發(fā)布時間：2017-07-30 04:20

  本文關(guān)鍵詞：人參皂苷Rgl拮抗致衰劑致骨髓基質(zhì)細(xì)胞衰者作用及機理研究

  更多相關(guān)文章： 人參皂苷Rg1 骨髓基質(zhì)細(xì)胞 骨髓單個核細(xì)胞 D-半乳糖 衰老 拮抗衰老 機理

【摘要】：背景：衰老生物學(xué)與延緩衰老是社會科學(xué)和自然科學(xué)共同關(guān)注的重大研究課題。2014年國家統(tǒng)計局公布數(shù)據(jù)顯示,中國總?cè)丝跒?3.6億人,其中年齡超過60歲者達2.02億,占14.9%,到2020年,中國將進入超級老齡化國家。面臨世界和我國人口老化進程加快和人們壽命普遍提高的趨勢,確保老年人享有健康和高質(zhì)量生活已成為社會科學(xué)和生命科學(xué)共同關(guān)注重大問題。因此加快推動衰老生物學(xué)與延緩衰老的研究有重要科學(xué)意義及社會價值。最新研究表明,機體干細(xì)胞衰老是生物個體衰老最直接和根本原因。因此,尋找調(diào)控與延緩干細(xì)胞衰老途徑,闡述其現(xiàn)代生物學(xué)機理對延緩人體衰老和防治老年性疾病具有重要意義。我們前期工作證明,造血系統(tǒng)功能衰退與造血干細(xì)胞(HSCs)衰老密切相關(guān),采用中醫(yī)學(xué)“補氣生血”途徑可以延緩HSCs衰老�，F(xiàn)代血液學(xué)理論認(rèn)為,血細(xì)胞發(fā)生是指HSCs在造血誘導(dǎo)微環(huán)境(HIM)的精密調(diào)控下生成與釋放血細(xì)胞的動態(tài)平衡過程。HIM是HSCs賴以生長發(fā)育微環(huán)境,HIM的核心成分是骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs),它包括巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和血竇內(nèi)皮細(xì)胞等,它們不僅為造血細(xì)胞生長發(fā)育提供支架,而且能分泌多種造血生長因子調(diào)控造血細(xì)胞增殖與分化�？梢�,BMSCs的生物學(xué)特點直接反映造血微環(huán)境功能狀態(tài)。HSCs衰老與HIM功能狀態(tài)密切相關(guān),闡述HSCs衰老機制和尋找延緩HSCs途徑必然離不開對BMSCs功能的研究。人參是中醫(yī)臨床“補氣”要藥,人參皂苷是其主要的藥物成分。課題組前期研究表明,人參皂苷Rg1是人參重要的抗衰老成分,它能拮抗致衰劑對HSC的致衰作用,能使細(xì)胞體外生存壽命延長,給衰老大鼠注射人參皂苷Rgl可阻止致衰劑對骨髓造血細(xì)胞損傷。人參皂苷Rg1能否通過調(diào)控骨髓造血微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞的功能,進而延緩HSCs衰老還尚未見相關(guān)報道。目的本研究通過建立D-半乳糖致大鼠衰老模型和BMSCs體外衰老模型,探討人參皂苷Rg1拮抗致衰劑對BMSCs體內(nèi)外衰老作用及其生物學(xué)機理,旨在闡釋人參抗衰老成分調(diào)控BMSCs功能與延緩造血細(xì)胞衰老的機理,為尋找延緩造血微環(huán)境衰老新途徑提供理論與實驗室依據(jù)。方法1.全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離純化BMSCs,觀察細(xì)胞形態(tài),臺盼藍染色檢測細(xì)胞活性；密度梯度離心法分離骨髓BMNCs,貼壁培養(yǎng)4h后,收集上層懸浮BMNCs。2.通過衰老相關(guān)p-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色,CCK8比色法、細(xì)胞周期及凋亡率檢測、電鏡觀察亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的方法觀察D-gal對BMSCs衰老生物學(xué)指標(biāo)的影響,以建立D-gal體外誘導(dǎo)BMSCs衰老模型。3.將懸浮BMNCs與衰老BMSCs共培養(yǎng),應(yīng)用SA-β-Gal染色,CCK8比色法、細(xì)胞周期及凋亡率檢測,CFU-Mix混合集落形成能力檢測的方法觀察衰老BMSCs對BMNCs衰老生物學(xué)指標(biāo)及造血功能的影響,4.Rg1與D-gal共培養(yǎng)BMSCs,應(yīng)用SA-β-Gal染色,透射電鏡觀察亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),CCK8比色法、細(xì)胞周期及凋亡率檢測,酶學(xué)免疫法培養(yǎng)上清中IL-2、IL-6、TNF-α、GM-CSF、SCF、IL-1β分泌水平,DCFH-DA熒光法檢測胞內(nèi)ROS水平,激光共聚焦觀察胞內(nèi)ROS熒光強度,WST-8法檢測胞內(nèi)SOD活力,TBA法檢測胞內(nèi)MDA含量,Western blot檢測P53、P21、P16、CDK、CDK4、cyclinD、cyclinE的方法,從BMSCs衰老生物學(xué)特點、氧化與抗氧化指標(biāo)、細(xì)胞因子表達水平、衰老相關(guān)蛋白表達的角度觀察Rgl拮抗BMSCs衰老機理。