyrin表達(dá)水平升高。Gabkyrin與HCC患者的年齡、性別、HBV或HCV感染,腫瘤大小及腫瘤細(xì)胞分化程度均無相關(guān)性,但與HCC的高轉(zhuǎn)移性相關(guān)。Gankyrin能夠影響肝細(xì)胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移(調(diào)控PI3K/AKT/HIF-1α信號(hào)通路),維持HCC腫瘤起始細(xì)胞的功能(抑制Wwp2對(duì)Oct4的降解激活)并影響HCC細(xì)胞的去分化(上調(diào)HNF-4α),這些研究結(jié)果都證明Gankyrin在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。本研究主要目的是研究gankyrin在肝癌細(xì)胞對(duì)抗氧化應(yīng)激中的作用,gankyrin與Nrf2抗氧化反應(yīng)體系的相互作用及其在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用。實(shí)驗(yàn)方法:1.運(yùn)用RealTime-PCR、Luciferase熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng),western blot等方法檢測(cè)H2O2檢測(cè)對(duì)gankyrin基因表達(dá)水平的影響;2.應(yīng)用流式細(xì)胞儀,熒光顯微鏡檢測(cè)gankyrin對(duì)肝癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響;3.利用電鏡,熒光顯微鏡及線粒體氧消耗試劑盒檢測(cè)gankyrin對(duì)于肝癌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)及功能的影響;4.應(yīng)用流式細(xì)胞儀,熒光顯微鏡檢測(cè)gankyrin對(duì)肝癌細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞死亡水平的影響;5.通過quantitative Realtime PCR,western blot,細(xì)胞總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒和Luciferase熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)gankyrin對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶基因的調(diào)控水平;6.應(yīng)用western blot檢測(cè)gankyrin對(duì)細(xì)胞內(nèi)Nrf2表達(dá)水平的調(diào)控作用;7.應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)和western blot檢測(cè)gankyrin對(duì)細(xì)胞內(nèi)Nrf2泛素化水平的調(diào)控作用;8.應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)和western blot檢測(cè)gankyrin與Keap1的相互作用;9.應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀(ch IP)、q RT-PCR及western blot檢測(cè)Nrf2對(duì)于gankyrin的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用;10.應(yīng)用免疫組織化學(xué)、大鼠DEN誘癌模型及裸鼠皮下荷瘤實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中g(shù)ankyrin與Nrf2的協(xié)同作用;11.利用免疫組化、組織芯片檢測(cè)人類肝癌組織中g(shù)ankyrin與Nrf2的協(xié)同作用與肝癌預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果:1.H2O2刺激能夠誘導(dǎo)gankyrin表達(dá);2.Gankyrin能夠降低肝癌細(xì)胞內(nèi)的ROS水平;3.Gankyrin能夠穩(wěn)定肝癌細(xì)胞內(nèi)線粒體的結(jié)構(gòu)和功能;4.Gankyrin能夠保護(hù)肝癌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞死亡;5.Gankyrin能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶基因的表達(dá);6.Gankyrin能夠抑制Nrf2泛素化并穩(wěn)定肝癌細(xì)胞內(nèi)Nrf2的蛋白水平;7.Gankyrin能夠與Nrf2競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Keap1的Kelch結(jié)構(gòu)域并抑制Keap1與Nrf2結(jié)合;8.Nrf2能夠通過gankyrin啟動(dòng)子區(qū)的ARE元件促進(jìn)gankyrin轉(zhuǎn)錄;9.Gankyrin與Nrf2協(xié)同作用穩(wěn)定肝癌細(xì)胞內(nèi)線粒體的結(jié)構(gòu)和功能;10.Gankyrin與Nrf2協(xié)同作用保護(hù)肝癌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞死亡;11.在大鼠DEN誘癌模型中,gankyrin與Nrf2的累積伴隨發(fā)生;12.人類組織芯片中,Nrf2與gankyrin表達(dá)存在相關(guān)性,并且二者的表達(dá)水平與患者預(yù)后密切相關(guān);結(jié)論:本研究主要發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中g(shù)ankyrin與Nrf2之間存在正反饋調(diào)節(jié),gankyrin可以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Keap1蛋白的Kelch結(jié)構(gòu)域,抑制Nrf2與Keap1結(jié)合并通過蛋白酶體途徑降解,穩(wěn)定Nrf2的表達(dá);而Nrf2則能夠通過結(jié)合gankyrin啟動(dòng)子區(qū)的ARE元件促進(jìn)gankyrin的表達(dá)。Gankyrin-Nrf2正反饋協(xié)同作用誘導(dǎo)下游抗氧化酶靶基因的轉(zhuǎn)錄,維持肝癌細(xì)胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài),保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的線粒體損傷和細(xì)胞死亡。在大鼠DEN誘癌模型中,Gankyrin與Nrf2隨著肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過程中在癌巢組織中相互伴隨累積。Gankyrin與Nrf2在人類HCC組織中也存在相關(guān)性,Gankyrin與Nrf2高表達(dá)患者預(yù)后差,存活時(shí)間短。
【關(guān)鍵詞】：gankyrin Nrf2 Keap1 肝細(xì)胞癌 ROS
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-8
• 英文縮略詞表8-9
• 前言9-11
• 材料和方法11-20
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果20-49
• 討論49-51
• 參考文獻(xiàn)51-55
• 附錄55-96
• 附錄一：綜述55-96
• 參考文獻(xiàn)72-96
• 在讀期間發(fā)表論文96-97
• 致謝97

，

本文編號(hào)：611041