本文關(guān)鍵詞：NEDD8介導(dǎo)的neddylation修飾在人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖和蛻膜化中的作用研究

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【摘要】：[研究背景]人的子宮內(nèi)膜是一個(gè)激素響應(yīng)的組織,這個(gè)組織在循環(huán)的月經(jīng)周期中有序地增殖、分化、脫落和修復(fù)。在每一個(gè)月經(jīng)周期中,這個(gè)動(dòng)態(tài)的組織重塑為著床提供一個(gè)很短的容受期,這個(gè)時(shí)期被稱為“著床窗”。子宮內(nèi)膜的一個(gè)重要功能是允許胚胎粘附、浸潤(rùn)、誘導(dǎo)基質(zhì)進(jìn)入蛻膜化。如果著床失敗,內(nèi)膜將會(huì)退化,并隨著月經(jīng)周期而重塑和修復(fù),為下一次的著床窗做準(zhǔn)備。當(dāng)囊胚植入著床點(diǎn)后,著床囊胚陷入子宮內(nèi)膜的基質(zhì)床里,然后經(jīng)過(guò)大量分化,血管重塑和免疫細(xì)胞的募集,這個(gè)過(guò)程叫做蛻膜化,是成功著床非常重要的過(guò)程。蛻膜組織產(chǎn)生大量分泌因子,在胎盤形成前為發(fā)育中的胚胎提供營(yíng)養(yǎng)并且為胚胎提供了一個(gè)免疫耐受的環(huán)境。很多研究都證實(shí)子宮基質(zhì)增殖和分化的異常與臨床上的反復(fù)流產(chǎn)、先兆子癇、宮內(nèi)生長(zhǎng)受限和不明原因性不孕密切相關(guān)。盡管有很多信號(hào)分子被證實(shí)參與調(diào)節(jié)內(nèi)膜重塑和和著床的變化過(guò)程,但是在月經(jīng)周期和妊娠早期調(diào)節(jié)正常內(nèi)膜功能的分子機(jī)制仍然有待進(jìn)一步研究。泛素化是泛素介導(dǎo)的降解蛋白的過(guò)程,但目前越來(lái)越多的研究表明泛素化還有介導(dǎo)非蛋白降解的功能,包括DNA損傷修復(fù)、信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、胞吞作用和蛋白激酶活化等。也有更多的證據(jù)表明泛素化和許多組織器官的發(fā)育和疾病有關(guān)。在這方面,以前的研究提示泛素和泛素相關(guān)的蛋白在內(nèi)膜的轉(zhuǎn)換和胎盤的發(fā)育中很可能有重要的作用。例如非孕期的內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的泛素含量很低,但是早孕的時(shí)候蛻膜基質(zhì)的胞核和胞漿的泛素水平明顯升高。還有研究證明,體外培養(yǎng)的人子宮蛻膜細(xì)胞可以分泌泛素。雖然已有很多證據(jù)證明泛素和泛素相關(guān)蛋白介導(dǎo)的泛素化與早孕期子宮內(nèi)膜的功能密切相關(guān),但是具體的調(diào)節(jié)機(jī)制依然未闡明。NEDD8 (neural precursor cell-expressed developmentally downregulated 8)是一個(gè)76氨基酸的多肽,它可以連接目的蛋白進(jìn)行類泛素化的修飾,最初的報(bào)道是在小鼠胚胎的腦組織中高度富集。在許多類泛素的蛋白中,NEDD8與泛素最類似,并且可以通過(guò)一個(gè)活性的neddylation的過(guò)程,這個(gè)過(guò)程和泛素化非常類似。NEDD8特異性地與底物蛋白相結(jié)合的修飾過(guò)程被稱為neddylation,這個(gè)過(guò)程需要的一系列的酶催化級(jí)聯(lián)反應(yīng),參與的酶和泛素系統(tǒng)的很類似。這些酶包括NEDD8活化酶E1,它是由APPBP1和UBA3形成的異源二聚體,還有NEDD8結(jié)合酶E2 (Ubc12)和可特異性選擇底物的NEDD3連接酶E3。與經(jīng)典的泛素化過(guò)程類似,neddylation的過(guò)程也包括連接、激活和與底物結(jié)合的有序過(guò)程。但是將NEDD8結(jié)合到底物蛋白的neddylation不是為了蛋白降解,而是改變蛋白的修飾以改變其活性和功能。neddylation過(guò)程最著名的底物蛋白是高度保守的cullin家族, cullin蛋白可以組成泛素E3連接酶的骨架結(jié)構(gòu),Cullin是SCF (SKP1-Cullins-F-box proteins)復(fù)合體或SCF類E3連接酶CRL(Cullin-RING ubiquitin ligases)的重要組成分子。這些泛素連接酶的聚合需要cullin neddylation的激活。所以通過(guò)調(diào)節(jié)CRLs, neddylation可以調(diào)節(jié)許多生理過(guò)程,包括胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生中的細(xì)胞周期和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程。