發(fā)布時間：2017-07-28 15:12

  本文關(guān)鍵詞：Let-7f和MMPI對膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響及機制研究

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【摘要】：腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一。膠質(zhì)瘤患者的生存期比較短,大約為14個月。盡管近年來,膠質(zhì)瘤手術(shù)技術(shù)、化療、放療等治療手段,取得了很大進步,然而,膠質(zhì)瘤確診患者中,只有大約5%的患者生存期超過5年。膠質(zhì)瘤的惡性行為主要是由于其快速的生長、血管形成、全腦廣泛的浸潤侵襲及多種化療藥物的耐藥等。如何能有效的抑制膠質(zhì)瘤細胞的生長和侵襲的能力,并且延長患者的生存時間和改善患者的生存狀態(tài)是當(dāng)今神經(jīng)科學(xué)亟待解決的問題。然而,理解引起膠質(zhì)瘤惡性行為的生物學(xué)作用和分子機制是目前首要解決的問題。MicroRNA通過抑制轉(zhuǎn)錄或降解靶點mRNA來抑制蛋白的轉(zhuǎn)錄。大量的報道顯示,在腫瘤細胞中,microRNA起到致癌基因或抑癌基因作用。MicroRNA在腫瘤細胞的分化、生長和細胞運動中扮演重要角色。相比較在正常腦組織中,在膠質(zhì)瘤細胞中有大量的microRNAS異常表達,并參與到膠質(zhì)瘤細胞的起源和發(fā)展。Let-7f是Let-7家族成員,位于9q22.3。Let-7f在不同的腫瘤中表達是不同的,在許多腫瘤中表達下調(diào),包括卵巢癌、肉瘤、胃癌等。然而,Let-7f在乳腺癌和肝癌中的表達是上調(diào)的。Let-7f主要的生物學(xué)功能是參與到腫瘤細胞的起源和進展。目前,有報道顯示Let-7f在膠質(zhì)瘤細胞中表達下調(diào)。然而,Let-7f對膠質(zhì)瘤細胞的生物學(xué)作用及機制并不十分清楚�；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在膠質(zhì)瘤細胞的運動過程中發(fā)揮重要的作用,因此,MMPs被認為是膠質(zhì)瘤治療的重要靶點之一。然而,不幸的是,基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(MMPI)對膠質(zhì)瘤患者治療的結(jié)果并不令人滿意,沒有取得顯著的治療效果。因此,研究MMPI失敗的原因是必要的。腫瘤細胞具有可塑性,在不同的環(huán)境中能夠采取間充質(zhì)樣或阿米巴樣這兩種不同方式來運動。一些腫瘤細胞采取間充質(zhì)-阿米巴運動模式的轉(zhuǎn)換(MAT)來補償MMPI對腫瘤細胞侵襲的抑制作用,并且MAT是MMPI治療腫瘤失敗的重要原因和機制。然而,在膠質(zhì)瘤在膠質(zhì)瘤治療中,很少報告MMPI是否能夠引起膠質(zhì)瘤(間充質(zhì)-阿米巴轉(zhuǎn)換)(MAT)。更重要的是本研究發(fā)現(xiàn)RhoA/ROCK信號在MAT過程中起關(guān)鍵作用,聯(lián)合應(yīng)用MMPI和RhoA/ROCK通路抑制劑,能夠有效抑制膠質(zhì)瘤細胞的運動能力。本課題分兩部分：分別研究了Let-7f和MMPI對膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移及侵襲的影響,并探討其機制,以期為膠質(zhì)瘤的靶向治療提供理論基礎(chǔ)和實踐依據(jù)。第一部分：Let-7f對膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響及機制研究1.膠質(zhì)瘤組織和細胞系Let-7f的表達下調(diào)首先,我們分別檢測了膠質(zhì)瘤組織樣本、正常腦組織和膠質(zhì)瘤細胞系中Let-7f的表達情況。結(jié)果顯示,Let-7f在膠質(zhì)瘤組織樣本中比正常腦組織中表達下調(diào),其表達情況與膠質(zhì)瘤級別的增高呈負相關(guān)。同樣,Let-7f在膠質(zhì)瘤細胞系T98G、U87和A172比在正常星型細胞系表達下調(diào)。另外,我們統(tǒng)計分析了在膠質(zhì)母細胞瘤中Let-7f表達與患者生存期的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者的低生存期伴隨著Let-7f的低表達。這些結(jié)果暗示了Let-7f在膠質(zhì)瘤細胞中可能發(fā)揮抑癌基因的作用。2.在體外膠質(zhì)瘤細胞中過表達Let-7f抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖能力U87和A172細胞轉(zhuǎn)染后,采用CCK-8法檢測,分別在24、48、72和96小時,檢測膠質(zhì)瘤細胞的增殖能力。結(jié)果顯示：膠質(zhì)瘤細胞Let-7f過表達組比未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組細胞的增殖能力下降；Edu檢測實驗也表明了過表達Let-7f顯著的抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖能力。另外,克隆形成實驗的結(jié)果顯示：Let-7f過表達組的克隆數(shù)目比未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組明顯減少,這說明過表達Let-7f能夠長時抑制膠質(zhì)瘤細胞的生長能力。這些實驗結(jié)果表明了在體外過表達Let-7f能夠抑制膠質(zhì)瘤細胞生長能力。3.在體外膠質(zhì)瘤細胞中過表達Let-7f抑制膠質(zhì)瘤細胞遷移和侵襲Transwell侵襲和遷移實驗檢測Let-7f對膠質(zhì)瘤細胞運動能力的影響,結(jié)果顯示：膠質(zhì)瘤細胞在轉(zhuǎn)染48小時后,Let-7f過表達組細胞的侵襲和遷移能力比空白組和陰性對照組明顯降低。