5.Rg1與D-gal作用BMSCs后與BMNCs共培養(yǎng),應(yīng)用SA-β-Gal染色,CFU-Mix混合集落形成能力,CCK8比色法、細(xì)胞周期及凋亡率檢測,DCFH-DA熒光法檢測胞內(nèi)ROS水平,激光共聚焦觀察胞內(nèi)ROS熒光強度,WST-8法檢測胞內(nèi)SOD活力,TBA法檢測MDA含量,從BMNCs衰老生物學(xué)特點、氧化與抗氧化指標(biāo)、細(xì)胞因子分泌水平的改變?nèi)矫嬗^察Rgl拮抗BMSCs后對BMNCs衰老抑制作用及其促進BMNCs增殖分化及造血功能恢復(fù)的機理。6.大鼠皮下注射D-gal建立衰老大鼠衰老體內(nèi)模型,分離純化BMSCs及BMNCs后,應(yīng)用SA-β-Gal染色、CCK8比色法、細(xì)胞周期及凋亡率檢測的方法觀察衰老大鼠體內(nèi)BMSCs衰老生物學(xué)指標(biāo)。7.應(yīng)用SA-β-Gal染色、CFU-Mix混合集落檢測、細(xì)胞周期檢測的方法觀察衰老大鼠體內(nèi)BMNCs衰老生物學(xué)指標(biāo)。8.人參皂苷Rgl注射衰老大鼠,分離純化BMSCs及BMNCs后,應(yīng)用SA-Gal染色、CCK8比色法、細(xì)胞周期及凋亡率檢測、DCFH-DA熒光法檢測胞內(nèi)ROS含量,酶免疫法檢測培養(yǎng)上清液中水平氧化損傷指標(biāo)MDA、SOD、GSH-Px及細(xì)胞因子IL-2、IL-6、TNF-α、SCF、 Western blot檢測胞內(nèi)P53、P21、P16、CDK2及cyclinD表達水平的方法從衰老生物學(xué)指標(biāo)、慢性炎癥、氧化損傷及衰老蛋白表達的方面觀察ggl拮抗衰老大鼠體內(nèi)BMSCs衰老的機理。9.應(yīng)用SA-Gal染色、CFU-Mix混合集落檢測、細(xì)胞周期檢測、DCFH-DA熒光法檢測胞內(nèi)ROS水平、WST-8檢測胞內(nèi)SOD活力、Western blot檢測胞內(nèi)P53、P16表達水平的方法,并結(jié)合之前的實驗結(jié)果,從衰老生物學(xué)指標(biāo)、慢性炎癥、氧化損傷及衰老蛋白表達的角方面觀察Rg1處理衰老大鼠后,體內(nèi)BMNCs衰老延緩及其造血功能恢復(fù)的可能機理及其與BMSCs的關(guān)系。結(jié)果1.全骨髓貼壁培養(yǎng)純化后的BMSCs,臺盼藍染色活細(xì)胞率為：(96±0.68)%,表明貼壁培養(yǎng)純化后的BMSCs具有良好的生物學(xué)特點。2.D-gal作為致衰劑在體外能誘導(dǎo)BMSCs呈現(xiàn)典型的衰老生物學(xué)表現(xiàn)：SA-β-Gal染色陽性細(xì)胞率升高,透射電鏡觀察亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)表現(xiàn)典型衰老形態(tài)學(xué)特點：細(xì)胞質(zhì)深染、線粒體空泡變性、細(xì)胞膜形態(tài)改變,CCK8檢測細(xì)胞增殖能力減弱,細(xì)胞周期G1期增加、s期減少,細(xì)胞凋亡率增加,胞內(nèi)SOD活力降低、ROS及MDA水平增加,激光共聚焦觀察胞內(nèi)ROS熒光強度明顯增強,細(xì)胞上清液中IL-2、TNF-α升高,IL-6、SCF、GM-CSF、IL-1β降低,胞內(nèi)P53、P21、P16表達水平升高,CDK2、CDK4及cyclinD表達減少,而cyclinE表達水平無明顯改變。3.衰老BMSCs與BMNCs體外共培養(yǎng),BMNCs呈現(xiàn)衰老的生物學(xué)表現(xiàn)：SA-β-Gal染色陽性細(xì)胞率升高,CFU-Mix形成能力減弱,CCK8檢測細(xì)胞增殖能力減弱,細(xì)胞周期G1期增加、S期減少,細(xì)胞凋亡率增加,胞內(nèi)SOD活力降低、ROS及MDA水平增加,激光共聚焦觀察胞內(nèi)ROS熒光強度明顯增強。4.Rg1體外作用衰老BMSCs可降低其SA-β-Gal染色陽性細(xì)胞率,增加CCK8細(xì)胞增殖能力,降低透射電鏡觀察到細(xì)胞衰老形態(tài)學(xué)改變減輕,提升S期細(xì)胞率,降低G1期細(xì)胞,降低細(xì)胞凋亡率,提升胞內(nèi)SOD活力、降低ROS及MDA水平,激光共聚焦觀察胞內(nèi)ROS熒光強度明顯減弱,細(xì)胞上清液中IL-2、TNF-α減少,IL-6、SCF、GM-CSF、 IL-1β水平升高,胞內(nèi)P53、P21、P16表達水平降低,CDK2、CDK4表達上升,cyclinD及cyclinE表達水平無明顯改變。