Cullins證實(shí)在孕早期母胎界面有表達(dá),所以我們對(duì)于進(jìn)一步研究NEDD8介導(dǎo)的neddylation在子宮內(nèi)膜的增殖和分化中的生理功能有極大的興趣。在本研究中,我們觀察到NEDD8在子宮內(nèi)膜中隨著月經(jīng)周期廣泛而持久第表達(dá),并且通過(guò)使用人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞系(T-HESC)和特異性的NEDD8激活酶抑制劑MLN4924,進(jìn)一步揭示了抑制neddylation可以導(dǎo)致增殖和分化的異常的機(jī)制,這些結(jié)果都為NEDD8介導(dǎo)neddylation對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)的增殖和分化的必要性提供了新的依據(jù)。[研究目的]我們通過(guò)研究NEDD8在人子宮內(nèi)膜和人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(HESC)中的表達(dá)和相關(guān)作用,探討NEDD8介導(dǎo)的neddylation在子宮內(nèi)膜基質(zhì)的增殖和蛻膜化中的作用,為進(jìn)一步研究NEDD8在圍著床期子宮內(nèi)膜容受性中的作用提供一定的理論依據(jù)。[材料和方法]1、研究對(duì)象收集從2013年1月到2013年5月間就診于南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心的患者共53例�；颊咴陆�(jīng)周期規(guī)律,有排卵,無(wú)其它生殖系統(tǒng)疾病。收集從增殖早期到分泌晚期的人子宮內(nèi)膜組織,分別為增殖早期(10例)、增殖晚期(13例)、分泌早期(10例)、分泌中期(10例)和分泌晚期(10例)。3例增殖晚期內(nèi)膜組織用于提取原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞,剩余50例組織用于提取RNA和免疫組織化學(xué)染色觀察NEDD8在人子宮內(nèi)膜月經(jīng)周期的不同時(shí)期的表達(dá)模式。用永生化的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞系(T-HESC)分別在增殖和MPA/cAMP誘導(dǎo)的分化狀態(tài)下觀察NEDD8的表達(dá)和相關(guān)作用研究。2、研究方法用NEDD8激活酶特異性抑制劑MLN4924抑制neddylation,分別觀察HESC增殖和分化的異常。首先用MTS和Ki67檢測(cè)細(xì)胞增殖,用流式細(xì)胞術(shù)分選細(xì)胞周期,然后用BrdUpH3分別標(biāo)記細(xì)胞周期的S期和G2/M期。用F-actin首先檢測(cè)分化狀態(tài)下細(xì)胞微絲骨架結(jié)構(gòu),然后在HESC中抑制neddylation后檢測(cè)分化的標(biāo)志分子PRL、IGFBP1和STAT3的mRNA水平。在明確抑制neddylation會(huì)影響HESC的蛻膜化后,我們用蛋白免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)p21的異常積聚�？紤]p21是衰老相關(guān)的分子,我們用SA-β-Gal染色標(biāo)記細(xì)胞衰老的數(shù)目。最后用p21的特異性siRNA降低異常升高的p21水平,看是否能挽救增殖和分化的異常以進(jìn)一步研究機(jī)制。3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)均以x±s表示,應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。多因素資料采用析因設(shè)計(jì)方差分析(two-way ANOVA)。兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組均數(shù)方差齊性,采用單因素方差分析(one-way ANOVA)及LSD兩兩比較；多組均數(shù)方差不齊,采用Welch近似方差分析及Dunnett's T3兩兩比較。統(tǒng)計(jì)分析中,檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為α=0.05。P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)除特殊說(shuō)明外至少重復(fù)3次。[結(jié)果]1. NEDD8在子宮內(nèi)膜的基質(zhì)和上皮中廣泛表達(dá),從增殖早期到分泌晚期的腔上皮、腺上皮和基質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)。