MMP2和MMP9蛋白水平降低。這些結(jié)果表明了,在體外膠質(zhì)瘤細胞中過表達Let-7f抑制膠質(zhì)瘤細胞遷移和侵襲的能力。4.Periostin是Let-7f的直接靶點我們查閱Microrna、Targetscan和miRBase等數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)periostin與Let-7f在3'UTR區(qū)具有潛在的結(jié)合位點。熒光素酶報告基因法和western blot檢測的結(jié)果進一步驗證了periostin為Let-7f直接靶點基因。5.Periostin涉及到Let-7f對膠質(zhì)瘤細胞增殖、侵襲和遷移的調(diào)節(jié)。我們選用干擾RNA方法敲除periostin,進一步檢測periostin敲除后,對細胞行為的影響,發(fā)現(xiàn)periostin敲除后,細胞侵襲、遷移和增殖能力下降。膠質(zhì)瘤細胞過表達periostin能夠部分逆轉(zhuǎn)Let-7f對膠質(zhì)瘤細胞的抑制作用。6.在體內(nèi),Let-7f抑制膠質(zhì)瘤細胞惡性表現(xiàn)在膠質(zhì)瘤皮下異位模型中瘤內(nèi)注射Let-7f,結(jié)果顯示：Let-7f處理組中腫瘤的體積和重量比空白對照和陰性對照組明顯減小。顱內(nèi)模型顯示了:Let-7f處理組中,腫瘤組織與正常組織的邊緣是清晰的。這些結(jié)果表明在體內(nèi),Let-7f能夠抑制膠質(zhì)瘤的增殖和侵襲�？傊�,本研究發(fā)現(xiàn)Let-7f在膠質(zhì)瘤低表達,過表達Let-7f能夠在體內(nèi)外抑制膠質(zhì)瘤增殖、侵襲及遷移的能力,periostin為Let-7f靶點基因,并進一步表明了Let-7f有希望成為膠質(zhì)瘤診斷和治療的新靶點。第二部分：MMPI對膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響及機制研究1.MMPI(ILO)對膠質(zhì)瘤細胞活力和侵襲能力的影響采用不同濃度的MMPI(0-1OOμM)處理膠質(zhì)瘤細胞24小時,CCK-8檢測的結(jié)果：0-50μM沒有對膠質(zhì)瘤有明顯的影響,當(dāng)藥物濃度大于75μM時明顯抑制膠質(zhì)瘤細胞的活性。我們選用MMPI(50μM)作為后續(xù)實驗的使用濃度。MMPI(50μM)處理膠質(zhì)瘤細胞24小時,膠質(zhì)瘤細胞仍能保持較高的侵襲遷移能力。2.MMPI(ILO)秀導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞采用阿米巴樣運動方式為了研究MMPI對細胞運動方式的影響,我們進一步檢測ILO對膠質(zhì)瘤細胞形態(tài)和骨架的影響。結(jié)果顯示,MMPI誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞由長梭形轉(zhuǎn)變成圓形,細胞骨架有縱行排列轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)狀排列。同時,MMPI誘導(dǎo)RhoA/ROCK/MLC信號活化。3.RhoA/ROCK介導(dǎo)了MMPI(ILO)誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞阿米巴樣轉(zhuǎn)變我們選用了RhoA/ROCK通路抑制劑Y-27632處理細胞,結(jié)果顯示：Y-27632處理后,由ILO誘導(dǎo)形成的圓形細胞比例下降,并且膠質(zhì)瘤細胞的侵襲能力進一步下降。4.P115RhoGEF參與了MMPI(ILO)誘導(dǎo)的RhoA的活化,為了進一步探究RhoA的活化機制,我們檢測P115RhoGEF是否參與了MMPI(ILO)誘導(dǎo)的RhoA活化,結(jié)果顯示：MMPI能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞P115RhoGEF的活化,P115RhoGEF-siRNA后,RhoA活性降低,MMPI誘導(dǎo)的圓形細胞比例下降和阿米巴樣侵襲遷移能力下降。5.在體內(nèi)聯(lián)合應(yīng)用MMPI(ILO)和ROCKI能夠延長了荷瘤裸鼠的生存時間我們構(gòu)建膠質(zhì)瘤細胞原位模型,腹腔注射MMPI和ROCKI結(jié)果顯示：聯(lián)合應(yīng)用MMPI和ROCKI比單獨應(yīng)用MMPI或ROCKI裸鼠的生存時間明顯延長�？傊�,MMPI(ILO)誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞活化P115RhoGEF/RhoA/ROCK信號發(fā)生MAT,本研究解釋了MMPI治療膠質(zhì)瘤失敗的原因及機制,在體內(nèi)外聯(lián)合應(yīng)用MMPI和ROCKI能夠有效抑制膠質(zhì)瘤的侵襲能力,聯(lián)合試劑的應(yīng)用彌補了MMPI抑制膠質(zhì)瘤侵襲的不足。
【關(guān)鍵詞】：膠質(zhì)瘤 Let-7f MMPI 侵襲 增殖
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.4
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-15
• 符號說明15-17
• 第一部分：Let-7f對膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響及機制研究17-62
• 前言17-18
• 材料與方法18-45
• 1.實驗材料18-26
• 2.實驗方法26-45
• 結(jié)果45-49
• 1.Let7f在膠質(zhì)瘤組織和細胞系中表達下調(diào)45
• 2.Let-7f抑制膠質(zhì)瘤細胞X椫，
  
  本文編號：584656
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