本文關(guān)鍵詞：乙醛脫氫酶2對(duì)代謝綜合征小鼠心肌的保護(hù)作用及機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 代謝綜合征 乙醛脫氫酶2 心肌重構(gòu) 細(xì)胞凋亡 心肌纖維化

【摘要】：研究背景目前,心腦血管病已經(jīng)在發(fā)展中國(guó)家開(kāi)始蔓延,成為世界首位的死亡原因,嚴(yán)重地危害著人類(lèi)的生命和健康,而心力衰竭作為各種心臟病發(fā)展的嚴(yán)重階段,正在成為本世紀(jì)最重要的心血管病癥。有流行病學(xué)資料顯示,全球心衰患者的數(shù)量以每年約200萬(wàn)的速度遞增,并且心衰的病死率高,5年存活率與惡性腫瘤接近。現(xiàn)已明確,各種原因引起的心肌重構(gòu)是導(dǎo)致心衰發(fā)生發(fā)展的基本病理生理基礎(chǔ)。心肌重構(gòu)是由一系列復(fù)雜的分子及細(xì)胞機(jī)制導(dǎo)致的心肌結(jié)構(gòu)、功能和表型的變化。其心肌生物學(xué)特征改變包括：心肌細(xì)胞凋亡；病理性心肌細(xì)胞肥大；心肌細(xì)胞外基質(zhì)降解增加或過(guò)度纖維化。其心臟幾何學(xué)特征改變?yōu)椋盒募≈亓亢托氖胰萘康脑黾樱恍氖倚螤畹母淖�；心臟結(jié)構(gòu)和功能的改變,最終導(dǎo)致心功能失代償,即心力衰竭。臨床多種疾病均可導(dǎo)致心肌重構(gòu),如高血壓、糖尿病、肥胖、冠心病、瓣膜病等。近年來(lái),肥胖及糖、脂代謝紊亂等非血流動(dòng)力學(xué)因素對(duì)心臟結(jié)構(gòu)和功能的作用日益受到重視。代謝綜合征(Metabolic syndrome, MS)為肥胖、血脂紊亂、高血壓、血糖調(diào)節(jié)受損或胰島素抵抗等多種心血管疾病危險(xiǎn)因素的簇集。MS及其各組分均可對(duì)心臟結(jié)構(gòu)及功能造成顯著的影響,其中以左心室結(jié)構(gòu)改變?yōu)樽钤缙诤妥钔怀龅谋憩F(xiàn),有研究表明,左室結(jié)構(gòu)改變是心臟病患者病死率上升的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。目前,MS在我國(guó)發(fā)病率逐年上升,因此,防治MS心肌重構(gòu)已成為治療的首要目標(biāo)。預(yù)防MS所致心肌損傷、延緩左室重構(gòu),可改善心力衰竭的長(zhǎng)期臨床預(yù)后。乙醛脫氫酶2 (Aldehyde dehydrogenase, ALDH2)是線(xiàn)粒體內(nèi)一種重要的醛類(lèi)氧化酶,能夠?qū)⒏鞣N外源性和內(nèi)源性醛類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酸,減少醛類(lèi)物質(zhì)導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。研究表明,心臟缺血-再灌注損傷過(guò)程中,ALDH2活性與心肌梗死面積高度負(fù)相關(guān),提示ALDH2具有重要的心肌保護(hù)作用；另有研究顯示,ALDH2可通過(guò)代謝4-HNE等毒性醛類(lèi)而在心肌梗死過(guò)程中起到抗心肌細(xì)胞凋亡并改善心室重構(gòu)的作用。盡管?chē)?guó)內(nèi)外學(xué)者在A(yíng)LDH2心肌保護(hù)方面開(kāi)展了部分研究,但MS導(dǎo)致的心肌損傷、重構(gòu)是否與ALDH2的表達(dá)和活性抑制有關(guān),過(guò)表達(dá)ALDH2是否可以起到MS心肌的保護(hù)作用,其作用是否與調(diào)控JNK/AP-1有關(guān),迄今未見(jiàn)報(bào)道。因此,我們推測(cè)：MS導(dǎo)致的心肌損傷重構(gòu)過(guò)程與內(nèi)源性ALDH2表達(dá)和活性的下降有關(guān),過(guò)表達(dá)或增強(qiáng)ALDH2舌性可以起到干預(yù)MS心肌重構(gòu),改善心功能,進(jìn)而起到MS心肌的保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能與ALDH2減輕氧化應(yīng)激,調(diào)控JNK/AP-1表達(dá),改善胰島素抵抗,減少心肌細(xì)胞凋亡及心肌間質(zhì)纖維化有關(guān)。