這種強(qiáng)烈而持久的表達(dá)和核定位的表達(dá)模式提示NEDD8介導(dǎo)的neddylation在子宮內(nèi)膜的增殖和分化中可能有重要作用,很有可能參與其動(dòng)態(tài)的調(diào)節(jié)過(guò)程。2. NEDD8在永生化的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞系(T-HESC)中的增殖期和分泌期均有表達(dá),而且與免疫組化染色結(jié)果一樣都呈核定位,提示NEDD8在內(nèi)膜基質(zhì)中發(fā)揮一定的作用,并且用這個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行基質(zhì)相關(guān)的下一步研究是可行的。3. NEDD8激活酶特異性抑制劑MLN4924可以有效抑制cullin neddylation,并且導(dǎo)致人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖的異常。細(xì)胞周期的異常是造成增殖異常的一部分原因,在異常的細(xì)胞周期中,抑制neddylation表現(xiàn)為細(xì)胞進(jìn)入S期減少和減緩,并且不進(jìn)入G2/M期。提示MLN4924抑制neddylation是通過(guò)影響細(xì)胞周期部分影響HESC的增殖。4. MLN4924抑制neddylation還可以導(dǎo)致人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞分化的異常。表現(xiàn)為細(xì)胞微絲骨架的異常,并且使細(xì)胞無(wú)法進(jìn)入蛻膜化。5. MLN4924抑制neddylation導(dǎo)致p21水平的異常積聚,由于p21是誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的分子,所以我們進(jìn)一步檢測(cè)了細(xì)胞衰老,結(jié)果提示增殖和分化狀態(tài)的HESC中p21增加會(huì)使細(xì)胞衰老增加,這個(gè)結(jié)果提示p21的升高可能影響細(xì)胞活性從而導(dǎo)致細(xì)胞衰老的增加。同時(shí)p21是細(xì)胞周期中抑制G1期向S期和S期向G2/M期進(jìn)行的分子,所以異常升高的p21可能通過(guò)抑制細(xì)胞周期影響細(xì)胞的增殖。6.在人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞系(HESC)中用MLN4924抑制neddylation不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,與時(shí)間和劑量均不相關(guān),說(shuō)明細(xì)胞增殖的異常不是由于細(xì)胞凋亡造成的。7.用p21特異性siRNA降低異常升高的p21的水平可以部分挽救增殖的異常和細(xì)胞衰老的增加,但是不能挽救分化的異常。說(shuō)明增殖的異常部分是由于p21的升高引起的(細(xì)胞周期的阻滯和細(xì)胞衰老的增加),但是分化的異常有其他機(jī)制,有待我們進(jìn)一步研究。[結(jié)論]1. NEDD8在人子宮內(nèi)膜基質(zhì)中隨著月經(jīng)周期穩(wěn)定而持久地表達(dá)。2. NEDD8在永生化的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞系(T-HESC)中增殖期和分化期均有表達(dá)。3. MLN4924抑制neddylation可以導(dǎo)致人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖的異常。細(xì)胞周期的異常的部分原因,表現(xiàn)為進(jìn)入S期減少和減緩,并且不進(jìn)入G2/M期。4. MLN4924抑制neddylation可以導(dǎo)致人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞分化的異常,表現(xiàn)為細(xì)胞微絲骨架的異常和細(xì)胞無(wú)法進(jìn)入蛻膜化。5. MLN4924抑制neddylation導(dǎo)致p21水平的異常積聚,同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的增加。6.在人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞系(HESC)中抑制neddylation不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。7.降低異常升高的p21水平可以部分挽救增殖的異常和細(xì)胞衰老的增加,但是無(wú)法挽救分化的異常。
【關(guān)鍵詞】：NEDD8 MLN4924 人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(HESCs) 蛻膜化
