本文關(guān)鍵詞：P203L和V395I突變在N0K介導(dǎo)的腫瘤生成與轉(zhuǎn)移中的作用

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【摘要】：受體型酪氨酸激酶是存在于機(jī)體內(nèi)一類具有廣泛生理調(diào)節(jié)作用的蛋白酶類,它們調(diào)控著細(xì)胞許多生理生物學(xué)活動,包括細(xì)胞的增殖與分化、細(xì)胞的周期調(diào)控與代謝、胚胎的形成于發(fā)育等等。NOK(Novel Oncogene with Kinase Domain)是一個最新被鑒定的受體型酪氨酸激酶。NOK因缺少完整的胞外結(jié)構(gòu)域和DFG結(jié)構(gòu)域而因此被認(rèn)為是一類不具備生物學(xué)活性的假激酶。盡管如此,我們實驗室通過前期工作發(fā)現(xiàn),NOK是一個癌基因,能在體內(nèi)誘導(dǎo)癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。目前,關(guān)于NOK的研究并不多,其導(dǎo)致腫瘤生成和轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制也不清楚。本研究旨在從NOK基因結(jié)構(gòu)出發(fā),尋找其結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)聯(lián)性,明確NOK導(dǎo)致腫瘤生成和轉(zhuǎn)移的信號通路,為闡明其分子機(jī)制,為癌癥的診斷和治療提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)。本研究利用體外定點突變技術(shù)克隆構(gòu)建了含有不同位點突變和結(jié)構(gòu)域突變的共九個NOK突變子,并分別構(gòu)建了pCDNA3.0-NOK-HA/NOK-Mutant-HA真核表達(dá)質(zhì)粒和pCDH-CMV-MCS-EF 1-GFP-CD511B-NOK-HA/NOK-Mutant-HA慢病毒包裝質(zhì)粒及相應(yīng)BaF3穩(wěn)定細(xì)胞系。我們首先檢測了STYK1(即P203L突變)和V395I突變對自身磷酸化水平和激酶活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)STYK1和V395I突變均未影響到NOK的激酶活性,但V395I輕微抑制了自身的磷酸化。隨后,我們研究了突變對信號通路的影響。在HEK293T細(xì)胞中,NOK的高表達(dá)能顯著性升高ERK和Akt的磷酸化程度。但突變V395I并未削弱NOK所介導(dǎo)的ERK和Akt的磷酸化,而突變STYK1則抑制了這兩條信號通路。并且,兩者都抑制了諸如STAT1、STAT3和STAT5的磷酸化活化。在HeLa田胞中,STYK1同時抑制了ERK和Akt的磷酸化,但V395I僅抑制了ERK的磷酸化。而在JAK-STAT這條信號通路中,STYK1和V395I均抑制了STAT1和STAT3的磷酸化水平,但是對STAT5的影響不明顯。最后,在穩(wěn)定細(xì)胞系中,我們發(fā)現(xiàn)突變STYK1和V395I不僅顯著性地抑制了STAT1、STAT3和STAT5的磷酸化,而且還抑制了ERK的磷酸化。同時,STYK1而非V395I顯著性地降低了NOK的磷酸化水平。細(xì)胞增殖試驗檢測了突變對細(xì)胞增殖的影響。發(fā)現(xiàn)STYK1和V395I抑制了細(xì)胞的增殖能力。我們還發(fā)現(xiàn)與NOK相比,STYK1組誘導(dǎo)的集落形成數(shù)量明顯降低,約為NOK組的1/35,V395I組的集落形成數(shù)量也有降低,約為NOK組的1/4。以上結(jié)果說明了突變STYK1和V395I抑制了NOK介導(dǎo)的細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化及相關(guān)信號的傳導(dǎo)。在動物模型中,我們研究了NOK及其突變體在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力和相應(yīng)的腫瘤轉(zhuǎn)移能力。