本文關(guān)鍵詞：SEVI淀粉樣纖維結(jié)構(gòu)形成的影響因素及抑制劑的研究

  更多相關(guān)文章： 前列腺酸性磷酸酶 精液源性病毒感染增強(qiáng)因子 gp120衍生多肽 淀粉樣纖維 HIV進(jìn)入抑制劑 雙功能殺微生物劑

【摘要】：目前異性間性傳播已成為艾滋病傳播的主要途徑。殺微生物劑是一種可被女性控制的有效避免HIV感染的手段之一。但是,迄今為止尚無(wú)殺微生物劑類藥物問(wèn)世,7個(gè)已完成Ⅱ/Ⅲ期臨床試驗(yàn)的候選殺微生物劑的研究結(jié)果均令人失望。這些殺微生物劑臨床試驗(yàn)失敗的原因是什么呢?由于殺微生物劑用藥部位為陰道,其藥效不能忽視精液對(duì)殺微生物劑的影響。2007年,德國(guó)Ulm大學(xué)Munch J等人研究發(fā)現(xiàn),精液中存在的前列腺酸性磷酸酶多肽片段(PAP248-286)能形成淀粉樣纖維,促進(jìn)HIV的感染。這一多肽形成的淀粉樣纖維稱為精液源性病毒感染增強(qiáng)因子,即SEVI。研究證實(shí),SEVI促進(jìn)HIV病毒感染可能的作用機(jī)理主要是其形成的淀粉樣纖維具有極強(qiáng)的陽(yáng)離子特性,能通過(guò)兩種方式增強(qiáng)HIV感染：1)降低HIV病毒顆粒與靶細(xì)胞之間的靜電排斥；2)捕獲HIV病毒顆粒并增加病毒在靶細(xì)胞表面的沉降,有助于病毒與宿主細(xì)胞相互作用,從而增加病毒顆粒與靶細(xì)胞之間的吸附。此后又有研究發(fā)現(xiàn)精液中含有其他淀粉樣纖維增強(qiáng)HIV感染,第一個(gè)是N末端的PAP85-120,第二個(gè)是,2011年,Roan NR等人發(fā)現(xiàn)的精液液化功能最密切的生精蛋白即精液凝固蛋白(SEM)的生理性降解多肽。SEVI或SEM1在體外形成淀粉樣纖維的條件比較苛刻,一般需要在37℃,1400 rpm,持續(xù)震蕩一定時(shí)間,才能形成穩(wěn)定成熟的淀粉樣纖維。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),SEVI極有可能是導(dǎo)致多聚陰離子類殺微生物劑臨床試驗(yàn)失敗的主要原因。我們之前研究發(fā)現(xiàn),衍生于HIV-1 MN毒株包膜蛋白gp120的多肽能拮抗融合抑制劑T-20的抗病毒活性,當(dāng)時(shí)推測(cè)T-20能特異與gp120輔助受體結(jié)合區(qū)和gp41跨膜區(qū)結(jié)合,因而具有多靶點(diǎn)的抗HIV融合的機(jī)制。然而在深入研究T-20的作用機(jī)制時(shí),我們并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)T-20與來(lái)源于gp120輔助受體結(jié)合區(qū)域和gp41跨膜區(qū)多肽存在預(yù)期的相互作用。但是,我們近期研究發(fā)現(xiàn),這些衍生多肽,如多肽EP2,無(wú)需上述SEVI及SEM1要求的苛刻條件就可以自發(fā)形成淀粉樣纖維,且該類衍生多肽能明顯促進(jìn)SEVI及SEM1(86-107)淀粉樣纖維的形成,大大縮短SEVI及SEM1(86-107)淀粉樣纖維形成的時(shí)間。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,采用正常HIV-1病毒包膜蛋白gp120攻擊大鼠后,其肝細(xì)胞裂解液中能檢測(cè)出gp120的裂解片段(INMWQG),我們發(fā)現(xiàn)該片段與本項(xiàng)目研究的HIVgp120衍生多肽中的一段序列EP2具有高度重復(fù)性,據(jù)此我們推測(cè)該裂解片段也極有可能促進(jìn)SEVI的形成進(jìn)而增強(qiáng)HIV-1感染。