發(fā)布時間：2017-07-30 09:20

  本文關(guān)鍵詞：菌毛及納米材料對地桿菌胞外電子傳遞影響的研究

  更多相關(guān)文章： 菌毛 胞外電子傳遞 硫還原地桿菌 微生物燃料電池 陽極修飾 納米材料

【摘要】：產(chǎn)電菌(Electricigens)通過分解代謝有機(jī)物釋放電子,電子通過結(jié)合于細(xì)胞內(nèi)膜上的電子傳遞鏈傳遞并提供微生物代謝活動所需的能量,而電子最后通過一種被稱作“胞外電子傳遞”(EET)的方式傳遞給環(huán)境中的電子受體。EET在環(huán)境的生物地理化學(xué)循環(huán)、生物電化學(xué)系統(tǒng)和生物修復(fù)等領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用并正成為學(xué)術(shù)界研究的熱點(diǎn)。硫還原地桿菌(Geobacter sulfurreducens)是被人們廣泛研究的一種土壤中廣泛存在在嚴(yán)格厭氧細(xì)菌,其通過EET代謝環(huán)境中的電子受體并影響著土壤地質(zhì)的組成與土壤的生物修復(fù)、構(gòu)成了微生物燃料電池生物陽極優(yōu)勢菌種。G. sulfurreducens (Gs)代謝胞外電子受體需要多種物質(zhì)的協(xié)作,比如細(xì)胞色素C、菌毛(Gs-pili)、土壤中的礦物等。本論文將分別從菌毛和納米材料兩個方面研究它們對EET的影響。Gs-pili是Gs完成胞外電子傳遞所必須的,然而對于其在EET過程中發(fā)揮的具體功能學(xué)術(shù)界還沒有一個統(tǒng)一的結(jié)論,甚至于編碼Gs-pili蛋白單體(Gs-PilA)的基因(Gs-pila)尚無明確的定義。本研究首先定位了Gs-pila并分析其開放閱讀框結(jié)構(gòu)。然后構(gòu)建了Gs異源菌毛蛋白表達(dá)系統(tǒng),并通過表達(dá)不同組成與結(jié)構(gòu)的菌毛來研究菌毛對Gs胞外電子傳遞的影響。產(chǎn)電菌可以穩(wěn)定地利用陽極作為電子受體并實(shí)現(xiàn)電能的輸出,而陽極修飾可以顯著地提高產(chǎn)電菌代謝陽極的能力。本論文選取石墨烯及其復(fù)合物來修飾陽極從而研究納米材料對Gs陽極胞外電子傳遞的促進(jìn)作用。具體工作內(nèi)容如下：(1)使用組氨酸標(biāo)簽標(biāo)記預(yù)測的Gs-pila,通過電鏡免疫膠體金染色法證明組氨酸標(biāo)簽標(biāo)記的蛋白參與了Gs-pili的組成從而定位了Gs-PilA編碼基因。Gs-pila具有兩個潛在的翻譯起始密碼子(ATG和TTG),可能形成兩種Gs-PilA前體蛋白單體。通過分析僅表達(dá)單種Gs-PilA前體蛋白的突變株的Gs-pila的轉(zhuǎn)錄及相應(yīng)表型,證明Gs-pila僅具有唯一的翻譯起始密碼子(ATG)。(2)構(gòu)建可以表達(dá)Pseudomonas aeruginosa PAO1菌毛蛋白(PA-PilA)的Gs突變株(Gs-PA),證明了異源四型菌毛蛋白可以在Gs中表達(dá)并正確的組裝同時發(fā)現(xiàn)Gs-PA胞外細(xì)胞色素C的分布沒有改變。通過表征Gs-PA胞外電子受體代謝,研究P.aeruginosa PAO1菌毛(PA-Pili)對Gs胞外電子傳遞的影響。(3)改變Gs-PilA中芳香族氨基酸的數(shù)目或者標(biāo)記細(xì)胞色素PpcA于Gs-PilA上,研究不同組成的Gs-PilA對Gs胞外電子傳遞的影響。同時,構(gòu)建可以表達(dá)Geobacter metallireducen、 Geobacter uraniireducens、 Pelobacter carbinolicus四型菌毛蛋白及截短的G. uraniireducens和P.carbinolicus四型菌毛蛋白的Gs突變株以研究不同結(jié)構(gòu)的菌毛對Gs胞外電子傳遞的影響。(4)Gs細(xì)胞色素C—OmcZ突變株(Gs-△OmcZ)不能穩(wěn)定地代謝陽極。本研究使用石墨烯/血紅素納米復(fù)合物來仿生模擬天然的細(xì)胞色素C,證明通過其陽極修飾可以恢復(fù)Gs-△OmcZ穩(wěn)定陽極胞外電子傳遞的能力。同時證明其可以作為一般的陽極修飾方式用于微生物燃料電池陽極性能的提高。