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R714
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 前言19-20
• 材料與方法20-40
• 1. 主要儀器20-21
• 2. 主要試劑及配制方法21-26
• 3. 組織的收集和取材26-27
• 3.1 患者基本情況26
• 3.2 組織取材26-27
• 4. 免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry)27-28
• 5. 人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(HESC)的培養(yǎng)、傳代、轉(zhuǎn)染、凍存和復(fù)蘇28-31
• 5.1 永生化人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(T-HESCs)的培養(yǎng)28-29
• 5.2 原代HESC的分離和培養(yǎng)29
• 5.3 細(xì)胞傳代29-30
• 5.4 siRNA轉(zhuǎn)染HESC30
• 5.5 細(xì)胞凍存30-31
• 5.6 細(xì)胞復(fù)蘇31
• 6. 細(xì)胞增殖檢測(cè)(MTS)31-32
• 7. 總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)32-34
• 7.1 Trizol試劑抽提法提取總RNA32-33
• 7.2 RNA逆轉(zhuǎn)錄33
• 7.3 Quantitative Real-time PCR反應(yīng)33-34
• 8. 細(xì)胞免疫熒光(Immunofluorescence)34-35
• 9. 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blotting)35-37
• 9.1 蛋白的提取35
• 9.2 蛋白濃度的測(cè)定35-36
• 9.3 實(shí)驗(yàn)步驟36-37
• 10. 流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry)37-38
• 11. 細(xì)胞衰老-β-半乳糖苷酶染色(SA-β-gal染色)38-39
• 12. 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析(Statistical analysis)39-40
• 結(jié)果與分析40-80
• 1、NEDD8在人月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜的表達(dá)模式40-44
• 2、NEDD8在人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(HESC)中的表達(dá)44-48
• 2.1 HESC細(xì)胞蛻膜化體系的建立44-46
• 2.2 NEDD8在增殖和分化HESC中的表達(dá)46-48
• 3、MLN4924特異性抑制HESC中NEDD8介導(dǎo)的neddylation修飾48-51
• 3.1 MLN4924在T-HESCs中的運(yùn)用48-50
• 3.2 MLN4924在原代HESC中的運(yùn)用50-51
• 4、MLN4924導(dǎo)致HESC細(xì)胞增殖的異常51-55
• 5、MLN4924導(dǎo)致HESC細(xì)胞周期的異常55-59
• 6、MLN4924導(dǎo)致HESC蛻膜化的異常59-65
• 7、抑制HESC中neddylation導(dǎo)致p21的積聚和細(xì)胞衰老的增加65-70
• 8、MLN4924不誘導(dǎo)HESC細(xì)胞的凋亡70-71
• 9、p21敲降可以部分挽救MLN4924導(dǎo)致的增殖異常和細(xì)胞衰老的增加71-80
• 9.1 p21-siRNA在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中的運(yùn)用71-74
• 9.2 p21敲降可以部分挽救增殖的異常和細(xì)胞衰老的增加74-78
• 9.3 p21敲降不能挽救分化的異常78-80
• 討論80-84
• 結(jié)論84-85
• 參考文獻(xiàn)85-91
• 綜述91-116
• 參考文獻(xiàn)104-116
• 中英文縮略詞表116-117
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文117-118
• 致謝118-121
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)證明121

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本文編號(hào)：575392