本課題立足于A(yíng)LDH2與MS心肌保護(hù)之間存在著密切關(guān)系,以心肌細(xì)胞凋亡和心肌間質(zhì)纖維化為切入點(diǎn),我們采用高脂飲食誘導(dǎo)MS小鼠模型,超聲和組織學(xué)檢測(cè)評(píng)價(jià)心臟結(jié)構(gòu)與功能異常,明確MS小鼠心肌ALDH2活性與心功能的關(guān)系；過(guò)表達(dá)ALDH2,進(jìn)而探討ALDH2對(duì)MS小鼠心肌重構(gòu)發(fā)展過(guò)程中JNK/AP-1及心肌細(xì)胞凋亡、心肌間質(zhì)纖維化等重要因子表達(dá)的影響,不僅有助于闡明ALDH2干預(yù)MS心肌重構(gòu)的內(nèi)在分子機(jī)制,而且可以為該酶靶點(diǎn)的心肌保護(hù)作用提供新的思路和治療策略。研究目的1.高脂飲食誘導(dǎo)MS小鼠心肌重構(gòu),評(píng)價(jià)MS小鼠心肌重構(gòu)的特征改變；2.觀(guān)察MS小鼠心肌ALDH2表達(dá)及活性變化趨勢(shì),探討ALDH2活性是否與心功能EF值呈正相關(guān)；3.評(píng)價(jià)ALDH2對(duì)MS小鼠心肌細(xì)胞凋亡及心肌纖維化的影響,探討ALDH2對(duì)MS小鼠心肌結(jié)構(gòu)和功能的保護(hù)作用；4.探討ALDH2干預(yù)MS小鼠心肌重構(gòu)的具體分子作用機(jī)制,為臨床干預(yù)MS心肌重構(gòu)提供新的治療靶點(diǎn)。研究方法高脂飲食誘導(dǎo)建立MS小鼠模型：將90只雄性C57 BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組,n=15只)和模型組(n=75只)。NC組以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)；模型組以高脂飼料喂養(yǎng)。飼料具體配方構(gòu)成比為基礎(chǔ)料61%,豬油27.5%,酪蛋白8.5%,膽固醇1.2%,膽酸鈉0.2%,磷酸氫鈣0.6%,石粉0.6%,添加劑0.4%。喂養(yǎng)10周后將造模成功的55只MS小鼠隨機(jī)分為三組：MS組(n=15只),繼續(xù)以高脂喂養(yǎng)；ALDH2載體組(n=20只),繼續(xù)高脂喂養(yǎng),并左心室注射ALDH2慢病毒載體；GFP組(n=20只),繼續(xù)高脂喂養(yǎng),并左心室注射不攜帶ALDH2重組基因的GFP載體。轉(zhuǎn)染慢病毒載體4周后,處死動(dòng)物,留取心臟組織備用。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中進(jìn)行以下指標(biāo)監(jiān)測(cè)：(1)每2周應(yīng)用電子秤測(cè)量小鼠體重。(2)小鼠開(kāi)始喂養(yǎng)前、喂養(yǎng)10周及轉(zhuǎn)染病毒載體4周后,檢測(cè)血清總膽固醇(Total cholesterol、甘油三酯(Triglycerides、低密度脂蛋白膽固醇(LoWdensity lipoprotein-cholesterol, LDL-C)、空腹血糖(Fasting blood glucose, FBG)以及胰島素(Fasting blood insulin, FINS),并計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗評(píng)價(jià)指數(shù)(Homeostasis model assessment of insulin resistance, HOMA-IR, HOMA-IR= FBG×FINS/22.5)o(3)小鼠開(kāi)始喂養(yǎng)10周及轉(zhuǎn)染載體4周后,應(yīng)用高分辨顯微超聲儀測(cè)量小鼠舒張末期左室內(nèi)徑(Left ventricular end-diastolic diameter, LVEDD)、收縮末期內(nèi)徑(Left ventricular end systolic diameter, LVESD),并計(jì)算左室質(zhì)量(left ventricular mass, LVM)、射血分?jǐn)?shù)(Ejection fraction, EF)及左室短軸縮短率(Left ventricular short axis reduced rates, FS)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死動(dòng)物,留取心臟標(biāo)本,進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)：(1)分光光度法測(cè)定線(xiàn)粒體ALDH2活性。