本文關(guān)鍵詞：乙醛脫氫酶2對代謝綜合征小鼠心肌的保護作用及機制研究

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【摘要】：研究背景目前,心腦血管病已經(jīng)在發(fā)展中國家開始蔓延,成為世界首位的死亡原因,嚴重地危害著人類的生命和健康,而心力衰竭作為各種心臟病發(fā)展的嚴重階段,正在成為本世紀最重要的心血管病癥。有流行病學資料顯示,全球心衰患者的數(shù)量以每年約200萬的速度遞增,并且心衰的病死率高,5年存活率與惡性腫瘤接近�，F(xiàn)已明確,各種原因引起的心肌重構(gòu)是導致心衰發(fā)生發(fā)展的基本病理生理基礎(chǔ)。心肌重構(gòu)是由一系列復雜的分子及細胞機制導致的心肌結(jié)構(gòu)、功能和表型的變化。其心肌生物學特征改變包括：心肌細胞凋亡；病理性心肌細胞肥大；心肌細胞外基質(zhì)降解增加或過度纖維化。其心臟幾何學特征改變?yōu)椋盒募≈亓亢托氖胰萘康脑黾樱恍氖倚螤畹母淖�；心臟結(jié)構(gòu)和功能的改變,最終導致心功能失代償,即心力衰竭。臨床多種疾病均可導致心肌重構(gòu),如高血壓、糖尿病、肥胖、冠心病、瓣膜病等。近年來,肥胖及糖、脂代謝紊亂等非血流動力學因素對心臟結(jié)構(gòu)和功能的作用日益受到重視。代謝綜合征(Metabolic syndrome, MS)為肥胖、血脂紊亂、高血壓、血糖調(diào)節(jié)受損或胰島素抵抗等多種心血管疾病危險因素的簇集。MS及其各組分均可對心臟結(jié)構(gòu)及功能造成顯著的影響,其中以左心室結(jié)構(gòu)改變?yōu)樽钤缙诤妥钔怀龅谋憩F(xiàn),有研究表明,左室結(jié)構(gòu)改變是心臟病患者病死率上升的獨立危險因素。目前,MS在我國發(fā)病率逐年上升,因此,防治MS心肌重構(gòu)已成為治療的首要目標。預(yù)防MS所致心肌損傷、延緩左室重構(gòu),可改善心力衰竭的長期臨床預(yù)后。乙醛脫氫酶2 (Aldehyde dehydrogenase, ALDH2)是線粒體內(nèi)一種重要的醛類氧化酶,能夠?qū)⒏鞣N外源性和內(nèi)源性醛類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酸,減少醛類物質(zhì)導致的細胞損傷。研究表明,心臟缺血-再灌注損傷過程中,ALDH2活性與心肌梗死面積高度負相關(guān),提示ALDH2具有重要的心肌保護作用；另有研究顯示,ALDH2可通過代謝4-HNE等毒性醛類而在心肌梗死過程中起到抗心肌細胞凋亡并改善心室重構(gòu)的作用。盡管國內(nèi)外學者在ALDH2心肌保護方面開展了部分研究,但MS導致的心肌損傷、重構(gòu)是否與ALDH2的表達和活性抑制有關(guān),過表達ALDH2是否可以起到MS心肌的保護作用,其作用是否與調(diào)控JNK/AP-1有關(guān),迄今未見報道。因此,我們推測：MS導致的心肌損傷重構(gòu)過程與內(nèi)源性ALDH2表達和活性的下降有關(guān),過表達或增強ALDH2舌性可以起到干預(yù)MS心肌重構(gòu),改善心功能,進而起到MS心肌的保護作用,其作用機制可能與ALDH2減輕氧化應(yīng)激,調(diào)控JNK/AP-1表達,改善胰島素抵抗,減少心肌細胞凋亡及心肌間質(zhì)纖維化有關(guān)。本課題立足于ALDH2與MS心肌保護之間存在著密切關(guān)系,以心肌細胞凋亡和心肌間質(zhì)纖維化為切入點,我們采用高脂飲食誘導MS小鼠模型,超聲和組織學檢測評價心臟結(jié)構(gòu)與功能異常,明確MS小鼠心肌ALDH2活性與心功能的關(guān)系；過表達ALDH2,進而探討ALDH2對MS小鼠心肌重構(gòu)發(fā)展過程中JNK/AP-1及心肌細胞凋亡、心肌間質(zhì)纖維化等重要因子表達的影響,不僅有助于闡明ALDH2干預(yù)MS心肌重構(gòu)的內(nèi)在分子機制,而且可以為該酶靶點的心肌保護作用提供新的思路和治療策略。研究目的1.高脂飲食誘導MS小鼠心肌重構(gòu),評價MS小鼠心肌重構(gòu)的特征改變；2.觀察MS小鼠心肌ALDH2表達及活性變化趨勢,探討ALDH2活性是否與心功能EF值呈正相關(guān)；3.評價ALDH2對MS小鼠心肌細胞凋亡及心肌纖維化的影響,探討ALDH2對MS小鼠心肌結(jié)構(gòu)和功能的保護作用；4.