EP2片段在體內(nèi)是否存在目前研究尚未可知,但該段短肽(INMWQG)已經(jīng)證實(shí)是真實(shí)存在在大鼠體內(nèi)的gp120降解片段。為了更好地研發(fā)理想的候選殺微生物劑,我們擬對(duì)SEVI及其它能形成淀粉樣纖維的多肽類物質(zhì)(如SEM1(86-107))促進(jìn)HIV感染的機(jī)制進(jìn)行研究。上述HIV gp120的衍生多肽是否作為一個(gè)種核(seed),促進(jìn)精液淀粉樣纖維的形成?這是否也是導(dǎo)致殺微生物劑臨床試驗(yàn)失敗的原因之一呢?SEVI的發(fā)現(xiàn)不僅可以作為未來(lái)候選殺微生物劑研發(fā)的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)之一,同時(shí)也為艾滋病防治藥物的開發(fā)提供了一個(gè)新的作用靶點(diǎn)。利用藥物阻斷SEVI與病毒顆粒結(jié)合或抑制SEVI淀粉樣纖維的形成,理論上可降低SEVI介導(dǎo)的增強(qiáng)病毒感染作用,從而降低HIV的感染率。理論上,抗SEVI抗體能夠通過(guò)其抗體功能區(qū)與SEVI多肽特異性結(jié)合,從而拮抗SEVI增強(qiáng)病毒感染的作用,課題組前期研究也證實(shí)了這一假設(shè),但抗SEVI抗體自身幾乎沒(méi)有抗病毒活性。NeurathAR和姜世勃等人研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)不同酸酐修飾的一些蛋白,能抑制HIV病毒進(jìn)入靶細(xì)胞,使無(wú)活性的蛋白產(chǎn)生抗HIV活性。近年來(lái),本課題組選用卵清蛋白(Ovabumin, OVA)和人血清白蛋白,制備了酸酐修飾卵清蛋白HP-OVA及酸酐修飾人血清白蛋白HP-HSA,均能高效抑制多種HIV病毒株的感染,其機(jī)理是干擾gp120與CD4受體的相互作用,從而抑制HIV進(jìn)入靶細(xì)胞。既然酸酐修飾能使不具有抗HIV活性的OVA及其它多種蛋白質(zhì)變成高效抗HIV活性的蛋白分子,如果能我們針對(duì)兔抗SEVI多抗進(jìn)行酸酐修飾,也有望提高其自身的抗HIV活性。我們前期也曾制備一種兔抗HIV-1 gp41多克隆抗體(NY363,姜世勃教授發(fā)現(xiàn)的一種能特異性識(shí)別HIV-1 gp41 N及C末端肽形成的六螺旋結(jié)構(gòu)的多克隆抗體),發(fā)現(xiàn)酸酐修飾能顯著提高該抗體的抗病毒活性,且能部分保持其抗體功能區(qū)活性。因而,采用酸酐修飾的抗SEVI多抗,就有可能成為一種既能保持抗體功能區(qū)活性從而拮抗SEVI增強(qiáng)病毒感染作用,其本身又具有高抗HIV活性的雙功能候選殺微生物劑,從而最大程度地避免未來(lái)臨床試驗(yàn)時(shí)因精液中SEVI的存在而導(dǎo)致失敗的可能性。這種酸酐修飾抗SEVI多抗可望解決目前陰離子多聚物類殺微生物劑研發(fā)面臨的困難,成為一種理想的殺微生物劑。因此本課題擬進(jìn)行以下兩部分內(nèi)容的探討：第一部分衍生于HIV-1 gp120的多肽促進(jìn)SEVI淀粉樣纖維形成的作用及機(jī)制研究。目的：擬采用一系列生物物理及生物化學(xué)手段,深入探討這些衍生于HIV包膜蛋白gp120的衍生多肽EP2與SEVI及SEM1(86-107)的淀粉樣纖維形成的相互作用和作用機(jī)制,分析EP2促進(jìn)SEVI及SEM1(86-107)形成從而增強(qiáng)病毒感染的機(jī)理。同時(shí)研究短肽INMWQG(簡(jiǎn)稱為SEMA)能否增強(qiáng)HIV感染及促進(jìn)SEVI,SEM1(86-107)淀粉樣纖維的形成,該研究為臨床殺微生物劑和抗HIV藥物研發(fā)提供理論依據(jù)。