5.Rg1體外作用衰老BMSCs與BMNCs共培養(yǎng)后,與衰老組BMNCs比較,SA-β-Gal染色陽性細(xì)胞率降低,CFU-Mix形成能力增強,CCK8檢測細(xì)胞增殖能力增強,細(xì)胞周期G1期減少、S期增加,細(xì)胞凋亡率減少,胞內(nèi)SOD活力提升、ROS水平降低而MDA水平無明顯改變,激光共聚焦觀察胞內(nèi)ROS熒光強度明顯減弱。6.衰老大鼠BMSCs的SA-β-Gal染色陽性細(xì)胞率明顯增加、CCK8細(xì)胞增殖能力減弱、細(xì)胞周期S期細(xì)胞比例減少、G1期比例增加,凋亡率明顯增加,胞內(nèi)MDA水平升高GSH-Px水平降低、IL-2、TNF-α分泌水平減少、IL-6、SCF分泌水平增加,Western blot檢測胞內(nèi)P53、P21、P16增加,CDK2表達減少,而cyclinD水平無明顯改變。7.衰老大鼠BMNCs的SA-β-Gal染色陽性細(xì)胞率明顯增加、CFU-Mix混合集落形成能力減弱、細(xì)胞周期S期細(xì)胞比例減少,G1期細(xì)胞比例增加,ROS水平增加、SOD活力降低、Western blot檢測胞內(nèi)P53、P16表達水平增加。8.Rgl作用衰老大鼠后,體內(nèi)BMSCs的SA-β-Gal染色陽性細(xì)胞率明顯減少、CCK8細(xì)胞增殖能力增加、細(xì)胞周期S期細(xì)胞比例增加、G1期比例降低,凋亡率明顯減少,ROS、MDA水平減少,SOD活力增加但GSH-Px水平無明顯改變、IL-2、TNF-α分泌水平增加、IL-6、 SCF水平減少,Western blot檢測胞內(nèi)P53、P21、P16表達減少,CDK2與cyclinD水平無明顯改變。9.Rg1作用衰老大鼠后,體內(nèi)BMNCs的SA-β-Gal染色陽性細(xì)胞率明顯減少、CFU-Mix混合集落形成能力增強、細(xì)胞周期S期細(xì)胞比例增加,G1期細(xì)胞比例減少,ROS水平減少、SOD活力增加、Western blot檢測胞內(nèi)P53、P16表達明顯減少。結(jié)論1.D-gal可以復(fù)制BMSCs衰老的體內(nèi)外模型。2.衰老的BMSCs可誘導(dǎo)BMNCs衰老。3.人參皂苷Rg1在體內(nèi)外均可拮抗D-gal對BMSCs的致衰作用,并通過以上途徑恢復(fù)BMNCs的造血能力。。4.人參皂苷Rg1拮抗D-gal對BMSC的致衰作用可能與抑制氧化應(yīng)激損傷、抑制炎性反應(yīng)、下調(diào)衰老相關(guān)蛋白有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：人參皂苷Rg1 骨髓基質(zhì)細(xì)胞 骨髓單個核細(xì)胞 D-半乳糖 衰老 拮抗衰老 機理
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R285.5
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-7
• 中文摘要7-14
• 英文摘要14-24
• 第一部分：D-半乳糖體外誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞衰老作用及機理研究24-45
• 前言24
• 1 材料與方法24-29
• 2 結(jié)果29-33
• 3 討論33-35
• 4 結(jié)論35-36
• 5 參考文獻36-38
• 附圖38-45
• 第二部分：人參皂苷Rg1體外調(diào)控骨髓基質(zhì)細(xì)胞衰老及機理研究45-65
• 前言45
• 1 材料與方法45-47
• 2 結(jié)果47-52
• 3 討論52-54
• 4 結(jié)論54-55
• 5 參考文獻55-58
• 附圖58-65
• 第三部分：衰老大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)及其與造血功能關(guān)系研究65-79
• 前言65
• 1 材料與方法65-66
• 2 結(jié)果66-70
• 3 討論70-71
• 4 結(jié)論71
• 5 參考文獻71-74
• 附圖74-79
• 第四部分：人參皂苷Rg1對衰老大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞與造血功能的影響79-94
• 前言79
• 1 材料與方法79-80
• 2 結(jié)果80-84
• 3 討論84-86
• 4 結(jié)論86
• 5 參考文獻86-89
• 附圖89-94
• 全文總結(jié)94-95
• 文獻綜述：造血微環(huán)境衰老的分子機制研究95-101
• 參考文獻98-101
• 致謝101-102
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文102

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本文編號：592503