探討ALDH2干預(yù)MS小鼠心肌重構(gòu)的具體分子作用機制,為臨床干預(yù)MS心肌重構(gòu)提供新的治療靶點。研究方法高脂飲食誘導建立MS小鼠模型：將90只雄性C57 BL/6J小鼠隨機分為正常對照組(NC組,n=15只)和模型組(n=75只)。NC組以標準飼料喂養(yǎng)；模型組以高脂飼料喂養(yǎng)。飼料具體配方構(gòu)成比為基礎(chǔ)料61%,豬油27.5%,酪蛋白8.5%,膽固醇1.2%,膽酸鈉0.2%,磷酸氫鈣0.6%,石粉0.6%,添加劑0.4%。喂養(yǎng)10周后將造模成功的55只MS小鼠隨機分為三組：MS組(n=15只),繼續(xù)以高脂喂養(yǎng)；ALDH2載體組(n=20只),繼續(xù)高脂喂養(yǎng),并左心室注射ALDH2慢病毒載體；GFP組(n=20只),繼續(xù)高脂喂養(yǎng),并左心室注射不攜帶ALDH2重組基因的GFP載體。轉(zhuǎn)染慢病毒載體4周后,處死動物,留取心臟組織備用。實驗過程中進行以下指標監(jiān)測：(1)每2周應(yīng)用電子秤測量小鼠體重。(2)小鼠開始喂養(yǎng)前、喂養(yǎng)10周及轉(zhuǎn)染病毒載體4周后,檢測血清總膽固醇(Total cholesterol、甘油三酯(Triglycerides、低密度脂蛋白膽固醇(LoWdensity lipoprotein-cholesterol, LDL-C)、空腹血糖(Fasting blood glucose, FBG)以及胰島素(Fasting blood insulin, FINS),并計算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗評價指數(shù)(Homeostasis model assessment of insulin resistance, HOMA-IR, HOMA-IR= FBG×FINS/22.5)o(3)小鼠開始喂養(yǎng)10周及轉(zhuǎn)染載體4周后,應(yīng)用高分辨顯微超聲儀測量小鼠舒張末期左室內(nèi)徑(Left ventricular end-diastolic diameter, LVEDD)、收縮末期內(nèi)徑(Left ventricular end systolic diameter, LVESD),并計算左室質(zhì)量(left ventricular mass, LVM)、射血分數(shù)(Ejection fraction, EF)及左室短軸縮短率(Left ventricular short axis reduced rates, FS)。實驗結(jié)束時處死動物,留取心臟標本,進行下列實驗：(1)分光光度法測定線粒體ALDH2活性。(2)透射電鏡檢測小鼠心肌超微結(jié)構(gòu)；心肌組織病理學檢測(HE染色、Masson染色)心肌結(jié)構(gòu)及心肌纖維化。(3) TUNEL法檢測左室心肌細胞的凋亡率；JC-1熒光探針檢測線粒體膜電位。(4)DCF法檢測心肌細胞內(nèi)ROS的水平。(5)免疫組化染色檢測心肌組織4-HNE含量。(6)實時定量RT-PCR法檢測TGF-β1、膠原Ⅰ、膠原Ⅲ mRNA表達,β-actin基因用作內(nèi)參基因。(7) Western blot法檢測p-JNK、AP-1、p-IRS-1(Ser 307)、IRS-1、p-AKT、 AKT、caspase-3以及ALDH2蛋白表達,(3-actin作為內(nèi)參進行定量分析。統(tǒng)計學分析：所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±s)表示,應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對資料進行分析。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,干預(yù)前后比較采用配對t檢驗；三組以上比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),多組間兩兩比較采用LSD (Least significant difference)檢驗；各指標間相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)。以P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。