本文關(guān)鍵詞：當(dāng)歸補血湯調(diào)控紅系祖細(xì)胞分化的機制

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【摘要】：研究的背景和目的紅細(xì)胞是人體血液中數(shù)量最多的一種血細(xì)胞,是血液運送氧氣的最主要媒介,同時還具有免疫功能,稱為人體內(nèi)的紅色衛(wèi)士。體內(nèi)紅細(xì)胞的生成過程是一個復(fù)雜的、多步驟的過程,首先由骨髓中多潛能干細(xì)胞分化為紅系祖細(xì)胞(CFU-E和BFU-E),紅系祖細(xì)胞進(jìn)一步經(jīng)過多步驟,最終分化為成熟的紅細(xì)胞,此過程有多種造血相關(guān)細(xì)胞和細(xì)胞因子參與其中。紅細(xì)胞是機體中重要的天然免疫細(xì)胞,在機體的防御系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。有許多疾病的發(fā)生與紅細(xì)胞天然免疫功能的變化有關(guān),例如腫瘤、傳染病、血液病和自身免疫型疾病等。紅細(xì)胞在機體免疫反應(yīng)中的作用主要有：增強吞噬作用、清除循環(huán)免疫復(fù)合物、識別和攜帶抗原、免疫調(diào)節(jié)作用、效應(yīng)細(xì)胞的作用等。臨床治療紅細(xì)胞減少可以通過紅細(xì)胞回輸?shù)姆椒▉砘謴?fù)血液中紅細(xì)胞的數(shù)量,但伴有病毒和細(xì)菌感染的危險；可以通過靜脈補鐵來治療與缺鐵相關(guān)的貧血,但可能會引起惡心、面部潮紅、低血壓和過敏反應(yīng)等副作用,嚴(yán)重的會導(dǎo)致死亡；也可以通過促紅細(xì)胞生成素(EPO)來促進(jìn)機體自身紅細(xì)胞的生成,但是多達(dá)10%的貧血病人會因體內(nèi)產(chǎn)生EPO中和抗體或其它原因而導(dǎo)致治療失敗。EPO作為控制體內(nèi)紅細(xì)胞水平的主要細(xì)胞因子只是在CFU-E祖細(xì)胞分化為成熟紅細(xì)胞的前期階段起調(diào)控作用,而且體內(nèi)CFU-E祖細(xì)胞的數(shù)量限制了EPO促進(jìn)紅細(xì)胞生成的能力。因此單純利用EPO治療紅細(xì)胞減少,只能調(diào)控紅細(xì)胞生成的某一環(huán)節(jié),不能從根本上對紅細(xì)胞的生成進(jìn)行有效調(diào)控,同時CFU-E的消耗也會導(dǎo)致BFU-E祖細(xì)胞的消耗,從而導(dǎo)致BFU-E祖細(xì)胞庫的衰竭,繼而影響機體的后續(xù)造血,已有文獻(xiàn)報道用EPO治療后會導(dǎo)致嚴(yán)重的純紅細(xì)胞再生障礙。因此開發(fā)給藥方便的、多靶點整體調(diào)節(jié)的,同時又安全有效的促紅細(xì)胞生成藥物是有必要的。補血類中藥作為中藥的優(yōu)勢藥種,尤其是當(dāng)歸補血湯臨床應(yīng)用已有800多年的歷史,在促進(jìn)機體紅細(xì)胞生成方面臨床療效顯著、副作用小。中藥特別是復(fù)方中藥的特點是組成成分復(fù)雜、作用靶點多樣性,這與中藥治療講究對機體的整體調(diào)節(jié)是相一致的,也是中藥發(fā)揮治療作用的根本。而中藥治療的這種整體調(diào)節(jié)性與紅細(xì)胞生成過程的復(fù)雜性也是相一致的。因此中藥治療恰好能夠彌補單一細(xì)胞因子治療的缺陷,可以通過多途徑、多靶點從根本上來調(diào)控紅系祖細(xì)胞的分化過程,同時治療成本低。本項目研究的中藥組方當(dāng)歸補血湯,出自金元四大家之一李杲的《內(nèi)外傷辨惑論》卷中,方劑組成為黃芪一兩,當(dāng)歸兩錢,具有補氣生血之功效,主治勞倦內(nèi)傷,氣血虛弱,陽浮于外,肌膚燥熱,面紅目赤,煩渴引飲,脈洪大而虛,以及婦人經(jīng)行、產(chǎn)后血虛發(fā)熱頭痛,或瘡瘍潰后久不愈合者。已有800多年的應(yīng)用歷史,臨床療效顯著,特別是對放化療引起的骨髓抑制有很好的緩解作用。已有文獻(xiàn)報道,當(dāng)歸補血湯能夠升高外周血中紅細(xì)胞和骨髓組織中BFU-E和CFU-E祖細(xì)胞的數(shù)量。