【關(guān)鍵詞】：菌毛 胞外電子傳遞 硫還原地桿菌 微生物燃料電池 陽極修飾 納米材料
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R318.08
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 緒論12-46
• 1.1 地桿菌12-13
• 1.2 四型菌毛：結(jié)構(gòu)與功能13-19
• 1.3 胞外電子傳遞19-24
• 1.3.1 胞外氧化鐵代謝20-21
• 1.3.2 陽極代謝21-23
• 1.3.3 種間直接電子傳遞23-24
• 1.4 菌毛介導(dǎo)的胞外電子傳遞模型24-28
• 1.4.1 類金屬導(dǎo)電模型25
• 1.4.2 電子躍遷模型25-27
• 1.4.3 Stepping stone模型27-28
• 1.5 導(dǎo)電菌毛模型28-32
• 1.5.1 菌毛單體模型28-29
• 1.5.2 菌毛模型29-32
• 1.6 納米材料與胞外電子傳遞32-34
• 1.6.1 天然納米粒子促進(jìn)胞外電子傳遞32-33
• 1.6.2 納米材料促進(jìn)產(chǎn)電菌陽極代謝33-34
• 1.7 本論文主要研究工作34-36
• 參考文獻(xiàn)36-46
• 第二章 菌毛蛋白基因定位與翻譯起始密碼子識別46-72
• 2.1 引言46-48
• 2.2 材料與方法48-59
• 2.2.1 試劑與儀器48-49
• 2.2.2 菌株與質(zhì)粒49-50
• 2.2.3 基因操作與質(zhì)粒構(gòu)建50-53
• 2.2.4 構(gòu)建轉(zhuǎn)基因硫還原地桿菌53-55
• 2.2.5 培養(yǎng)基配置與細(xì)菌培養(yǎng)55-57
• 2.2.6 蛋白變性凝膠電泳和蛋白免疫印跡57-58
• 2.2.7 蛋白膠染色58
• 2.2.8 免疫金標(biāo)記與透射電鏡觀察58
• 2.2.9 Ferrozine分析58-59
• 2.2.10 熒光實(shí)時定量PCR59
• 2.3 結(jié)果與討論59-67
• 2.3.1 組氨酸標(biāo)簽標(biāo)記菌毛蛋白基因60-63
• 2.3.1.1 基因組原位標(biāo)記60-61
• 2.3.1.2 基因組非原位標(biāo)記61-62
• 2.3.1.3 胞外氧化鐵代謝62-63
• 2.3.2 菌毛蛋白翻譯起始密碼子分析63-67
• 2.3.2.1 地桿菌四型菌毛蛋白基因比對63-64
• 2.3.2.2 菌株pilA4和pilA5低水平轉(zhuǎn)錄GSU149664-65
• 2.3.2.3 菌株pilA4低水平表達(dá)菌毛蛋白65-67
• 2.4 本章小結(jié)67-69
• 參考文獻(xiàn)69-72
• 第三章 構(gòu)建表達(dá)綠膿桿菌菌毛蛋白硫還原地桿菌及對胞外電子傳遞的影響72-96
• 3.1 引言72-74
• 3.2 材料與方法74-85
• 3.2.1 試劑與儀器74
• 3.2.2 菌株與質(zhì)粒74-76
• 3.2.3 基因操作與質(zhì)粒構(gòu)建76-78
• 3.2.4 構(gòu)建轉(zhuǎn)基因硫還原地桿菌78-79
• 3.2.5 培養(yǎng)基配置與細(xì)菌培養(yǎng)79-81
• 3.2.6 細(xì)菌陽極產(chǎn)電能力測試81
• 3.2.7 蛋白變性凝膠電泳和免疫印跡分析81-82
• 3.2.8 蛋白膠染色和血紅素染色82-83
• 3.2.9 膠體金免疫分析與透射電鏡觀察83
• 3.2.10 細(xì)菌粘附性測試83
