發(fā)布時(shí)間：2017-07-28 15:12

  本文關(guān)鍵詞：Let-7f和MMPI對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 膠質(zhì)瘤 Let-7f MMPI 侵襲 增殖

【摘要】：腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一。膠質(zhì)瘤患者的生存期比較短,大約為14個(gè)月。盡管近年來,膠質(zhì)瘤手術(shù)技術(shù)、化療、放療等治療手段,取得了很大進(jìn)步,然而,膠質(zhì)瘤確診患者中,只有大約5%的患者生存期超過5年。膠質(zhì)瘤的惡性行為主要是由于其快速的生長、血管形成、全腦廣泛的浸潤侵襲及多種化療藥物的耐藥等。如何能有效的抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長和侵襲的能力,并且延長患者的生存時(shí)間和改善患者的生存狀態(tài)是當(dāng)今神經(jīng)科學(xué)亟待解決的問題。然而,理解引起膠質(zhì)瘤惡性行為的生物學(xué)作用和分子機(jī)制是目前首要解決的問題。MicroRNA通過抑制轉(zhuǎn)錄或降解靶點(diǎn)mRNA來抑制蛋白的轉(zhuǎn)錄。大量的報(bào)道顯示,在腫瘤細(xì)胞中,microRNA起到致癌基因或抑癌基因作用。MicroRNA在腫瘤細(xì)胞的分化、生長和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中扮演重要角色。相比較在正常腦組織中,在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中有大量的microRNAS異常表達(dá),并參與到膠質(zhì)瘤細(xì)胞的起源和發(fā)展。Let-7f是Let-7家族成員,位于9q22.3。Let-7f在不同的腫瘤中表達(dá)是不同的,在許多腫瘤中表達(dá)下調(diào),包括卵巢癌、肉瘤、胃癌等。然而,Let-7f在乳腺癌和肝癌中的表達(dá)是上調(diào)的。Let-7f主要的生物學(xué)功能是參與到腫瘤細(xì)胞的起源和進(jìn)展。目前,有報(bào)道顯示Let-7f在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。然而,Let-7f對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)作用及機(jī)制并不十分清楚�；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)過程中發(fā)揮重要的作用,因此,MMPs被認(rèn)為是膠質(zhì)瘤治療的重要靶點(diǎn)之一。然而,不幸的是,基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(MMPI)對(duì)膠質(zhì)瘤患者治療的結(jié)果并不令人滿意,沒有取得顯著的治療效果。因此,研究MMPI失敗的原因是必要的。腫瘤細(xì)胞具有可塑性,在不同的環(huán)境中能夠采取間充質(zhì)樣或阿米巴樣這兩種不同方式來運(yùn)動(dòng)。一些腫瘤細(xì)胞采取間充質(zhì)-阿米巴運(yùn)動(dòng)模式的轉(zhuǎn)換(MAT)來補(bǔ)償MMPI對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲的抑制作用,并且MAT是MMPI治療腫瘤失敗的重要原因和機(jī)制。然而,在膠質(zhì)瘤在膠質(zhì)瘤治療中,很少報(bào)告MMPI是否能夠引起膠質(zhì)瘤(間充質(zhì)-阿米巴轉(zhuǎn)換)(MAT)。更重要的是本研究發(fā)現(xiàn)RhoA/ROCK信號(hào)在MAT過程中起關(guān)鍵作用,聯(lián)合應(yīng)用MMPI和RhoA/ROCK通路抑制劑,能夠有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。本課題分兩部分：分別研究了Let-7f和MMPI對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響,并探討其機(jī)制,以期為膠質(zhì)瘤的靶向治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)。第一部分：Let-7f對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及機(jī)制研究1.膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系Let-7f的表達(dá)下調(diào)首先,我們分別檢測(cè)了膠質(zhì)瘤組織樣本、正常腦組織和膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中Let-7f的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,Let-7f在膠質(zhì)瘤組織樣本中比正常腦組織中表達(dá)下調(diào),其表達(dá)情況與膠質(zhì)瘤級(jí)別的增高呈負(fù)相關(guān)。同樣,Let-7f在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系T98G、U87和A172比在正常星型細(xì)胞系表達(dá)下調(diào)。另外,我們統(tǒng)計(jì)分析了在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中Let-7f表達(dá)與患者生存期的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者的低生存期伴隨著Let-7f的低表達(dá)。這些結(jié)果暗示了Let-7f在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中可能發(fā)揮抑癌基因的作用。2.在體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞中過表達(dá)Let-7f抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力U87和A172細(xì)胞轉(zhuǎn)染后,采用CCK-8法檢測(cè),分別在24、48、72和96小時(shí),檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果顯示：膠質(zhì)瘤細(xì)胞Let-7f過表達(dá)組比未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組細(xì)胞的增殖能力下降；Edu檢測(cè)實(shí)驗(yàn)也表明了過表達(dá)Let-7f顯著的抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力。另外,克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示：Let-7f過表達(dá)組的克隆數(shù)目比未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組明顯減少,這說明過表達(dá)Let-7f能夠長時(shí)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長能力。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了在體外過表達(dá)Let-7f能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長能力。3.在體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞中過表達(dá)Let-7f抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲Transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Let-7f對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響,結(jié)果顯示：膠質(zhì)瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,Let-7f過表達(dá)組細(xì)胞的侵襲和遷移能力比空白組和陰性對(duì)照組明顯降低。