經(jīng)過長期的民間實踐驗證,具有確切補血作用的中藥組方,是值得大力開發(fā)的優(yōu)勢藥物。本研究將在前人研究的基礎(chǔ)上,首先建立當(dāng)歸補血湯質(zhì)量控制方法以保證后續(xù)藥效實驗結(jié)果的重復(fù)性和穩(wěn)定性,后利用小鼠作為動物模型探討當(dāng)歸補血湯在小鼠體內(nèi)的促紅細(xì)胞生成能力,并尋找當(dāng)歸補血湯潛在的作用靶點,為后續(xù)體外模型的建立奠定基礎(chǔ),而后利用合適的體外細(xì)胞模型來探討當(dāng)歸補血湯發(fā)揮藥效作用的機制,最后利用譜效關(guān)系來初步探討當(dāng)歸補血湯發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。研究內(nèi)容和結(jié)論第一部分當(dāng)歸補血湯質(zhì)控方法建立1、當(dāng)歸補血湯HPLC色譜條件優(yōu)化2、當(dāng)歸補血湯HPLC色譜條件方法學(xué)驗證3、當(dāng)歸補血湯中阿魏酸和芒柄花素含量測定4、當(dāng)歸補血湯共有指紋圖譜和共有峰研究主要結(jié)論：不同溶劑溶解樣品所得色譜峰的數(shù)目和分離度不同,95%甲醇用來溶解樣品時,所得色譜峰的數(shù)目多于其它兩種,色譜峰的總峰面積也最高,但通過分析色譜峰的峰形發(fā)現(xiàn),親水區(qū)95%甲醇所獲得峰形都比較寬、平且伴有肩峰,峰的對稱性和分離度相比另外兩種較差,疏水區(qū)5%和50%甲醇所獲得峰的峰高低于95%,其中5%所獲得峰數(shù)目較少,峰的峰高較50%和95%低很多,有可能影響峰的檢出。建立色譜條件的目的是使更多的化合物能夠被檢出,因此選擇50%甲醇作為溶解樣品的溶劑。色譜柱對中藥組分的分離有影響,其中Agilent TC-C 18色譜柱所得色譜圖對應(yīng)色譜峰的保留時間較另外兩種色譜柱時間延后,并且親水性藥物組分的分離效果顯著好于其它兩種色譜柱。疏水性藥物組分的分離效果三種色譜柱都能做到基線分離。綜合以上分析,Agilent TC-C 18色譜柱的分離效果最好。不同流動相的分離能力也有所不同,乙腈洗脫能力強于甲醇,色譜峰出峰時間較快,保留時間較短。甲醇乙酸洗脫系統(tǒng)與其它三種洗脫系統(tǒng)相比色譜圖Ⅱ區(qū)峰數(shù)量較多,分離度較高,峰的對稱性較好；Ⅲ區(qū)色譜峰乙腈洗脫系統(tǒng)的分離效果較甲醇系統(tǒng)好,但從峰的數(shù)目和能否做到基線分離來看,甲醇系統(tǒng)也可以做到基線分離,只是分離度沒有乙腈系統(tǒng)高。綜合以上分析,我們選擇甲醇乙酸系統(tǒng)作為進(jìn)一步優(yōu)化的流動相。由于流動相洗脫能力的不同,不同分析物解吸附的時間就有所不同,從而導(dǎo)致峰與峰之間分離度不同。因此我們根據(jù)不同階段峰分離度的不同,采取了不同梯度的洗脫方法來達(dá)到最佳的分離效果。最終通過實驗取得了良好的色譜峰分離度和基線分離。為了達(dá)到控制產(chǎn)品質(zhì)量的目的,所采取的分析方法必須具有很高的準(zhǔn)確性和可靠性,因此需要對所采取方法進(jìn)行方法學(xué)驗證。穩(wěn)定性試驗表明不同時間點所得色譜指紋圖譜與其所得共有模式圖譜的相似度,均大于0.950,各色譜峰保留時間的RSD均小于0.3%,相對峰高比值的RSD除6和11號峰外(6號6.42%,11號5.09%)均小于5%,說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定；精密度試驗表明6次所得色譜指紋圖譜與其所得共有模式圖譜的相似度,均大于0.950,各色譜峰保留時間的RSD均小于0.8%,相對峰高比值的RSD均小于5%,結(jié)果表明精密度良好；重復(fù)性試驗表明6份供試品所得指紋圖譜與其所得共有模式圖譜的相似度,均大于0.99,各色譜峰保留時間的RSD均小于1.5%,相對峰高比值的RSD均小于5%,結(jié)果表明重復(fù)性良好。通過比較6批當(dāng)歸補血湯的指紋圖譜,共篩選出17個共有峰,共有峰的保留時間RSD均小于0.1%,因此標(biāo)定此17個峰為共有指紋峰。