本文關(guān)鍵詞：當(dāng)歸補(bǔ)血湯調(diào)控紅系祖細(xì)胞分化的機(jī)制

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【摘要】：研究的背景和目的紅細(xì)胞是人體血液中數(shù)量最多的一種血細(xì)胞,是血液運(yùn)送氧氣的最主要媒介,同時(shí)還具有免疫功能,稱為人體內(nèi)的紅色衛(wèi)士。體內(nèi)紅細(xì)胞的生成過程是一個(gè)復(fù)雜的、多步驟的過程,首先由骨髓中多潛能干細(xì)胞分化為紅系祖細(xì)胞(CFU-E和BFU-E),紅系祖細(xì)胞進(jìn)一步經(jīng)過多步驟,最終分化為成熟的紅細(xì)胞,此過程有多種造血相關(guān)細(xì)胞和細(xì)胞因子參與其中。紅細(xì)胞是機(jī)體中重要的天然免疫細(xì)胞,在機(jī)體的防御系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。有許多疾病的發(fā)生與紅細(xì)胞天然免疫功能的變化有關(guān),例如腫瘤、傳染病、血液病和自身免疫型疾病等。紅細(xì)胞在機(jī)體免疫反應(yīng)中的作用主要有：增強(qiáng)吞噬作用、清除循環(huán)免疫復(fù)合物、識(shí)別和攜帶抗原、免疫調(diào)節(jié)作用、效應(yīng)細(xì)胞的作用等。臨床治療紅細(xì)胞減少可以通過紅細(xì)胞回輸?shù)姆椒▉砘謴?fù)血液中紅細(xì)胞的數(shù)量,但伴有病毒和細(xì)菌感染的危險(xiǎn)；可以通過靜脈補(bǔ)鐵來治療與缺鐵相關(guān)的貧血,但可能會(huì)引起惡心、面部潮紅、低血壓和過敏反應(yīng)等副作用,嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致死亡；也可以通過促紅細(xì)胞生成素(EPO)來促進(jìn)機(jī)體自身紅細(xì)胞的生成,但是多達(dá)10%的貧血病人會(huì)因體內(nèi)產(chǎn)生EPO中和抗體或其它原因而導(dǎo)致治療失敗。EPO作為控制體內(nèi)紅細(xì)胞水平的主要細(xì)胞因子只是在CFU-E祖細(xì)胞分化為成熟紅細(xì)胞的前期階段起調(diào)控作用,而且體內(nèi)CFU-E祖細(xì)胞的數(shù)量限制了EPO促進(jìn)紅細(xì)胞生成的能力。因此單純利用EPO治療紅細(xì)胞減少,只能調(diào)控紅細(xì)胞生成的某一環(huán)節(jié),不能從根本上對(duì)紅細(xì)胞的生成進(jìn)行有效調(diào)控,同時(shí)CFU-E的消耗也會(huì)導(dǎo)致BFU-E祖細(xì)胞的消耗,從而導(dǎo)致BFU-E祖細(xì)胞庫的衰竭,繼而影響機(jī)體的后續(xù)造血,已有文獻(xiàn)報(bào)道用EPO治療后會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的純紅細(xì)胞再生障礙。因此開發(fā)給藥方便的、多靶點(diǎn)整體調(diào)節(jié)的,同時(shí)又安全有效的促紅細(xì)胞生成藥物是有必要的。補(bǔ)血類中藥作為中藥的優(yōu)勢(shì)藥種,尤其是當(dāng)歸補(bǔ)血湯臨床應(yīng)用已有800多年的歷史,在促進(jìn)機(jī)體紅細(xì)胞生成方面臨床療效顯著、副作用小。中藥特別是復(fù)方中藥的特點(diǎn)是組成成分復(fù)雜、作用靶點(diǎn)多樣性,這與中藥治療講究對(duì)機(jī)體的整體調(diào)節(jié)是相一致的,也是中藥發(fā)揮治療作用的根本。而中藥治療的這種整體調(diào)節(jié)性與紅細(xì)胞生成過程的復(fù)雜性也是相一致的。因此中藥治療恰好能夠彌補(bǔ)單一細(xì)胞因子治療的缺陷,可以通過多途徑、多靶點(diǎn)從根本上來調(diào)控紅系祖細(xì)胞的分化過程,同時(shí)治療成本低。本項(xiàng)目研究的中藥組方當(dāng)歸補(bǔ)血湯,出自金元四大家之一李杲的《內(nèi)外傷辨惑論》卷中,方劑組成為黃芪一兩,當(dāng)歸兩錢,具有補(bǔ)氣生血之功效,主治勞倦內(nèi)傷,氣血虛弱,陽浮于外,肌膚燥熱,面紅目赤,煩渴引飲,脈洪大而虛,以及婦人經(jīng)行、產(chǎn)后血虛發(fā)熱頭痛,或瘡瘍潰后久不愈合者。已有800多年的應(yīng)用歷史,臨床療效顯著,特別是對(duì)放化療引起的骨髓抑制有很好的緩解作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道,當(dāng)歸補(bǔ)血湯能夠升高外周血中紅細(xì)胞和骨髓組織中BFU-E和CFU-E祖細(xì)胞的數(shù)量。經(jīng)過長期的民間實(shí)踐驗(yàn)證,具有確切補(bǔ)血作用的中藥組方,是值得大力開發(fā)的優(yōu)勢(shì)藥物。