MMP2和MMP9蛋白水平降低。這些結(jié)果表明了,在體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞中過表達(dá)Let-7f抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的能力。4.Periostin是Let-7f的直接靶點(diǎn)我們查閱Microrna、Targetscan和miRBase等數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)periostin與Let-7f在3'UTR區(qū)具有潛在的結(jié)合位點(diǎn)。熒光素酶報(bào)告基因法和western blot檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了periostin為Let-7f直接靶點(diǎn)基因。5.Periostin涉及到Let-7f對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的調(diào)節(jié)。我們選用干擾RNA方法敲除periostin,進(jìn)一步檢測(cè)periostin敲除后,對(duì)細(xì)胞行為的影響,發(fā)現(xiàn)periostin敲除后,細(xì)胞侵襲、遷移和增殖能力下降。膠質(zhì)瘤細(xì)胞過表達(dá)periostin能夠部分逆轉(zhuǎn)Let-7f對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用。6.在體內(nèi),Let-7f抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性表現(xiàn)在膠質(zhì)瘤皮下異位模型中瘤內(nèi)注射Let-7f,結(jié)果顯示：Let-7f處理組中腫瘤的體積和重量比空白對(duì)照和陰性對(duì)照組明顯減小。顱內(nèi)模型顯示了:Let-7f處理組中,腫瘤組織與正常組織的邊緣是清晰的。這些結(jié)果表明在體內(nèi),Let-7f能夠抑制膠質(zhì)瘤的增殖和侵襲�？傊�,本研究發(fā)現(xiàn)Let-7f在膠質(zhì)瘤低表達(dá),過表達(dá)Let-7f能夠在體內(nèi)外抑制膠質(zhì)瘤增殖、侵襲及遷移的能力,periostin為Let-7f靶點(diǎn)基因,并進(jìn)一步表明了Let-7f有希望成為膠質(zhì)瘤診斷和治療的新靶點(diǎn)。第二部分：MMPI對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及機(jī)制研究1.MMPI(ILO)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力和侵襲能力的影響采用不同濃度的MMPI(0-1OOμM)處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞24小時(shí),CCK-8檢測(cè)的結(jié)果：0-50μM沒有對(duì)膠質(zhì)瘤有明顯的影響,當(dāng)藥物濃度大于75μM時(shí)明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的活性。我們選用MMPI(50μM)作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的使用濃度。MMPI(50μM)處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞24小時(shí),膠質(zhì)瘤細(xì)胞仍能保持較高的侵襲遷移能力。2.MMPI(ILO)秀導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞采用阿米巴樣運(yùn)動(dòng)方式為了研究MMPI對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)方式的影響,我們進(jìn)一步檢測(cè)ILO對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞形態(tài)和骨架的影響。結(jié)果顯示,MMPI誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞由長梭形轉(zhuǎn)變成圓形,細(xì)胞骨架有縱行排列轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)狀排列。同時(shí),MMPI誘導(dǎo)RhoA/ROCK/MLC信號(hào)活化。3.RhoA/ROCK介導(dǎo)了MMPI(ILO)誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞阿米巴樣轉(zhuǎn)變我們選用了RhoA/ROCK通路抑制劑Y-27632處理細(xì)胞,結(jié)果顯示：Y-27632處理后,由ILO誘導(dǎo)形成的圓形細(xì)胞比例下降,并且膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力進(jìn)一步下降。4.P115RhoGEF參與了MMPI(ILO)誘導(dǎo)的RhoA的活化,為了進(jìn)一步探究RhoA的活化機(jī)制,我們檢測(cè)P115RhoGEF是否參與了MMPI(ILO)誘導(dǎo)的RhoA活化,結(jié)果顯示：MMPI能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞P115RhoGEF的活化,P115RhoGEF-siRNA后,RhoA活性降低,MMPI誘導(dǎo)的圓形細(xì)胞比例下降和阿米巴樣侵襲遷移能力下降。5.在體內(nèi)聯(lián)合應(yīng)用MMPI(ILO)和ROCKI能夠延長了荷瘤裸鼠的生存時(shí)間我們構(gòu)建膠質(zhì)瘤細(xì)胞原位模型,腹腔注射MMPI和ROCKI結(jié)果顯示：聯(lián)合應(yīng)用MMPI和ROCKI比單獨(dú)應(yīng)用MMPI或ROCKI裸鼠的生存時(shí)間明顯延長�？傊�,MMPI(ILO)誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞活化P115RhoGEF/RhoA/ROCK信號(hào)發(fā)生MAT,本研究解釋了MMPI治療膠質(zhì)瘤失敗的原因及機(jī)制,在體內(nèi)外聯(lián)合應(yīng)用MMPI和ROCKI能夠有效抑制膠質(zhì)瘤的侵襲能力,聯(lián)合試劑的應(yīng)用彌補(bǔ)了MMPI抑制膠質(zhì)瘤侵襲的不足。
【關(guān)鍵詞】：膠質(zhì)瘤 Let-7f MMPI 侵襲 增殖
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R739.4
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-15
• 符號(hào)說明15-17
• 第一部分：Let-7f對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及機(jī)制研究17-62
• 前言17-18
• 材料與方法18-45
• 1.實(shí)驗(yàn)材料18-26
• 2.實(shí)驗(yàn)方法26-45
• 結(jié)果45-49
• 1.Let7f在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)45
• 2.Let-7f抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞X椫，
  
  本文編號(hào)：584656
  boshi