本文關(guān)鍵詞：SOCE對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞功能影響的研究

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【摘要】：研究背景及目的目前認(rèn)為,血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)發(fā)生的初始環(huán)節(jié)。多種AS危險(xiǎn)因素如高脂血癥、吸煙、糖尿病、高血壓等均可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷而促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展。因此,促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的修復(fù)是預(yù)防AS發(fā)生的關(guān)鍵。內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial Progenitor Cell,EPC)具有成血管能力和向內(nèi)皮細(xì)胞分化能力,一度被認(rèn)為是血管內(nèi)皮損傷修復(fù)的種子細(xì)胞。但是既往研究發(fā)現(xiàn),AS發(fā)展過(guò)程中常伴隨EPC功能異常,導(dǎo)致EPC對(duì)血管內(nèi)皮損傷進(jìn)行修復(fù)的能力降低,從而導(dǎo)致AS的發(fā)生、發(fā)展。因此,如何減緩或逆轉(zhuǎn)EPC功能異常很可能是預(yù)防AS進(jìn)展的關(guān)鍵,但由于目前仍未闡明AS發(fā)展過(guò)程中EPC功能異常的相關(guān)機(jī)制,極大地妨礙了以EPC為靶點(diǎn)治療AS的進(jìn)程。鈣庫(kù)操縱性鈣內(nèi)流(Store operated Ca2+entry,SOCE)是哺乳動(dòng)物非興奮細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的普遍機(jī)制,主要由鈣庫(kù)操縱性通道(Store operated channels,SOC)復(fù)合體介導(dǎo),并與細(xì)胞的眾多生理功能密切相關(guān)。既往其他學(xué)者以及本實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)現(xiàn),EPC上表達(dá)SOC復(fù)合體蛋白分子,沉默此類(lèi)蛋白表達(dá)不僅影響SOCE,還影響EPC的增殖、遷移功能,這些結(jié)果提示SOCE是調(diào)節(jié)EPC功能的重要方式。另外,鑒于SOCE對(duì)細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的廣泛性,SOCE的變化可能會(huì)引起EPC諸多生理功能改變,反之,SOCE也可能是多種致病因素作用的共同的靶點(diǎn)。這就提示我們,在A(yíng)S發(fā)展過(guò)程中,諸多不利因素均可能作用于SOCE,從而引起EPC功能異常。但是在A(yíng)S的進(jìn)程中,是否會(huì)通過(guò)影響SOCE從而引起EPC功能異常至今仍不清楚�；谝陨显�,本研究利用AS小鼠模型以及體外應(yīng)用AS危險(xiǎn)因素-氧化型低密度脂蛋白(oxide low density lipoprotein,ox-LDL),以SOCE為切入點(diǎn)研究AS進(jìn)程中EPC功能異常的作用機(jī)制。方法1.AS小鼠EPC增殖、遷移功能及SOCE的改變1.1 AS小鼠模型建立以及EPC的培養(yǎng)、鑒定Apo E-/-小鼠分別給予普通飲食及高脂飲食喂養(yǎng),高脂飲食以普通顆粒飼料添加0.15%膽固醇和20%脂肪。高脂飲食組小鼠分別于喂養(yǎng)后12周和16周處死,取主動(dòng)脈行油紅O染色以評(píng)價(jià)AS進(jìn)展。取小鼠骨髓,經(jīng)密度梯度離心法獲得骨髓單個(gè)核細(xì)胞,接種于包被了人纖連蛋白的培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中,以?xún)?nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及細(xì)胞特征。除了以Di I-Ac-LDL和FITC-UEA-I熒光雙染法鑒定EPC外,通過(guò)免疫熒光檢測(cè)EPC表面分子標(biāo)記物CD34、CD133和VEGFR2的表達(dá)。