本研究將在前人研究的基礎(chǔ)上,首先建立當(dāng)歸補(bǔ)血湯質(zhì)量控制方法以保證后續(xù)藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性和穩(wěn)定性,后利用小鼠作為動(dòng)物模型探討當(dāng)歸補(bǔ)血湯在小鼠體內(nèi)的促紅細(xì)胞生成能力,并尋找當(dāng)歸補(bǔ)血湯潛在的作用靶點(diǎn),為后續(xù)體外模型的建立奠定基礎(chǔ),而后利用合適的體外細(xì)胞模型來探討當(dāng)歸補(bǔ)血湯發(fā)揮藥效作用的機(jī)制,最后利用譜效關(guān)系來初步探討當(dāng)歸補(bǔ)血湯發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。研究內(nèi)容和結(jié)論第一部分當(dāng)歸補(bǔ)血湯質(zhì)控方法建立1、當(dāng)歸補(bǔ)血湯HPLC色譜條件優(yōu)化2、當(dāng)歸補(bǔ)血湯HPLC色譜條件方法學(xué)驗(yàn)證3、當(dāng)歸補(bǔ)血湯中阿魏酸和芒柄花素含量測定4、當(dāng)歸補(bǔ)血湯共有指紋圖譜和共有峰研究主要結(jié)論：不同溶劑溶解樣品所得色譜峰的數(shù)目和分離度不同,95%甲醇用來溶解樣品時(shí),所得色譜峰的數(shù)目多于其它兩種,色譜峰的總峰面積也最高,但通過分析色譜峰的峰形發(fā)現(xiàn),親水區(qū)95%甲醇所獲得峰形都比較寬、平且伴有肩峰,峰的對(duì)稱性和分離度相比另外兩種較差,疏水區(qū)5%和50%甲醇所獲得峰的峰高低于95%,其中5%所獲得峰數(shù)目較少,峰的峰高較50%和95%低很多,有可能影響峰的檢出。建立色譜條件的目的是使更多的化合物能夠被檢出,因此選擇50%甲醇作為溶解樣品的溶劑。色譜柱對(duì)中藥組分的分離有影響,其中Agilent TC-C 18色譜柱所得色譜圖對(duì)應(yīng)色譜峰的保留時(shí)間較另外兩種色譜柱時(shí)間延后,并且親水性藥物組分的分離效果顯著好于其它兩種色譜柱。疏水性藥物組分的分離效果三種色譜柱都能做到基線分離。綜合以上分析,Agilent TC-C 18色譜柱的分離效果最好。不同流動(dòng)相的分離能力也有所不同,乙腈洗脫能力強(qiáng)于甲醇,色譜峰出峰時(shí)間較快,保留時(shí)間較短。甲醇乙酸洗脫系統(tǒng)與其它三種洗脫系統(tǒng)相比色譜圖Ⅱ區(qū)峰數(shù)量較多,分離度較高,峰的對(duì)稱性較好；Ⅲ區(qū)色譜峰乙腈洗脫系統(tǒng)的分離效果較甲醇系統(tǒng)好,但從峰的數(shù)目和能否做到基線分離來看,甲醇系統(tǒng)也可以做到基線分離,只是分離度沒有乙腈系統(tǒng)高。綜合以上分析,我們選擇甲醇乙酸系統(tǒng)作為進(jìn)一步優(yōu)化的流動(dòng)相。由于流動(dòng)相洗脫能力的不同,不同分析物解吸附的時(shí)間就有所不同,從而導(dǎo)致峰與峰之間分離度不同。因此我們根據(jù)不同階段峰分離度的不同,采取了不同梯度的洗脫方法來達(dá)到最佳的分離效果。最終通過實(shí)驗(yàn)取得了良好的色譜峰分離度和基線分離。為了達(dá)到控制產(chǎn)品質(zhì)量的目的,所采取的分析方法必須具有很高的準(zhǔn)確性和可靠性,因此需要對(duì)所采取方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明不同時(shí)間點(diǎn)所得色譜指紋圖譜與其所得共有模式圖譜的相似度,均大于0.950,各色譜峰保留時(shí)間的RSD均小于0.3%,相對(duì)峰高比值的RSD除6和11號(hào)峰外(6號(hào)6.42%,11號(hào)5.09%)均小于5%,說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定；精密度試驗(yàn)表明6次所得色譜指紋圖譜與其所得共有模式圖譜的相似度,均大于0.950,各色譜峰保留時(shí)間的RSD均小于0.8%,相對(duì)峰高比值的RSD均小于5%,結(jié)果表明精密度良好；重復(fù)性試驗(yàn)表明6份供試品所得指紋圖譜與其所得共有模式圖譜的相似度,均大于0.99,各色譜峰保留時(shí)間的RSD均小于1.5%,相對(duì)峰高比值的RSD均小于5%,結(jié)果表明重復(fù)性良好。通過比較6批當(dāng)歸補(bǔ)血湯的指紋圖譜,共篩選出17個(gè)共有峰,共有峰的保留時(shí)間RSD均小于0.1%,因此標(biāo)定此17個(gè)峰為共有指紋峰。