(2)透射電鏡檢測(cè)小鼠心肌超微結(jié)構(gòu)；心肌組織病理學(xué)檢測(cè)(HE染色、Masson染色)心肌結(jié)構(gòu)及心肌纖維化。(3) TUNEL法檢測(cè)左室心肌細(xì)胞的凋亡率；JC-1熒光探針檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位。(4)DCF法檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。(5)免疫組化染色檢測(cè)心肌組織4-HNE含量。(6)實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)TGF-β1、膠原Ⅰ、膠原Ⅲ mRNA表達(dá),β-actin基因用作內(nèi)參基因。(7) Western blot法檢測(cè)p-JNK、AP-1、p-IRS-1(Ser 307)、IRS-1、p-AKT、 AKT、caspase-3以及ALDH2蛋白表達(dá),(3-actin作為內(nèi)參進(jìn)行定量分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)資料進(jìn)行分析。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),干預(yù)前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；三組以上比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),多組間兩兩比較采用LSD (Least significant difference)檢驗(yàn)；各指標(biāo)間相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)。以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果1.MS小鼠模型成功建立在模型建立過(guò)程中,模型組小鼠共死亡5只,并剔除不符合MS標(biāo)準(zhǔn)的小鼠后,最終55只成模,正常對(duì)照組無(wú)死亡。轉(zhuǎn)染后,ALDH2載體組及GFP組各死亡6只,陽(yáng)性對(duì)照組死亡1只,最終共57只小鼠完成實(shí)驗(yàn)：NC組(n=15只),MS組(n=14只),ALDH2載體組(n=14只),GFP組(n=14只)。C57 BL/6J小鼠高飼喂養(yǎng)10周后,表現(xiàn)出明顯的MS特征。與NC組比較,模型組小鼠體重增加,血清TC、TG、LDL-C、FBG及FINS增高,計(jì)算HOMA-IR升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。表明經(jīng)10周高飼喂養(yǎng),已成功建立了MS小鼠模型。2. ALDH2轉(zhuǎn)染后有效改善MS小鼠各項(xiàng)代謝指標(biāo)及體重轉(zhuǎn)染ALDH2慢病毒載體4周后,與MS組及GFP組比較,ALDH2載體組血清FBG、FINS水平下降,計(jì)算HOMA-IR降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；體重、TG、TC、LDL-C有所下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.各組小鼠心肌ALDH2活性及蛋白表達(dá)的變化與NC組小鼠比較,MS組小鼠心肌線(xiàn)粒體ALDH2活性明顯下降(P0.01)；其ALDH2活性下降約40%；與NC組小鼠比較,MS組小鼠ALDH2蛋白表達(dá)降低(P0.01)。轉(zhuǎn)染ALDH2'慢病毒載體后,小鼠心肌ALDH2蛋白表達(dá)及活性明顯升高(P0.01)。