1.2 AS小鼠EPC增殖和遷移功能的改變各組小鼠EPC培養(yǎng)5天后,以直接鏡下計(jì)數(shù)和CCK-8檢測(cè)分析EPC增殖功能,以Transwell方法觀(guān)察EPC遷移功能。1.3 AS小鼠EPC的SOCE的改變1.3.1 AS小鼠EPC的SOCE振幅和波形改變?nèi)∨囵B(yǎng)7天的EPC,孵育鈣離子探針Fluo-3后,在激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察毒胡蘿卜素(thapsigargin,TG)激活的SOCE,統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析SOCE的振幅及波形改變。1.3.2 AS小鼠EPC的鈣振蕩改變?nèi)∨囵B(yǎng)7天的EPC,孵育鈣離子探針Fluo-3后,在激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察EPC自發(fā)鈣振蕩以及VEGF激發(fā)的鈣振蕩的變化。1.3.3 AS小鼠EPC的SOC分子表達(dá)改變提取EPC總RNA,以RT-PCR觀(guān)察SOC構(gòu)成分子的基因在EPC的轉(zhuǎn)錄,以實(shí)時(shí)定量PCR分析SOC關(guān)鍵構(gòu)成分子基因轉(zhuǎn)錄水平的差異。提取細(xì)胞總蛋白,以Western blot分析SOC關(guān)鍵構(gòu)成分子蛋白表達(dá)水平的差異。1.4 AS小鼠EPC的e NOS的表達(dá)和磷酸化改變以Western blot分析各組EPC的e NOS蛋白(Ser1177)磷酸化水平和表達(dá)水平的改變。2.ox-LDL對(duì)EPC增殖、遷移功能及SOCE的影響2.1 ox-LDL對(duì)EPC增殖、遷移功能的影響分離培養(yǎng)小鼠EPC并給予ox-LDL處理。以直接鏡下計(jì)數(shù)和CCK-8檢測(cè)分析EPC增殖功能,以Transwell方法觀(guān)察EPC遷移功能。并以基質(zhì)膠培養(yǎng)法觀(guān)察EPC體外成管型生長(zhǎng)能力。2.2 ox-LDL對(duì)EPC的SOCE的影響2.2.1 ox-LDL對(duì)EPC的SOCE振幅和波形的影響培養(yǎng)的EPC給予ox-LDL處理,孵育鈣離子探針Fluo-3后,在激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察ATP激活的SOCE,統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析SOCE的振幅及波形改變。2.2.2 ox-LDL對(duì)EPC的SOC分子表達(dá)的影響培養(yǎng)細(xì)胞給予ox-LDL處理后,提取細(xì)胞總蛋白,以Western blot分析SOC關(guān)鍵構(gòu)成分子蛋白表達(dá)水平的差異。2.2.3 ox-LDL對(duì)STIM1蛋白磷酸化的影響培養(yǎng)細(xì)胞并給予ox-LDL處理,給予ATP刺激,于刺激后不同時(shí)相點(diǎn)提取細(xì)胞總蛋白,免疫沉淀富集STIM1蛋白后,以Western blot分析STIM1蛋白絲氨酸磷酸化水平。3.SOCE與EPC增殖、遷移功能的關(guān)系3.1抑制SOCE對(duì)EPC增殖、遷移功能的影響培養(yǎng)的EPC分別給予SOCE抑制劑和干擾STIM1基因轉(zhuǎn)錄處理,激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察上述策略對(duì)SOCE的影響,并以直接鏡下計(jì)數(shù)和CCK-8檢測(cè)分析EPC增殖功能,以Transwell方法觀(guān)察EPC遷移功能。3.2抑制SOCE對(duì)EPC的e NOS的表達(dá)和磷酸化影響培養(yǎng)的EPC分別給予SOCE抑制劑干擾STIM1基因轉(zhuǎn)錄處理后,以Western blot分析各組EPC的e NOS蛋白(Ser1177)磷酸化水平和表達(dá)水平的改變。結(jié)果1.1.AS小鼠EPC增殖、遷移功能及SOCE的改變1.1 AS小鼠模型建立以及EPC的培養(yǎng)、鑒定成功建立AS小鼠模型,表現(xiàn)為高脂喂養(yǎng)組小鼠主動(dòng)脈脂質(zhì)斑塊顯著增加。成功培養(yǎng)小鼠骨髓源性EPC。骨髓單個(gè)核細(xì)胞接種于條件培養(yǎng)基后,部分細(xì)胞逐漸貼壁生長(zhǎng)并逐漸變?yōu)椴灰?guī)則形、梭形、紡錘形等,部分細(xì)胞呈現(xiàn)典型的克隆性及線(xiàn)性生長(zhǎng)特性。熒光雙染顯示培養(yǎng)的細(xì)胞大部分同時(shí)表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物(UEA)并具有結(jié)合LDL的能力。