研究結(jié)果1.MS小鼠模型成功建立在模型建立過程中,模型組小鼠共死亡5只,并剔除不符合MS標準的小鼠后,最終55只成模,正常對照組無死亡。轉(zhuǎn)染后,ALDH2載體組及GFP組各死亡6只,陽性對照組死亡1只,最終共57只小鼠完成實驗：NC組(n=15只),MS組(n=14只),ALDH2載體組(n=14只),GFP組(n=14只)。C57 BL/6J小鼠高飼喂養(yǎng)10周后,表現(xiàn)出明顯的MS特征。與NC組比較,模型組小鼠體重增加,血清TC、TG、LDL-C、FBG及FINS增高,計算HOMA-IR升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。表明經(jīng)10周高飼喂養(yǎng),已成功建立了MS小鼠模型。2. ALDH2轉(zhuǎn)染后有效改善MS小鼠各項代謝指標及體重轉(zhuǎn)染ALDH2慢病毒載體4周后,與MS組及GFP組比較,ALDH2載體組血清FBG、FINS水平下降,計算HOMA-IR降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)；體重、TG、TC、LDL-C有所下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.各組小鼠心肌ALDH2活性及蛋白表達的變化與NC組小鼠比較,MS組小鼠心肌線粒體ALDH2活性明顯下降(P0.01)；其ALDH2活性下降約40%；與NC組小鼠比較,MS組小鼠ALDH2蛋白表達降低(P0.01)。轉(zhuǎn)染ALDH2'慢病毒載體后,小鼠心肌ALDH2蛋白表達及活性明顯升高(P0.01)。4.轉(zhuǎn)染ALDH2慢病毒載體對MS小鼠心肌氧化應(yīng)激指標的影響MS組小鼠心肌細胞內(nèi)ROS水平顯著高于NC組小鼠(P0.01),而ALDH2組小鼠心肌細胞內(nèi)ROS水平較MS組降低,但無統(tǒng)計學差異(P0.05)。4-HNE免疫組織化學染色結(jié)果顯示,MS組小鼠心肌4-HNE含量高于NC組小鼠(P0.01)；與MS組和GFP組相比較,ALDH2組小鼠4-HNE含量明顯下降(P0.01)。提示ALDH2舌性及蛋白表達增高,可有效清除4-HNE,進而改善小鼠心肌氧化應(yīng)激狀態(tài)。5. ALDH2轉(zhuǎn)染后有效改善MS小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能與NC組相比,MS組小鼠LVEDD及LVESD 顯著增加(P0.01),EF及FS顯著下降(P0.01)。與MS組和GFP組相比,ALDH2組小鼠LVEDD及LVESD顯著下降,且EF及FS顯著提高(P0.05)。6. ALDH2轉(zhuǎn)染后有效改善MS小鼠心肌形態(tài)學、超微結(jié)構(gòu)HE染色結(jié)果顯示,與NC組比較,MS組小鼠心肌細胞排列紊亂,可見肌纖維斷裂。與MS組及GFP組比較,ALDH2載體組心肌結(jié)構(gòu)紊亂有所改善。透射電鏡結(jié)果顯示,NC組可見肌纖維沿長軸整齊排列,肌小節(jié)及明暗帶清晰規(guī)則：線粒體豐富,大小較一致；細胞間質(zhì)可見成纖維細胞和少量膠原纖維。MS組及GFP組肌纖維排列紊亂,Z線消失明顯；胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹,線粒體腫脹、空泡化,自噬體出現(xiàn),可見凋亡小體；間質(zhì)充滿增生的膠原纖維,膠原纖維走形紊亂,斷裂。與MS組及GFP組相比,ALDH2組肌纖維的排列較為整齊,線粒體腫脹、空泡化明顯改善；膠原纖維明顯減少,排列相對整齊。7. ALDH2轉(zhuǎn)染后可通過調(diào)控JNK/AP-1表達,影響IRS-1/AKT/caspase3通路以減少心肌細胞凋亡TUNEL.染色陽性的細胞即為凋亡細胞,細胞核可被染色為棕褐色或棕黃色的顆粒。TUNEL染色陽性細胞在NC組小鼠心肌細胞中數(shù)量極少,而在MS組小鼠心肌細胞中明顯增多,有顯著性差異(P0.01)；與MS組及GFP組相比,ALDH2組TUNEL染色陽性細胞明顯減少,有顯著性差異(P0.01)。JC-1檢測線粒體膜電位變化：與NC組比較,MS組及GFP組小鼠線粒體膜電位明顯下降(P0.01)。與MS組及GFP組比較,ALDH2組線粒體膜電位升高(P0.05)。