第二部分當(dāng)歸補血湯調(diào)控紅系祖細(xì)胞分化機制1、當(dāng)歸補血湯小鼠體內(nèi)促紅細(xì)胞生成能力及作用靶點研究2、體外細(xì)胞模型建立3、當(dāng)歸補血湯促骨髓基質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增加機制4、當(dāng)歸補血湯體外促紅系祖細(xì)胞分化機制主要結(jié)論：當(dāng)歸補血湯小鼠體內(nèi)能夠促進(jìn)紅細(xì)胞生成。單因素方差分析結(jié)果表明各組間紅細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞和白細(xì)胞數(shù)目差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=7.608,P0.001；F=6.391,P=0.001；F=3.067,P=0.028),LSD多重比較表明,當(dāng)歸補血湯高劑量組與模型組相比外周血中網(wǎng)織紅細(xì)胞的數(shù)目顯著升高(P0.05),當(dāng)歸補血湯組外周血中紅細(xì)胞數(shù)目與模型組相比無顯著性差異。因此得出結(jié)論,當(dāng)歸補血湯在小鼠體內(nèi)能夠促進(jìn)網(wǎng)織紅細(xì)胞的生成,但對外周血中紅細(xì)胞的數(shù)目影響不大,這可能與外周血中成熟紅細(xì)胞的生命周期有關(guān)。集落形成單位培養(yǎng)實驗單因素方差分析結(jié)果表明各組間CFU-E和BFU-E克隆數(shù)目差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=10.119,P0.001；F=9.346,P0.001),LSD多重比較表明當(dāng)歸補血湯中劑量組和高劑量組骨髓中晚期紅系祖細(xì)胞的數(shù)目與模型組相比顯著升高(P0.01),當(dāng)歸補血湯中劑量組和高劑量組骨髓中早期紅系祖細(xì)胞的數(shù)目與模型組相比顯著升高(P0.01)。流式結(jié)果表明當(dāng)歸補血湯中、高劑量組骨髓中紅系相關(guān)細(xì)胞百分比與模型組相比顯著性升高(P0.01)。以上結(jié)果表明,當(dāng)歸補血湯可通過促進(jìn)紅系祖細(xì)胞增殖和分化來促進(jìn)紅細(xì)胞的生成。取不同組骨髓細(xì)胞體外培養(yǎng),以觀察骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生長狀態(tài)。結(jié)果表明,第三天時各組都有細(xì)胞開始貼壁生長,其中當(dāng)歸補血湯低、中、高劑量組和正常組較為顯著,貼壁生長細(xì)胞約鋪滿96孔板底的四分之一,而骨髓抑制模型組貼壁細(xì)胞細(xì)胞數(shù)目較少；第六天時當(dāng)歸補血湯高劑量組貼壁細(xì)胞已鋪板板底的二分之一；培養(yǎng)第九天當(dāng)歸補血湯高劑量組有明顯的成纖維細(xì)胞克隆形成。細(xì)胞周期結(jié)果表明,當(dāng)歸補血湯低、中和高劑量組G2M期細(xì)胞比例分別為8%、7.4%和7.6%,與模型組相比P0.05,無顯著差異。細(xì)胞黏附實驗表明,當(dāng)歸補血湯中劑量和高劑量組聚集細(xì)胞的數(shù)目與模型組相比顯著著升高,具有顯著差異(P0.05)。通過以上動物實驗結(jié)果,推測當(dāng)歸補血湯調(diào)控紅系祖細(xì)胞分化為成熟紅細(xì)胞的途徑之一,可能是通過增加骨髓基質(zhì)細(xì)胞與紅系祖細(xì)胞之間的相互接觸,并傳遞促紅系祖細(xì)胞向成熟紅細(xì)胞分化的細(xì)胞信號來完成。骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)受到細(xì)胞接種密度和培養(yǎng)體系體積的影響。接種1×105個/孔的培養(yǎng)孔基本無骨髓基質(zhì)細(xì)胞生長,接種3×105個/孔細(xì)胞的骨髓基質(zhì)細(xì)胞貼壁約30%左右,接種5×105個/孔細(xì)胞的基質(zhì)細(xì)胞貼壁達(dá)90%左右。