第二部分當(dāng)歸補(bǔ)血湯調(diào)控紅系祖細(xì)胞分化機(jī)制1、當(dāng)歸補(bǔ)血湯小鼠體內(nèi)促紅細(xì)胞生成能力及作用靶點(diǎn)研究2、體外細(xì)胞模型建立3、當(dāng)歸補(bǔ)血湯促骨髓基質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增加機(jī)制4、當(dāng)歸補(bǔ)血湯體外促紅系祖細(xì)胞分化機(jī)制主要結(jié)論：當(dāng)歸補(bǔ)血湯小鼠體內(nèi)能夠促進(jìn)紅細(xì)胞生成。單因素方差分析結(jié)果表明各組間紅細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞和白細(xì)胞數(shù)目差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.608,P0.001；F=6.391,P=0.001；F=3.067,P=0.028),LSD多重比較表明,當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組與模型組相比外周血中網(wǎng)織紅細(xì)胞的數(shù)目顯著升高(P0.05),當(dāng)歸補(bǔ)血湯組外周血中紅細(xì)胞數(shù)目與模型組相比無顯著性差異。因此得出結(jié)論,當(dāng)歸補(bǔ)血湯在小鼠體內(nèi)能夠促進(jìn)網(wǎng)織紅細(xì)胞的生成,但對(duì)外周血中紅細(xì)胞的數(shù)目影響不大,這可能與外周血中成熟紅細(xì)胞的生命周期有關(guān)。集落形成單位培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)單因素方差分析結(jié)果表明各組間CFU-E和BFU-E克隆數(shù)目差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.119,P0.001；F=9.346,P0.001),LSD多重比較表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯中劑量組和高劑量組骨髓中晚期紅系祖細(xì)胞的數(shù)目與模型組相比顯著升高(P0.01),當(dāng)歸補(bǔ)血湯中劑量組和高劑量組骨髓中早期紅系祖細(xì)胞的數(shù)目與模型組相比顯著升高(P0.01)。流式結(jié)果表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯中、高劑量組骨髓中紅系相關(guān)細(xì)胞百分比與模型組相比顯著性升高(P0.01)。以上結(jié)果表明,當(dāng)歸補(bǔ)血湯可通過促進(jìn)紅系祖細(xì)胞增殖和分化來促進(jìn)紅細(xì)胞的生成。取不同組骨髓細(xì)胞體外培養(yǎng),以觀察骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生長狀態(tài)。結(jié)果表明,第三天時(shí)各組都有細(xì)胞開始貼壁生長,其中當(dāng)歸補(bǔ)血湯低、中、高劑量組和正常組較為顯著,貼壁生長細(xì)胞約鋪滿96孔板底的四分之一,而骨髓抑制模型組貼壁細(xì)胞細(xì)胞數(shù)目較少；第六天時(shí)當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組貼壁細(xì)胞已鋪板板底的二分之一；培養(yǎng)第九天當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組有明顯的成纖維細(xì)胞克隆形成。細(xì)胞周期結(jié)果表明,當(dāng)歸補(bǔ)血湯低、中和高劑量組G2M期細(xì)胞比例分別為8%、7.4%和7.6%,與模型組相比P0.05,無顯著差異。細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)歸補(bǔ)血湯中劑量和高劑量組聚集細(xì)胞的數(shù)目與模型組相比顯著著升高,具有顯著差異(P0.05)。通過以上動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果,推測當(dāng)歸補(bǔ)血湯調(diào)控紅系祖細(xì)胞分化為成熟紅細(xì)胞的途徑之一,可能是通過增加骨髓基質(zhì)細(xì)胞與紅系祖細(xì)胞之間的相互接觸,并傳遞促紅系祖細(xì)胞向成熟紅細(xì)胞分化的細(xì)胞信號(hào)來完成。骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)受到細(xì)胞接種密度和培養(yǎng)體系體積的影響。接種1×105個(gè)/孔的培養(yǎng)孔基本無骨髓基質(zhì)細(xì)胞生長,接種3×105個(gè)/孔細(xì)胞的骨髓基質(zhì)細(xì)胞貼壁約30%左右,接種5×105個(gè)/孔細(xì)胞的基質(zhì)細(xì)胞貼壁達(dá)90%左右。