方法與結(jié)果采用Zetasizer Nano ZS儀器測(cè)定EP2的粒徑和Zeta電勢(shì),ThT熒光測(cè)定方法,透射電鏡法,我們發(fā)現(xiàn)來(lái)源于HIV gp120的衍生多肽EP2能自組裝形成類納米纖維。透射電鏡法,硫磺素T熒光檢測(cè)方法,剛果紅染色法,圓二色譜法,我們確定EP2顯著促進(jìn)PAP248-286多肽形成SEVI淀粉樣纖維,經(jīng)EP2加速形成的SEVI保持其淀粉樣纖維形態(tài)。用激光共聚焦顯微鏡法和流式細(xì)胞術(shù),確定EP2加速后形成的SEVI能促進(jìn)HIV-1病毒顆粒聚集并增強(qiáng)其與靶細(xì)胞的結(jié)合。采用假病毒和克隆病毒感染實(shí)驗(yàn),我們證實(shí)了經(jīng)EP2加速形成的SEVI保持其增強(qiáng)HIV感染的能力。類似研究EP2加速SEVI形成方法,采用Zetasizer Nano ZS儀器測(cè)定SEMA的粒徑和Zeta電勢(shì),ThT熒光測(cè)定方法,透射電鏡法,我們發(fā)現(xiàn)SEMA能自組裝形成淀粉樣纖維,通過(guò)克隆病毒感染實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù),確定SEMA增強(qiáng)HIV-1感染能力。激光共聚焦顯微鏡法直觀觀察了SEMA促進(jìn)HIV-1病毒顆粒聚集或增強(qiáng)HIV病毒顆粒與靶細(xì)胞的結(jié)合。接著,我們考察SEMA是否加速SEVI或SEM1(86-107)淀粉樣纖維形成的能力。通過(guò)硫磺素T熒光檢測(cè)方法,剛果紅染色法,我們發(fā)現(xiàn)SEMA顯著促進(jìn)PAP248-286或SEM1(86-107)多肽形成淀粉樣纖維,同時(shí)用克隆病毒感染實(shí)驗(yàn),證實(shí)了經(jīng)SEMA加速形成的SEVI或SEM1(86-107)淀粉樣纖維保持其增強(qiáng)HIV感染的能力。結(jié)論1.來(lái)自HIV-1 gp120包膜EP2能自組裝成納米纖維并促進(jìn)精液源性淀粉樣纖維如SEVI的形成；2.正常HIV-1病毒包膜蛋白gp120攻擊大鼠肝細(xì)胞后,其肝細(xì)胞裂解液中能檢測(cè)出的gp120的裂解片段(INMWQG),能增強(qiáng)HIV-1感染,并促進(jìn)精液源性淀粉樣纖維如SEVI, SEMI(86-107)的形成。第二部分 酸酐修飾的兔抗SEVI多克隆抗體IgG (HP-API)作為雙功能殺微生物劑研究。我們的前期研究證明,兔抗SEVI多克隆抗體能特異性地與SEVI多肽結(jié)合,從而產(chǎn)生拮抗SEVI增強(qiáng)病毒感染的作用,但其自身抗HIV病毒活性不強(qiáng)。酸酐修飾蛋白可以使不具有抗HIV活性的OVA變成高抗HIV活性的蛋白分子HP-OVA及ML-OVA。為此,本項(xiàng)目擬以SEVI為藥物作用靶點(diǎn),采用酸酐修飾方法制備酸酐修飾抗SEVI多抗,研發(fā)一種既具有高效抗HIV活性又具有拮抗SEVI病毒增強(qiáng)作用的雙功能候選殺微生物劑。進(jìn)一步采用一系列生物物理及生物化學(xué)手段,深入探討該酸酐修飾抗SEVI抗體與精液及SEVI多肽PAP248-286的相互作用,以評(píng)價(jià)其是否能通過(guò)與SEVI多肽特異性地結(jié)合而拮抗SEVI增強(qiáng)HIV感染的作用,從而最大程度地避免未來(lái)臨床試驗(yàn)失敗的可能性。同時(shí),深入分析酸酐修飾抗SEVI抗體阻止SEVI增強(qiáng)HIV感染的可能的機(jī)制和可能的引起毒性反應(yīng),為后續(xù)的藥物研發(fā)提供理論依據(jù)。