3×105個/孔體系組,150μL和200μL培養(yǎng)體系孔骨髓基質(zhì)細(xì)胞的貼壁數(shù)目顯著低于100μL體系孔(P0.01),而接種細(xì)胞數(shù)目為5×105個/孔時,各培養(yǎng)體系組骨髓基質(zhì)細(xì)胞貼壁數(shù)目無顯著差異。當(dāng)細(xì)胞接種密度為3×105個/孔時,條件培養(yǎng)基組與普通培養(yǎng)基組相比能顯著促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生長(P0.05),而細(xì)胞接種數(shù)目為5×105個/孔時,條件培養(yǎng)基組細(xì)胞貼壁數(shù)目與普通培養(yǎng)基組無顯著差異。結(jié)果提示我們條件培養(yǎng)基包含有促骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外生長所必須的生長因子,因此骨髓基質(zhì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)時自身會分泌胞外因子來促進(jìn)自身的生長,并且當(dāng)胞外因子的濃度達(dá)到一定濃度后促生長作用達(dá)到平臺,同時提示我們可以通過利用條件培養(yǎng)基來進(jìn)行骨髓基質(zhì)細(xì)胞的體外低密度培養(yǎng)。當(dāng)歸補血湯在體外能夠增加骨髓基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目,在低劑量濃度時促進(jìn)效果同藥物濃度呈劑量依賴關(guān)系,隨著藥物濃度的升高細(xì)胞數(shù)目增加,但隨著藥物濃度的進(jìn)一步增加,促進(jìn)效果成下降趨勢,在藥物濃度為1000μg/ml時促進(jìn)效果最為明顯。生長曲線表明當(dāng)歸補血湯組生長曲線斜率高于對照組生長曲線的斜率。細(xì)胞周期結(jié)果表明,當(dāng)歸補血湯對貼壁細(xì)胞的細(xì)胞周期無影響,給藥組和對照組G1期細(xì)胞比例和S、G2M期細(xì)胞比例無顯著差異；對懸浮細(xì)胞細(xì)胞周期有影響,G1期細(xì)胞比例給藥組顯著低于對照組(P0.01),S期和G2M期細(xì)胞比例給藥組顯著高于對照組(P0.01)。給藥時間實驗表明培養(yǎng)4天后再加入當(dāng)歸補血湯對骨髓基質(zhì)細(xì)胞無促進(jìn)作用。以上實驗結(jié)果提示當(dāng)歸補血湯促骨髓基質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增加的機制是通過增加骨髓基質(zhì)細(xì)胞的體外貼壁能力,從而導(dǎo)致骨髓基質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞的種類不同,從而導(dǎo)致生長曲線斜率的不同,但對體外培養(yǎng)懸浮細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用,這可能與細(xì)胞之間的相互通訊有關(guān)。體外集落形成實驗表明當(dāng)歸補血湯不能直接作用于紅系造血祖細(xì)胞,需要其它細(xì)胞和造血因子的協(xié)助。鵝卵石形成實驗表明,當(dāng)歸補血湯組克隆形成數(shù)目與對照組相比顯著升高(P0.01),通過比較兩組所形成克隆的大小,當(dāng)歸補血湯組顯著大于對照組。因此得出結(jié)論,體外在骨髓基質(zhì)細(xì)胞的協(xié)助下,當(dāng)歸補血湯能夠促進(jìn)造血祖細(xì)胞克隆形成,并且能夠使造血祖細(xì)胞的增殖分化能力加快。