3×105個(gè)/孔體系組,150μL和200μL培養(yǎng)體系孔骨髓基質(zhì)細(xì)胞的貼壁數(shù)目顯著低于100μL體系孔(P0.01),而接種細(xì)胞數(shù)目為5×105個(gè)/孔時(shí),各培養(yǎng)體系組骨髓基質(zhì)細(xì)胞貼壁數(shù)目無顯著差異。當(dāng)細(xì)胞接種密度為3×105個(gè)/孔時(shí),條件培養(yǎng)基組與普通培養(yǎng)基組相比能顯著促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生長(P0.05),而細(xì)胞接種數(shù)目為5×105個(gè)/孔時(shí),條件培養(yǎng)基組細(xì)胞貼壁數(shù)目與普通培養(yǎng)基組無顯著差異。結(jié)果提示我們條件培養(yǎng)基包含有促骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外生長所必須的生長因子,因此骨髓基質(zhì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)自身會(huì)分泌胞外因子來促進(jìn)自身的生長,并且當(dāng)胞外因子的濃度達(dá)到一定濃度后促生長作用達(dá)到平臺(tái),同時(shí)提示我們可以通過利用條件培養(yǎng)基來進(jìn)行骨髓基質(zhì)細(xì)胞的體外低密度培養(yǎng)。當(dāng)歸補(bǔ)血湯在體外能夠增加骨髓基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目,在低劑量濃度時(shí)促進(jìn)效果同藥物濃度呈劑量依賴關(guān)系,隨著藥物濃度的升高細(xì)胞數(shù)目增加,但隨著藥物濃度的進(jìn)一步增加,促進(jìn)效果成下降趨勢(shì),在藥物濃度為1000μg/ml時(shí)促進(jìn)效果最為明顯。生長曲線表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯組生長曲線斜率高于對(duì)照組生長曲線的斜率。細(xì)胞周期結(jié)果表明,當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)貼壁細(xì)胞的細(xì)胞周期無影響,給藥組和對(duì)照組G1期細(xì)胞比例和S、G2M期細(xì)胞比例無顯著差異；對(duì)懸浮細(xì)胞細(xì)胞周期有影響,G1期細(xì)胞比例給藥組顯著低于對(duì)照組(P0.01),S期和G2M期細(xì)胞比例給藥組顯著高于對(duì)照組(P0.01)。給藥時(shí)間實(shí)驗(yàn)表明培養(yǎng)4天后再加入當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞無促進(jìn)作用。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示當(dāng)歸補(bǔ)血湯促骨髓基質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增加的機(jī)制是通過增加骨髓基質(zhì)細(xì)胞的體外貼壁能力,從而導(dǎo)致骨髓基質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞的種類不同,從而導(dǎo)致生長曲線斜率的不同,但對(duì)體外培養(yǎng)懸浮細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用,這可能與細(xì)胞之間的相互通訊有關(guān)。體外集落形成實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯不能直接作用于紅系造血祖細(xì)胞,需要其它細(xì)胞和造血因子的協(xié)助。鵝卵石形成實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)歸補(bǔ)血湯組克隆形成數(shù)目與對(duì)照組相比顯著升高(P0.01),通過比較兩組所形成克隆的大小,當(dāng)歸補(bǔ)血湯組顯著大于對(duì)照組。因此得出結(jié)論,體外在骨髓基質(zhì)細(xì)胞的協(xié)助下,當(dāng)歸補(bǔ)血湯能夠促進(jìn)造血祖細(xì)胞克隆形成,并且能夠使造血祖細(xì)胞的增殖分化能力加快。