4.轉(zhuǎn)染ALDH2慢病毒載體對(duì)MS小鼠心肌氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響MS組小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著高于NC組小鼠(P0.01),而ALDH2組小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平較MS組降低,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。4-HNE免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,MS組小鼠心肌4-HNE含量高于NC組小鼠(P0.01)；與MS組和GFP組相比較,ALDH2組小鼠4-HNE含量明顯下降(P0.01)。提示ALDH2舌性及蛋白表達(dá)增高,可有效清除4-HNE,進(jìn)而改善小鼠心肌氧化應(yīng)激狀態(tài)。5. ALDH2轉(zhuǎn)染后有效改善MS小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能與NC組相比,MS組小鼠LVEDD及LVESD 顯著增加(P0.01),EF及FS顯著下降(P0.01)。與MS組和GFP組相比,ALDH2組小鼠LVEDD及LVESD顯著下降,且EF及FS顯著提高(P0.05)。6. ALDH2轉(zhuǎn)染后有效改善MS小鼠心肌形態(tài)學(xué)、超微結(jié)構(gòu)HE染色結(jié)果顯示,與NC組比較,MS組小鼠心肌細(xì)胞排列紊亂,可見(jiàn)肌纖維斷裂。與MS組及GFP組比較,ALDH2載體組心肌結(jié)構(gòu)紊亂有所改善。透射電鏡結(jié)果顯示,NC組可見(jiàn)肌纖維沿長(zhǎng)軸整齊排列,肌小節(jié)及明暗帶清晰規(guī)則：線(xiàn)粒體豐富,大小較一致；細(xì)胞間質(zhì)可見(jiàn)成纖維細(xì)胞和少量膠原纖維。MS組及GFP組肌纖維排列紊亂,Z線(xiàn)消失明顯；胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹,線(xiàn)粒體腫脹、空泡化,自噬體出現(xiàn),可見(jiàn)凋亡小體；間質(zhì)充滿(mǎn)增生的膠原纖維,膠原纖維走形紊亂,斷裂。與MS組及GFP組相比,ALDH2組肌纖維的排列較為整齊,線(xiàn)粒體腫脹、空泡化明顯改善；膠原纖維明顯減少,排列相對(duì)整齊。7. ALDH2轉(zhuǎn)染后可通過(guò)調(diào)控JNK/AP-1表達(dá),影響IRS-1/AKT/caspase3通路以減少心肌細(xì)胞凋亡TUNEL.染色陽(yáng)性的細(xì)胞即為凋亡細(xì)胞,細(xì)胞核可被染色為棕褐色或棕黃色的顆粒。TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞在NC組小鼠心肌細(xì)胞中數(shù)量極少,而在MS組小鼠心肌細(xì)胞中明顯增多,有顯著性差異(P0.01)；與MS組及GFP組相比,ALDH2組TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少,有顯著性差異(P0.01)。JC-1檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位變化：與NC組比較,MS組及GFP組小鼠線(xiàn)粒體膜電位明顯下降(P0.01)。與MS組及GFP組比較,ALDH2組線(xiàn)粒體膜電位升高(P0.05)。Western blot法檢測(cè)重要因子蛋白表達(dá)：與NC組比較,MS組及GFP組p-JNK、AP-1、p-IRS-1 (Ser 307)、IRS-1、caspase-3蛋白表達(dá)升高,p-AKT/AKT蛋白表達(dá)下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；與MS組及GFP組比較,ALDH2組p-JNK、AP-1、-IRS-1(Ser 307)、caspase-3蛋白表達(dá)下降,p-AKT/ AKT蛋白表達(dá)升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。