本文關(guān)鍵詞：肺癌生物材料植入白色念珠菌—表皮葡萄球菌生物膜的形成與宿主免疫功能的關(guān)系

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【摘要】：第一部分：白色念珠菌-葡萄球菌混合生物膜體外模型的建立及結(jié)構(gòu)觀察[目的]：建立白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜體外模型,了解混合生物膜的過(guò)程及結(jié)構(gòu)特點(diǎn),評(píng)價(jià)白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜在不同生物材料表面的形成情況。[方法]：將表皮葡萄球菌成膜陽(yáng)性株ATCC35984 (Se+)及表皮葡萄球菌成膜陰性株ATCC12228 (Se-)分別與白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC10231 (Ca)混合培養(yǎng)建立體外生物膜模型,分為Ca-Se+組與Ca-Se-組,加入聚氯乙烯(PVC)共培養(yǎng),于共培養(yǎng)2h、6h、12h、24h、48h、72h時(shí),激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)各組中生物膜厚度、單位視野內(nèi)菌群落數(shù)量,構(gòu)建生物膜表面三維熒光圖片；掃描電子顯微鏡觀察生物膜表面超微結(jié)構(gòu)。在Ca-Se+組分別加入PVC、硅橡膠、聚氨酯材料薄片分為3亞組,于共培養(yǎng)2h、6h、12h、24h、48h、72h時(shí),激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)各亞組中生物膜厚度。[結(jié)果]：激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)示,Ca-Se+組與Ca-Se-組培養(yǎng)6h開(kāi)始出現(xiàn)生物膜的生長(zhǎng),12h明顯增厚,24h時(shí)快速增長(zhǎng),48h最厚,直到72h時(shí)生物膜厚度趨于穩(wěn)定,Ca-Se+組24h及72h形成生物膜厚度大于Ca-Se-組(P0.05), Ca-Se+組PVC材料表面菌落數(shù)6h、12h、24h、48h、72h多于Ca-Se-組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。熒光圖像及三維重建提示：混合生物膜表面呈現(xiàn)起伏不平丘狀隆狀,突起部分多為活菌,死菌多分部于丘狀隆起間溝壑處；生物膜斷層掃描提示：由內(nèi)向外死活菌比例逐漸降低；Ca-Se+組PVC材料表面成熟生物膜結(jié)構(gòu)較Ca-Se組復(fù)雜。掃描電鏡結(jié)果顯示,隨著共培養(yǎng)時(shí)間增加,PVC材料表面逐漸形成呈團(tuán)塊狀、層疊樣的復(fù)雜立體結(jié)構(gòu)的混合生物膜,可見(jiàn)表皮葡萄球菌和白念珠菌的孢子及假菌絲呈團(tuán)塊狀混雜生長(zhǎng),大量表皮葡萄球菌黏附于各種形態(tài)的白色念珠菌周?chē)?孢子、假菌絲、菌絲)周?chē)纬啥啻螌訌?fù)雜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。與Ca-Se-組相比Ca-Se+組中混合生物膜結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜,白色念珠菌與表皮葡萄球菌黏附更為緊密,生物膜外周白色念珠菌黏附的表皮葡萄球菌數(shù)量更多。激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)提示Ca與Se+在共培養(yǎng)6h、12h、24h、48h、72h時(shí),PVC、醫(yī)用硅橡膠、聚氨酯各組材料表面生物膜厚度差異明顯,醫(yī)用硅膠組最厚,聚氯乙烯組次之,聚氨酯組最小(P0.05)。共培養(yǎng)2h小時(shí),硅橡膠組生物膜厚度大于聚氨酯與PVC組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),聚氨酯與PVC組間生物膜厚度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。[結(jié)論]：表皮葡萄球菌和白色念珠菌混合培養(yǎng),可在生物材料表面形成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的混合生物膜,Ca-Se+組形成生物膜較Ca-Se組更厚,結(jié)構(gòu)更復(fù)雜。表皮葡萄球菌和白念珠菌在醫(yī)用硅膠表面形成混合生物膜的能力最強(qiáng),聚氯乙烯次之,聚氨酯最差。膠、聚氨酯各組材料表面生物膜厚度差異明顯,醫(yī)用硅膠組最厚,聚氯乙烯組次之,聚氨酯組最小(P0.05)。共培養(yǎng)2h小時(shí),硅橡膠組生物膜厚度大于聚氨酯與PVC組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),聚氨酯與PVC組間生物膜厚度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。第二部分：白色念珠菌Efg1、Ecel、Sap5基因及表皮葡萄球菌AltE、 Aap基因在肺癌生物材料植入白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜形成過(guò)程中的作用[目的]：探討白色念珠菌Egfl、Ecel、Sap5基因與表皮葡萄球菌AltE、App基因在肺癌患者生物材料植入白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜形成過(guò)程中的表達(dá)差異及對(duì)混合生物膜形成的影響。[方法]：在表皮葡萄球菌成膜陽(yáng)性株ATCC35984 (Se+)與白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC10231 (Ga)與聚氯乙烯(PVC)共培養(yǎng)過(guò)程中,分別加入晚期非小細(xì)胞肺癌患者血清與健康人群血清,分為對(duì)照組、肺癌組和健康人群組,于共培養(yǎng)2h、6h、12h、24h、48h、72h時(shí),CLSM檢測(cè)各組PVC材料表面生物膜厚度與菌落數(shù)；分別于共培養(yǎng)6h、24h、48h時(shí),熒光定量PCR檢測(cè)各組PVC材料表面白色念珠菌Efgl.Ecel、Sap5基因和表皮葡萄球菌AltE、Aap基因的表達(dá)差異。