綜合以上分析,推測當(dāng)歸補(bǔ)血湯調(diào)控紅系祖細(xì)胞分化為成熟紅細(xì)胞的其中一種可能作用機(jī)制：當(dāng)歸補(bǔ)血湯促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞黏附分子的表達(dá),從而增加了骨髓基質(zhì)細(xì)胞與紅系祖細(xì)胞之間的直接通訊,從而傳遞紅系祖細(xì)胞增殖和分化的信號(hào)來調(diào)控其分化第三部分當(dāng)歸補(bǔ)血湯調(diào)控紅系祖細(xì)胞分化的物質(zhì)基礎(chǔ)1、不同批次當(dāng)歸補(bǔ)血湯的藥效學(xué)作用2、不同批次當(dāng)歸補(bǔ)血湯藥效作用與指紋圖譜之間的譜效關(guān)系主要結(jié)論：不同批次當(dāng)歸補(bǔ)血湯促骨髓基質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增加的能力有所不同,其中GG組當(dāng)歸補(bǔ)血湯促骨髓基質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增加的能力顯著強(qiáng)于其它組(P0.05)。通過直觀比較法和相關(guān)系數(shù)法探討當(dāng)歸補(bǔ)血湯指紋圖譜與藥效學(xué)之間的譜效關(guān)系。通過比較GG組當(dāng)歸補(bǔ)血湯指紋圖譜與其它組指紋圖譜的差異,尋找在GG組峰面積最高的特征峰作為當(dāng)歸補(bǔ)血湯潛在的物質(zhì)基礎(chǔ)。又進(jìn)一步通過統(tǒng)計(jì)軟件分析了各色譜峰峰面積與藥效之間的相關(guān)性,以尋找當(dāng)歸補(bǔ)血湯發(fā)揮藥效的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)。通過分析發(fā)現(xiàn),當(dāng)歸補(bǔ)血湯潛在的物質(zhì)基礎(chǔ)主要存在于親水區(qū)。
【關(guān)鍵詞】：當(dāng)歸補(bǔ)血湯 紅系祖細(xì)胞 質(zhì)量控制 譜效關(guān)系 骨髓基質(zhì)細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R285
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-20
• 第一章 緒論20-23
• 第二章 當(dāng)歸補(bǔ)血湯質(zhì)控方法建立23-53
• 1、前言23-25
• 2、材料與方法25-29
• 3、結(jié)果與分析29-48
• 3.1 色譜條件優(yōu)化29-34
• 3.2 色譜條件方法學(xué)驗(yàn)證34-43
• 3.3 阿魏酸、芒柄花素含量測定43-46
• 3.4 不同產(chǎn)地指紋圖譜分析46-48
• 4、討論48-53
• 4.1 樣品溶解條件的選擇49
• 4.2 色譜柱的選擇49-50
• 4.3 流動(dòng)相的選擇50-51
• 4.4 梯度優(yōu)化51
• 4.5 方法學(xué)驗(yàn)證51-52
• 4.6 阿魏酸和芒柄花素含量分析52
• 4.7 共有峰和對(duì)照?qǐng)D譜建立52-53
• 第三章 當(dāng)歸補(bǔ)血湯調(diào)控紅系祖細(xì)胞分化機(jī)制53-90
• 1、前言53-55
• 2、材料與方法55-61
• 3、結(jié)果與分析61-84
• 3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)61-72
• 3.2 細(xì)胞評(píng)價(jià)模型建立72-76
• 3.3 當(dāng)歸補(bǔ)血湯體外促骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖能力研究76-82
• 3.4 當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)紅系祖細(xì)胞直接作用82-83
• 3.5 當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)紅系祖細(xì)胞間接作用83-84
• 4、討論84-90
• 第四章 當(dāng)歸補(bǔ)血湯調(diào)控紅系祖細(xì)胞分化的物質(zhì)基礎(chǔ)90-98
• 1、前言90-91
• 2、材料與方法91-92
• 3、結(jié)果與分析92-95
• 3.1 不同產(chǎn)地當(dāng)歸補(bǔ)血湯促骨髓基質(zhì)細(xì)胞貼壁能力92-93
• 3.2 當(dāng)歸補(bǔ)血湯指紋圖譜與其藥效作用之間的譜效關(guān)系93-95
• 4、討論95-96
• 5、展望96-98
• 參考文獻(xiàn)98-107
• 附錄107-108
• 博士研究生期間發(fā)表論文情況108-109
• 致謝109-112
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)審稿證明112

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本文編號(hào)：583884