發(fā)現(xiàn)與對照組細(xì)胞相比,實驗組均可以導(dǎo)致腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移,但和NOK組的成瘤能力相比,突變組導(dǎo)致腫瘤形成的能力減弱,腫瘤形成的時間明顯滯后。在實驗組中,NOK組裸鼠平均存活時間約為1.5月,而STYK1組和V395I組裸鼠平均存活時間約延長至2.5-3.0月。各臟器腫大情況以NOK組最為明顯,其中肝臟和脾臟的腫大較STYK1組和V395I組嚴(yán)重。在NOK組裸鼠的肝臟表面可見明顯結(jié)節(jié)狀腫瘤轉(zhuǎn)移灶甚至成片轉(zhuǎn)移灶,而在注射突變子的裸鼠肝臟表明則很少看到明顯轉(zhuǎn)移灶的產(chǎn)生。蘇木精-伊紅(HE)染色發(fā)現(xiàn),在V395I和STYK1中,V395I組肝臟和脾臟的浸潤程度均高于STYK1組。我們利用流式細(xì)胞儀分析了各臟器中腫瘤的轉(zhuǎn)移情況,并進(jìn)行了腫瘤轉(zhuǎn)移的相對定量分析,結(jié)果也顯示了各臟器腫瘤侵襲的不同情況。此外,利用免疫沉淀和質(zhì)譜鑒定技術(shù),我們研究了與NOK可能發(fā)生相互作用的蛋白。用質(zhì)譜技術(shù)鑒定到了約40余種有可能與NOK發(fā)生相互作用蛋白,并且這些蛋白都是功能研究比較少的,其中有至少1/4為未知功能蛋白。包括MY09, MYO10, MYO14, FLNA, EHILI, BCLF1, MCM5, LAS1L, FAS, MYO6, U520和DZSP等等,其中不乏與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白如MYO10和MYO6等。這些蛋白可能在NOK介導(dǎo)的腫瘤生成和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。本研究從體外細(xì)胞水平和體內(nèi)動物水平上探討了NOK結(jié)構(gòu)和功能之間的相關(guān)性,通過突變子和穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建為實驗室研究NOK的結(jié)構(gòu)和功能建立了良好的研究平臺。通過本研究,為尋找對NOK所介導(dǎo)的腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制提供了重要理論依據(jù),也為以后更深入地研究NOK的功能提供了重要的線索。
【關(guān)鍵詞】：NOK 突變 腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移 信號通路
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R73-37
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 前言8-14
• 材料與方法14-50
• 一、實驗材料14-28
• 二、試劑配制28-31
• 三、方法31-50
• 結(jié)果50-89
• 一、NOK及其突變體的構(gòu)建50-55
• 二、慢病毒包裝穩(wěn)定細(xì)胞系的建立55-59
• 三、STYK1和V395I對NOK自身磷酸化和酪氨酸激酶活性的影響59-60
• 四、STYK1和V395I對相關(guān)信號通路的影響60-64
• 1、HEK293T細(xì)胞和HeLa細(xì)胞60-62
• 2 、BaF3穩(wěn)定細(xì)胞系62-64
• 五、STYK1和V395I對細(xì)胞增殖的影響64-68
• 六、STYK1和V3951抑制了NOK介導(dǎo)的錨定非依賴生長特性68-70
• 七、STYK1和V395I對細(xì)胞周期的影響70-72
• 八、STYK1和V395I對細(xì)胞遷移和侵襲的影響72-80
• 1 、體外細(xì)胞水平72-74
• 2 、體內(nèi)動物水平74-80
• 九、STYK1和V395I對腫瘤生成的影響80-83
• 1、生存曲線80-81
• 2 、臟器分析81-83
• 十、NOK相互作用蛋白83-89
• 討論89-97
• 參考文獻(xiàn)97-103
• 文獻(xiàn)綜述103-117
• 參考文獻(xiàn)113-117
• 附錄117-120
• 致謝120-122

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本文編號：617761