方法與結(jié)果ELISA及Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),HP-API保持了API的大部分的抗體特性,能與多肽片段PAP248-286抗原及PAP248-286震蕩形成的淀粉樣纖維SEVI結(jié)合。HP-API本身有具有高抗HIV活性,能對(duì)抗多種HIV-1實(shí)驗(yàn)室及臨床分離株的感染,其IC50均較低。同時(shí),發(fā)現(xiàn)HP-API還能有效抑制各種抗病毒藥物耐藥病毒株的感染。通過(guò)time-of-addition、細(xì)胞與細(xì)胞融合、病毒與細(xì)胞融合及病毒細(xì)胞與細(xì)胞間的傳播等實(shí)驗(yàn)說(shuō)明：HP-API作用于HIV病毒的進(jìn)入階段,是一種HIV病毒進(jìn)入/融合抑制劑,HP-API不抑制HIV病毒感染靶細(xì)胞后期的復(fù)制過(guò)程。ELISA和流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明,HP-API可以通過(guò)與HIV包膜糖蛋白或病毒作用靶細(xì)胞上的CD4分子結(jié)合,干擾包膜糖蛋白與CD4分子的結(jié)合,從而抑制病毒與靶細(xì)胞膜的融合,阻止HIV病毒的進(jìn)入。理想的殺微生物劑必須具備高效,人體安全無(wú)毒的特點(diǎn)。為此,我們?cè)u(píng)估了HP-API對(duì)病毒作用靶細(xì)胞和對(duì)正常人陰道的細(xì)胞毒性,包括了MT-2, U87-CD4-CXCR4細(xì)胞和U87-CD4-CCR5細(xì)胞。我們發(fā)現(xiàn)HP-API對(duì)各靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用均較低。進(jìn)一步分析其機(jī)制,我們發(fā)現(xiàn)HP-API能顯著抑制SEVI增強(qiáng)病毒感染作用,而本身的抗病毒活性基本保持不變,而陰性對(duì)照抗體API無(wú)任何抗病毒活性(IC5075μg/ml)。SEVI沉淀部分的增強(qiáng)病毒感染活性較強(qiáng),與SEVI的混合物較為相似,HP-API能顯著抑制SEVI淀粉樣纖維增強(qiáng)HIV-1感染的能力。但SEVI的上清部分增強(qiáng)病毒感染的活性較弱,基本與PBS相似,HP-API或API與PAP248-286多肽能特異性結(jié)合,肝素并不能拮抗HP-API或API與PAP248-286結(jié)合,說(shuō)明HP-API及API與PAP248-286的結(jié)合的確是抗原抗體之間的特異性結(jié)合。采用剛果紅溶液及硫磺素T,透射電子顯微鏡,圓二色譜法等方法,我們發(fā)現(xiàn)HP-API或API能濃度依賴性地抑制PAP248-286多肽形成淀粉樣纖維,我們進(jìn)一步采用硫磺素T(ThT)法檢測(cè)HP-API及API對(duì)已經(jīng)形成的成熟的SEVI淀粉樣纖維的分解作用發(fā)現(xiàn),HP-API及API均不能降解已經(jīng)形成的SEVI淀粉樣纖維,說(shuō)明兩者均在淀粉樣纖維聚集過(guò)程中起抑制作用,而對(duì)淀粉樣纖維無(wú)分解作用,我們采用熒光共聚焦顯微鏡,病毒pull-down方法檢測(cè)SEVI或精液促進(jìn)HIV-1病毒顆粒聚集,發(fā)現(xiàn)這種聚集能被HP-API抑制。結(jié)論3-羥基-鄰苯二甲酸酐修飾抗SEVI抗體(HP-API)是阻止病毒進(jìn)入和與SEVI淀粉樣原纖維結(jié)合的廣譜HIV進(jìn)入／融合抑制劑。