Western blot法檢測重要因子蛋白表達：與NC組比較,MS組及GFP組p-JNK、AP-1、p-IRS-1 (Ser 307)、IRS-1、caspase-3蛋白表達升高,p-AKT/AKT蛋白表達下降,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)；與MS組及GFP組比較,ALDH2組p-JNK、AP-1、-IRS-1(Ser 307)、caspase-3蛋白表達下降,p-AKT/ AKT蛋白表達升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。8. ALDH2轉(zhuǎn)染后可通過調(diào)控JNK/AP-1表達,進而通過抑制TGF-β1/膠原合成以減少心肌纖維化Masson染色結(jié)果顯示,NC組的心肌間質(zhì)膠原組織排列整齊,分布較均勻；與NC組相比,MS組和GFP組膠原纖維明顯增多,圍繞心肌細胞的膠原纖維排列紊亂甚至斷裂；與MS組及GFP組相比,ALDH2組膠原纖維則明顯減少,排列較規(guī)則整齊。膠原定量分析顯示：MS組心肌CVF升高,膠原相對含量較NC組明顯增多(P0.01); ALDH2組膠原相對含量較MS組明顯減少(P0.05)。RT-PCR檢測TGF-p1、膠原Ⅰ、膠原Ⅲ mRNA表達：與NC組比較,MS組及GFP組小鼠心肌TGF-β1、膠原Ⅰ、膠原Ⅲ mRNA表達均上調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)；與MS組及GFP組比較,ALDH2載體組小鼠心肌TGF-β1、膠原Ⅰ、膠原Ⅲ mRNA表達下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。研究結(jié)論(1)通過高脂飲食喂養(yǎng)C57 BL/6小鼠可誘導與人類MS相類似的MS模型。該模型存在左室結(jié)構(gòu)改變、心肌細胞凋亡增多、心肌間質(zhì)纖維化等心肌重構(gòu)特征,為本研究提供了可靠的動物模型。(2)MS小鼠心肌重構(gòu)過程中ALDH2表達及活性均下降,ALDH2活性與心功能EF值呈明顯正相關(guān)。(3) ALDH2可通過清除4-HNE,改善胰島素抵抗,起到保護MS小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的作用。(4) ALDH2可通過調(diào)控JNK/AP-1,影響IRS-1/AKT/caspase3表達,減少心肌細胞凋亡,延緩心肌重構(gòu),改善心臟功能。(5) ALDH2可通過調(diào)控JNK/AP-1,抑制TGF-β1/膠原合成,減少心肌纖維化,改善心肌重構(gòu)。因此,本研究為MS小鼠心肌重構(gòu)的干預(yù)治療的提供了一種新思路、新策略。
【關(guān)鍵詞】：代謝綜合征 乙醛脫氫酶2 心肌重構(gòu) 細胞凋亡 心肌纖維化
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R542.2
【目錄】：

• 中文摘要8-14
• 英文摘要14-21
• 符號說明21-23
• 第一部分 代謝綜合征小鼠心肌ALDH2活性與心功能的關(guān)系23-60
• 前言23-24
• 1.材料與方法24-36
• 2.結(jié)果36-38
• 3.討論38-42
• 4.結(jié)論42-43
• 附表43-48
• 附圖48-53
• 參考文獻53-60
• 第二部 ALDH2對代謝綜合征小鼠心肌結(jié)構(gòu)和功能的保護作用60-103
• 前言60-61
• 1.材料與方法61-74
• 2.結(jié)果74-75
• 3.討論75-84
• 4.結(jié)論84-85
• 附圖85-94
• 參考文獻94-103
• 第三部分 ALDH2干預(yù)MS小鼠心肌重構(gòu)的分子機制研究103-134
• 前言103-104
• 1.材料與方法104-111
• 2.結(jié)果111-112
• 3.討論112-121
• 4.結(jié)論121-122
• 附圖122-126
• 參考文獻126-134
• 致謝134-135
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文目錄135-136
• 附件136-137
• 英文論文Ⅰ137-166
• 英文論文Ⅱ166-188

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 汪R，

本文編號：603022