[結(jié)果]：CLSM檢測(cè)示,共培養(yǎng)6h、12h時(shí)肺癌組和健康人群組PVC材料表面菌落數(shù)較對(duì)照組多,肺癌組PVC材料表面菌落數(shù)多于健康人群組(p0.05)；共培養(yǎng)12h、24h、48h時(shí)肺癌組混合生物膜厚度大于健康組與對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。熒光定量PCR結(jié)果顯示,三組中AltE隨共培養(yǎng)時(shí)間增加下調(diào)明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),6h時(shí)肺癌組AltE表達(dá)最低,健康人群組次之,對(duì)照組最高,兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；三組中Aap表達(dá)隨共培養(yǎng)時(shí)間增加上調(diào)明顯,6h對(duì)照組Aap表達(dá)對(duì)照組最高、肺癌組次之、健康組最低,兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；12h時(shí)Aap表達(dá)肺癌組最高、健康組次之、對(duì)照組最低,兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；三組中Efg1隨共培養(yǎng)時(shí)間增加下調(diào)明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),6h時(shí)肺癌組Efg1表達(dá)最高,健康人群組次之,對(duì)照組最低,兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),12h時(shí)健康組Efg1表達(dá)肺癌組、健康人群組與對(duì)照組,兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),48h時(shí)肺癌組與健康Efg1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P.05),但低于對(duì)照組(P0.05)。三組中Ecel表達(dá)隨共培養(yǎng)時(shí)間增加上調(diào)明顯,6h對(duì)照組Ecel表達(dá)對(duì)照作用最高、肺癌組次之、健康組最低,兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),24h時(shí),肺癌組與對(duì)照組Ecel表達(dá)低于健康人群組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,肺癌組與對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。三組中Sap5表達(dá)隨共培養(yǎng)時(shí)間增加而上調(diào)明顯,6h時(shí)三組Sap5表達(dá)對(duì)照組最高、肺癌組次之、健康組最低,兩兩比較差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；48h時(shí),Sap5表達(dá)肺癌組最高,健康組次之,對(duì)照組最低,兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。[結(jié)論]：與健康人群相比表皮葡萄球菌和白念珠菌混合培育更易在植入肺癌患者生物材料表面形成混合生物膜,可能與共培養(yǎng)早期白色念珠菌Efg1表達(dá)量下調(diào)、Ecel、Sap5基因表達(dá)量上調(diào)及表皮葡萄球菌AltE、Aap基因表達(dá)量下調(diào)有關(guān)。次之,對(duì)照組最高,兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；三組中Aap表達(dá)隨共培養(yǎng)時(shí)間增加上調(diào)明顯,6h對(duì)照組Aap表達(dá)對(duì)照組最高、肺癌組次之、健康組最低,兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；12h時(shí)Aap表達(dá)肺癌組最高、健康組次之、對(duì)照組最低,兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；三組中Efg1隨共培養(yǎng)時(shí)間增加下調(diào)明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),6h時(shí)肺癌組Efg1表達(dá)最高,健康人群組次之,對(duì)照組最低,兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),12h時(shí)健康組Efg1表達(dá)肺癌組、健康人群組與對(duì)照組,兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),48h時(shí)肺癌組與健康Efg1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P.05),但低于對(duì)照組(P0.05)。三組中Ecel表達(dá)隨共培養(yǎng)時(shí)間增加上調(diào)明顯,6h對(duì)照組Ecel表達(dá)對(duì)照作用最高、肺癌組次之、健康組最低,兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),24h時(shí),肺癌組與對(duì)照組Ecel表達(dá)低于健康人群組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,肺癌組與對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。