綜合以上分析,推測當(dāng)歸補血湯調(diào)控紅系祖細(xì)胞分化為成熟紅細(xì)胞的其中一種可能作用機制：當(dāng)歸補血湯促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞黏附分子的表達(dá),從而增加了骨髓基質(zhì)細(xì)胞與紅系祖細(xì)胞之間的直接通訊,從而傳遞紅系祖細(xì)胞增殖和分化的信號來調(diào)控其分化第三部分當(dāng)歸補血湯調(diào)控紅系祖細(xì)胞分化的物質(zhì)基礎(chǔ)1、不同批次當(dāng)歸補血湯的藥效學(xué)作用2、不同批次當(dāng)歸補血湯藥效作用與指紋圖譜之間的譜效關(guān)系主要結(jié)論：不同批次當(dāng)歸補血湯促骨髓基質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增加的能力有所不同,其中GG組當(dāng)歸補血湯促骨髓基質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增加的能力顯著強于其它組(P0.05)。通過直觀比較法和相關(guān)系數(shù)法探討當(dāng)歸補血湯指紋圖譜與藥效學(xué)之間的譜效關(guān)系。通過比較GG組當(dāng)歸補血湯指紋圖譜與其它組指紋圖譜的差異,尋找在GG組峰面積最高的特征峰作為當(dāng)歸補血湯潛在的物質(zhì)基礎(chǔ)。又進(jìn)一步通過統(tǒng)計軟件分析了各色譜峰峰面積與藥效之間的相關(guān)性,以尋找當(dāng)歸補血湯發(fā)揮藥效的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)。通過分析發(fā)現(xiàn),當(dāng)歸補血湯潛在的物質(zhì)基礎(chǔ)主要存在于親水區(qū)。
【關(guān)鍵詞】：當(dāng)歸補血湯 紅系祖細(xì)胞 質(zhì)量控制 譜效關(guān)系 骨髓基質(zhì)細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R285
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-20
• 第一章 緒論20-23
• 第二章 當(dāng)歸補血湯質(zhì)控方法建立23-53
• 1、前言23-25
• 2、材料與方法25-29
• 3、結(jié)果與分析29-48
• 3.1 色譜條件優(yōu)化29-34
• 3.2 色譜條件方法學(xué)驗證34-43
• 3.3 阿魏酸、芒柄花素含量測定43-46
• 3.4 不同產(chǎn)地指紋圖譜分析46-48
• 4、討論48-53
• 4.1 樣品溶解條件的選擇49
• 4.2 色譜柱的選擇49-50
• 4.3 流動相的選擇50-51
• 4.4 梯度優(yōu)化51
• 4.5 方法學(xué)驗證51-52
• 4.6 阿魏酸和芒柄花素含量分析52
• 4.7 共有峰和對照圖譜建立52-53
• 第三章 當(dāng)歸補血湯調(diào)控紅系祖細(xì)胞分化機制53-90
• 1、前言53-55
• 2、材料與方法55-61
• 3、結(jié)果與分析61-84
• 3.1 動物實驗61-72
• 3.2 細(xì)胞評價模型建立72-76
• 3.3 當(dāng)歸補血湯體外促骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖能力研究76-82
• 3.4 當(dāng)歸補血湯對紅系祖細(xì)胞直接作用82-83
• 3.5 當(dāng)歸補血湯對紅系祖細(xì)胞間接作用83-84
• 4、討論84-90
• 第四章 當(dāng)歸補血湯調(diào)控紅系祖細(xì)胞分化的物質(zhì)基礎(chǔ)90-98
• 1、前言90-91
• 2、材料與方法91-92
• 3、結(jié)果與分析92-95
• 3.1 不同產(chǎn)地當(dāng)歸補血湯促骨髓基質(zhì)細(xì)胞貼壁能力92-93
• 3.2 當(dāng)歸補血湯指紋圖譜與其藥效作用之間的譜效關(guān)系93-95
• 4、討論95-96
• 5、展望96-98
• 參考文獻(xiàn)98-107
• 附錄107-108
• 博士研究生期間發(fā)表論文情況108-109
• 致謝109-112
• 統(tǒng)計學(xué)審稿證明112

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本文編號：583884