• 3.2.11 陽極生物膜激光共聚焦顯微觀察83-84
• 3.2.12 熒光實(shí)時定量PCR84
• 3.2.13 菌毛導(dǎo)電性測試84-85
• 3.2.14 Ferrozine分析85
• 3.3 結(jié)果與討論85-91
• 3.3.1 Pa-PilA在DL1中表達(dá)與組裝85-88
• 3.3.2 菌株P(guān)A表面細(xì)胞色素C組成與分布88-89
• 3.3.3 OmcS與PA-pili結(jié)合89
• 3.3.4 菌株P(guān)A胞外電子傳遞89-91
• 3.4 總結(jié)與展望91-93
• 參考文獻(xiàn)93-96
• 第四章 菌毛組成與結(jié)構(gòu)對硫還原地桿菌胞外電子傳遞的影響96-126
• 4.1 引言96-97
• 4.2 材料與方法97-112
• 4.2.1 試劑與儀器98
• 4.2.2 菌株與質(zhì)粒98-104
• 4.2.3 基因操作與質(zhì)粒構(gòu)建104-109
• 4.2.4 轉(zhuǎn)基因硫還原地桿菌構(gòu)建與篩選109
• 4.2.5 培養(yǎng)基配置與細(xì)菌培養(yǎng)109
• 4.2.6 陽極代謝能力測試109-110
• 4.2.7 蛋白變性凝膠電泳和免疫印跡分析110
• 4.2.8 透射電鏡觀察110
• 4.2.9 Ferrozine分析110-111
• 4.2.10 熒光實(shí)時定量PCR111-112
• 4.3 結(jié)果與討論112-122
• 4.3.1 菌毛蛋白芳香族氨基酸與胞外電子傳遞112-115
• 4.3.1.1 構(gòu)建Gs-PilA芳香族氨基酸突變株112-113
• 4.3.1.2 菌毛蛋白芳香族氨基酸突變株胞外氧化鐵還原113-115
• 4.3.2 增加菌毛細(xì)胞色素C含量對胞外電子傳遞的影響115-117
• 4.3.2.1 構(gòu)建菌毛蛋白PgcA標(biāo)記菌株115-116
• 4.3.2.2 菌株KN-PpcA氧化鐵還原116-117
• 4.3.3 菌毛蛋白結(jié)構(gòu)對胞外電子傳遞的影響117-122
• 4.3.3.1 不同結(jié)構(gòu)菌毛蛋白的選擇117-118
• 4.3.3.2 菌毛蛋白結(jié)構(gòu)對菌株DL1胞外電子傳遞的影響118-120
• 4.3.3.3 菌毛蛋白結(jié)構(gòu)對菌株KN400胞外電子傳遞的影響120-122
• 4.4 本章小結(jié)122-123
• 參考文獻(xiàn)123-126
• 第五章 石墨烯/血紅素納米復(fù)合物促進(jìn)細(xì)菌陽極胞外電子傳遞126-140
• 5.1 引言126-127
• 5.2 材料與方法127-130
• 5.2.1 試劑與儀器127-128
• 5.2.2 試劑與儀器128
• 5.2.3 電極修飾128
• 5.2.4 試劑與儀器128-129
• 5.2.5 半電池構(gòu)建與陽極產(chǎn)電測試129
• 5.2.6 陽極電化學(xué)表征129-130
• 5.2.7 紫外吸收光譜和拉曼光譜130
• 5.3 結(jié)果和討論130-135
• 5.3.1 石墨烯/血紅素復(fù)合材料表征130-131
• 5.3.2 石墨烯/血紅素復(fù)合物修飾陽極產(chǎn)電能力測試131-132
• 5.3.3 石墨烯/血紅素復(fù)合物修飾陽極電化學(xué)表征132-134
• 5.3.4 石墨烯/血紅素復(fù)合物修飾陽極促進(jìn)Gs-ΔOmcZ代謝陽極134-135
• 5.4 本章小結(jié)135-137
• 參考文獻(xiàn)137-140
• 第六章 總結(jié)與展望140-142
• 附錄1142-143
• 附錄2143-144
• 附錄3144-145
• 發(fā)表論文145-146
• 致謝146-147

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本文編號：593517