三組中Sap5表達(dá)隨共培養(yǎng)時(shí)間增加而上調(diào)明顯,6h時(shí)三組Sap5表達(dá)對(duì)照組最高、肺癌組次之、健康組最低,兩兩比較差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；48h時(shí),Sap5表達(dá)肺癌組最高,健康組次之,對(duì)照組最低,兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。第三部分：肺癌生物材料植入白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜對(duì)細(xì)胞免疫的影響[目的]：比較肺癌患者與健康人群外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)在白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜刺激下,TLR2、TLR4、TLR9受體表達(dá),T淋巴細(xì)胞分化及相關(guān)細(xì)胞因子分泌的變化。[方法]：采用密度梯度離心法分離晚期肺癌患者和健康人群外周血單個(gè)核細(xì)胞各10例。表皮葡萄球菌成膜陽(yáng)性株ATCC35984 (Se+)與白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC10231 (Ca)與聚氯乙烯(PVC)共培養(yǎng)48h后,取出PVC材料,分離混合生物膜上清液。分為肺癌組與健康人群分別加入混合生物膜上清液共培養(yǎng)24h,采用Real-time法測(cè)定培養(yǎng)前后PBMCs細(xì)胞TLR2、TLR4、TLR9的表達(dá)水平；流式細(xì)胞儀(flow cytometry, FCM)檢測(cè)PBMCsCD3+、CD4+、CD8+、 CD3+CD25+、CD4+ CD25+細(xì)胞數(shù)量培養(yǎng)前后變化,檢測(cè)各組培養(yǎng)前后上清液中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF濃度。[結(jié)果]：(1)RT-PCR結(jié)果提示：共培養(yǎng)前肺癌組PBMCs細(xì)胞相比TLR2、TLR4表達(dá)低于健康人群組(P0.05),TLR9.兩組間無(wú)明顯差異(P0.05)。與白色念珠菌-表皮葡萄球菌生物膜上清共培養(yǎng)24h后,肺癌組與健康人群組PBMCs細(xì)胞TLR2、TLR4、TLR9表達(dá)肺癌組下調(diào)程度高于健康人群組(P0.05)；(2)流式細(xì)胞檢測(cè)提示：與對(duì)照組共培養(yǎng)肺癌組與健康人群組Th1因子：IL-2、TNF、IFN-γ濃度下降明顯(P0.05),Th2因子：IL-4、IL-10濃度上升明顯(p0.05),肺癌組的Th1因子下調(diào)程度高于健康人群組(p0.05),Th2因子的上調(diào)程度程度高于健康人群組(p0.05)；(3)共培養(yǎng)前肺癌組與健康人群組相比CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞比例低于健康人群組,CD4+CD25+細(xì)胞比例高于健康人群組；共培養(yǎng)24小時(shí)后與對(duì)照組相比,與對(duì)照組相比較兩組CD3+、CD4+、細(xì)胞比例下降顯著(p0.05), CD8+、CD4+CD25+細(xì)胞比例上升顯著(p0.05)；肺癌組CD3+、 CD4+、細(xì)胞比例下降程度小于健康人群組(p0.05),肺癌組CD8+、CD4+CD25+細(xì)胞比例上升程度小于健康人群組(p0.05)。[結(jié)論]：白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜上清液能下調(diào)人外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR2、TLR4、TLR9的表達(dá),導(dǎo)致機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答朝著Th2型免疫反應(yīng)發(fā)展,從而引起細(xì)胞因子表達(dá)量的變化,這可能是肺癌患者BF相對(duì)健康人群容易逃脫機(jī)體免疫防御系統(tǒng)。
【關(guān)鍵詞】：表皮葡萄球菌 白色念珠菌 混合生物膜 PVC 醫(yī)用硅橡膠 聚氨酯 非小細(xì)胞肺癌 表皮葡萄球菌 白念珠菌 生物材料 混合生物膜 Ffg1 Ecel Sap5 AltE Aap 白色念珠菌 表皮葡萄球菌 生物材料 混合生物膜 肺癌 細(xì)胞免疫 細(xì)胞因子 Th1 Th2
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R734.2
【目錄】：

• 中英文縮略詞對(duì)照表7-9
• 研究背景9-13
• 中文摘要13-17
• Abstract17-23
• 第一部分：白色念珠菌-葡萄球菌混合生物膜體外模型的建立及結(jié)構(gòu)觀察23-64
• 前言23-25
• 材料與方法25-31
• 結(jié)果31-55
• 討論55-60
• 結(jié)論60
• 致謝60-61
• 參考文獻(xiàn)61-64
• 第二部分：白色念珠菌Efg1、Ecel、Sap5基因及表皮葡萄球菌AltE、Aap基因在肺癌生物材料植入白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜形成過(guò)程中的作用64-95
• 前言64-66
• 材料與方法66-73
• 結(jié)果73-85
• 討論85-90
• 結(jié)論90-91
• 參考文獻(xiàn)91-95
• 第三部分：肺癌生物材料植入白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜對(duì)細(xì)胞免疫的影響95-125
• 前言95-97
• 材料與方法97-107
• 結(jié)果107-113
• 討論113-121
• 結(jié)論121
• 致謝121-122
• 參考文獻(xiàn)122-125
• 全文總結(jié)125-126
• 綜述126-150
• 參考文獻(xiàn)143-150
• 攻讀博士學(xué)位期間主持及參與課題150
• 攻讀博±期間科研獲獎(jiǎng)150-151
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表文章151-152
• 致謝152

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：609589