8. ALDH2轉(zhuǎn)染后可通過(guò)調(diào)控JNK/AP-1表達(dá),進(jìn)而通過(guò)抑制TGF-β1/膠原合成以減少心肌纖維化Masson染色結(jié)果顯示,NC組的心肌間質(zhì)膠原組織排列整齊,分布較均勻；與NC組相比,MS組和GFP組膠原纖維明顯增多,圍繞心肌細(xì)胞的膠原纖維排列紊亂甚至斷裂；與MS組及GFP組相比,ALDH2組膠原纖維則明顯減少,排列較規(guī)則整齊。膠原定量分析顯示：MS組心肌CVF升高,膠原相對(duì)含量較NC組明顯增多(P0.01); ALDH2組膠原相對(duì)含量較MS組明顯減少(P0.05)。RT-PCR檢測(cè)TGF-p1、膠原Ⅰ、膠原Ⅲ mRNA表達(dá)：與NC組比較,MS組及GFP組小鼠心肌TGF-β1、膠原Ⅰ、膠原Ⅲ mRNA表達(dá)均上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；與MS組及GFP組比較,ALDH2載體組小鼠心肌TGF-β1、膠原Ⅰ、膠原Ⅲ mRNA表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。研究結(jié)論(1)通過(guò)高脂飲食喂養(yǎng)C57 BL/6小鼠可誘導(dǎo)與人類(lèi)MS相類(lèi)似的MS模型。該模型存在左室結(jié)構(gòu)改變、心肌細(xì)胞凋亡增多、心肌間質(zhì)纖維化等心肌重構(gòu)特征,為本研究提供了可靠的動(dòng)物模型。(2)MS小鼠心肌重構(gòu)過(guò)程中ALDH2表達(dá)及活性均下降,ALDH2活性與心功能EF值呈明顯正相關(guān)。(3) ALDH2可通過(guò)清除4-HNE,改善胰島素抵抗,起到保護(hù)MS小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的作用。(4) ALDH2可通過(guò)調(diào)控JNK/AP-1,影響IRS-1/AKT/caspase3表達(dá),減少心肌細(xì)胞凋亡,延緩心肌重構(gòu),改善心臟功能。(5) ALDH2可通過(guò)調(diào)控JNK/AP-1,抑制TGF-β1/膠原合成,減少心肌纖維化,改善心肌重構(gòu)。因此,本研究為MS小鼠心肌重構(gòu)的干預(yù)治療的提供了一種新思路、新策略。
【關(guān)鍵詞】：代謝綜合征 乙醛脫氫酶2 心肌重構(gòu) 細(xì)胞凋亡 心肌纖維化
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R542.2
【目錄】：

• 中文摘要8-14
• 英文摘要14-21
• 符號(hào)說(shuō)明21-23
• 第一部分 代謝綜合征小鼠心肌ALDH2活性與心功能的關(guān)系23-60
• 前言23-24
• 1.材料與方法24-36
• 2.結(jié)果36-38
• 3.討論38-42
• 4.結(jié)論42-43
• 附表43-48
• 附圖48-53
• 參考文獻(xiàn)53-60
• 第二部 ALDH2對(duì)代謝綜合征小鼠心肌結(jié)構(gòu)和功能的保護(hù)作用60-103
• 前言60-61
• 1.材料與方法61-74
• 2.結(jié)果74-75
• 3.討論75-84
• 4.結(jié)論84-85
• 附圖85-94
• 參考文獻(xiàn)94-103
• 第三部分 ALDH2干預(yù)MS小鼠心肌重構(gòu)的分子機(jī)制研究103-134
• 前言103-104
• 1.材料與方法104-111
• 2.結(jié)果111-112
• 3.討論112-121
• 4.結(jié)論121-122
• 附圖122-126
• 參考文獻(xiàn)126-134
• 致謝134-135
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄135-136
• 附件136-137
• 英文論文Ⅰ137-166
• 英文論文Ⅱ166-188

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

1 汪R，

本文編號(hào)：603022