HP-API可以對(duì)抗艾滋病病毒SEVI淀粉樣原纖維增強(qiáng)效果,同時(shí)抑制病毒感染,因此其具有較大的潛能被發(fā)展成預(yù)防HIV性傳播的候選殺微生物劑。1. HP-API具有容易制備、低細(xì)胞毒性和生產(chǎn)成本低的特點(diǎn),有廣譜的抗病毒活性,可以抗各種HIV-1實(shí)驗(yàn)室病毒株及臨床分離株的感染,甚至還可以抑制幾種臨床常用的抗病毒藥物的耐藥株的感染；2.研究HP-API的作用機(jī)制發(fā)現(xiàn),HP-API是通過(guò)與HIV病毒包膜糖蛋白或病毒作用靶細(xì)胞的CD4分子結(jié)合,干擾病毒包膜糖蛋白與CD4分子的結(jié)合,從而抑制病毒與靶細(xì)胞膜的融合,阻止HIV病毒的進(jìn)入。HP-API結(jié)合PAP248-286或SEVI能力很強(qiáng),該特異性結(jié)合不受高負(fù)電荷的肝素影響,HP-API在體外抑制PAP248-286形成SEVI淀粉樣纖維,進(jìn)而阻斷SEVI淀粉樣纖維的增強(qiáng)HIV感染作用,對(duì)已形成的SEVI淀粉樣纖維,沒(méi)有分解淀粉樣纖維的作用。通過(guò)有效的阻斷SEVI與HIV-1顆粒結(jié)合,HP-API可以抑制SEVI-介導(dǎo)HIV-1感染增強(qiáng)。
【關(guān)鍵詞】：前列腺酸性磷酸酶 精液源性病毒感染增強(qiáng)因子 gp120衍生多肽 淀粉樣纖維 HIV進(jìn)入抑制劑 雙功能殺微生物劑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R96;R943
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-21
• 第一部分 衍生于HIV-1 gp120的多肽促進(jìn)SEVI淀粉樣纖維形成的作用及機(jī)制研究21-71
• 前言21-26
• 第1章 來(lái)源于HIV-1 gp120的淀粉樣多肽EP2促進(jìn)精液源性淀粉樣纖維形成26-44
• 1 材料26-27
• 2 實(shí)驗(yàn)方法27-31
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-44
• 第2章 HIV-1 gp120多肽裂解片段INMWQG增強(qiáng)HIV-1感染及促進(jìn)精液源性淀粉樣纖維形成44-71
• 1 材料44-46
• 2 實(shí)驗(yàn)方法46-51
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果51-66
• 討論66-71
• 第二部分 酸酐修飾的兔抗SEVI多克隆抗體IgG(HP-API)作為雙功能殺微生物劑研究71-127
• 前言71-77
• 第1章 3-羥基-鄰苯二甲酸酐修飾抗SEVI抗體作為雙功能殺微生物劑的抗病毒活性77-102
• 1 材料77-79
• 2 實(shí)驗(yàn)方法79-90
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果90-102
• 第2章 3-羥基-鄰苯二甲酸酐修飾抗SEVI抗體抗HIV作用機(jī)制研究102-127
• 1 材料102-103
• 2 實(shí)驗(yàn)方法103-108
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果108-123
• 討論123-127
• 全文結(jié)論127-129
• 參考文獻(xiàn)129-139
• 附錄縮寫詞中英文對(duì)照表139-141
• 成果141-143
• 致謝143-146
• 論文統(tǒng)計(jì)學(xué)合格證明146

，

本文編號(hào)：601610