免疫熒光檢測(cè)顯示大部分細(xì)胞為CD34、CD133、VEGFR2陽(yáng)性細(xì)胞。1.2 AS小鼠EPC增殖和遷移功能的改變隨AS進(jìn)展,EPC的數(shù)量顯著降低,于高脂飲食喂養(yǎng)后12周及16周分別下降21.5%和45%(p0.05),CCK-8檢測(cè)顯示EPC的增殖活性分別降低28.2%和56%(p0.05),Transwell檢測(cè)顯示成功遷移的EPC數(shù)量分別降低34.4%和43.8%(p0.05)。1.3 AS小鼠EPC的SOCE的改變1.3.1 AS小鼠EPC的SOCE振幅和波形改變TG成功誘發(fā)EPC的SOCE。隨AS進(jìn)展,EPC的SOCE的振幅逐漸降低,高脂喂養(yǎng)后12周及16周分別降低65.2%和67.3%(p0.05)。另外,鈣釋放的振幅也有所降低。對(duì)SOCE的波形分析發(fā)現(xiàn),隨AS的進(jìn)展,EPC的SOCE的升支、降支斜率都顯著下降,其中升支斜率于高脂喂養(yǎng)后12周及16周分別降低65.1%和72.1%(p0.05),降支斜率于高脂喂養(yǎng)12周小鼠的EPC降低了70%(p0.05),而在16周小鼠的EPC只降低了32.6%,差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1.3.2 AS小鼠EPC的鈣振蕩改變?cè)谟^(guān)察到AS小鼠EPC的SOCE改變后,考慮到SOCE是細(xì)胞鈣振蕩的關(guān)鍵組分,并且鈣振蕩參與調(diào)節(jié)細(xì)胞諸多生理功能。我們隨后觀(guān)察了AS對(duì)EPC的鈣振蕩的影響。結(jié)果顯示隨AS的進(jìn)展,EPC自發(fā)的鈣振蕩以及VEGF誘導(dǎo)的鈣振蕩的振幅和頻率均顯著降低(p0.05)。1.3.3 AS小鼠EPC的SOC分子表達(dá)改變?yōu)榱颂接懸餝OCE改變的原因,我們觀(guān)察了介導(dǎo)SOCE的SOC復(fù)合體分子的改變。首先以RT-PCR證實(shí)EPC上有SOC分子基因的轉(zhuǎn)錄,包括STIM1-2,Orai1-3,TRPC1和TRPC6。隨后,我們重點(diǎn)觀(guān)察了介導(dǎo)SOC復(fù)合體關(guān)鍵分子STIM1、Orai1和TRPC1在RNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平的變化,結(jié)果顯示,隨AS進(jìn)展,上述分子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)均顯著下降(p0.05)。1.4 AS小鼠EPC的e NOS的表達(dá)和磷酸化改變前述結(jié)果證實(shí),隨AS進(jìn)展,EPC增殖和遷移功能均顯著受損,鑒于e NOS對(duì)調(diào)節(jié)EPC增殖和遷移功能的關(guān)鍵作用,我們隨后又觀(guān)察了AS進(jìn)程中e NOS的表達(dá)和磷酸化變化。結(jié)果顯示,VEGF誘導(dǎo)的e NOS(Ser1177)磷酸化水平隨AS進(jìn)展而顯著降低(p0.05),此外,e NOS的蛋白表達(dá)水平也隨AS發(fā)展而降低(p0.05)。2.ox-LDL對(duì)EPC增殖、遷移功能及SOCE的影響ox-LDL是目前已知的最關(guān)鍵的AS致病因素,因此,我們體外應(yīng)用ox-LDL,進(jìn)一步驗(yàn)證AS進(jìn)展對(duì)EPC功能及SOCE的影響。2.1 ox-LDL對(duì)EPC增殖、遷移功能的影響體外給予ox-LDL處理72h后,EPC的數(shù)量以及增殖活性呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性降低,其中100μg/ml的ox-LDL對(duì)細(xì)胞的影響最顯著(p0.05)。低劑量的ox-LDL(25μg/ml)即可明顯降低EPC的遷移功能(p0.05),并隨劑量增加,效應(yīng)越顯著。另外,我們還觀(guān)察了ox-LDL對(duì)EPC體外成管型生長(zhǎng)的影響。結(jié)果顯示,低劑量的ox-LDL對(duì)此影響不明顯,但較高劑量的ox-LDL對(duì)此影響較為明顯。2.2 ox-LDL對(duì)EPC的SOCE的影響2.2.1 ox-LDL對(duì)EPC的SOCE振幅和波形的影響培養(yǎng)的EPC給予ox-LDL處理24h后,SOCE的振幅顯示降低趨勢(shì),但與對(duì)照組差異不明顯。而ox-LDL處理72h后,SOCE的振幅顯著低于對(duì)照組(p0.05)。分析SOCE的波形發(fā)現(xiàn),ox-LDL處理24h后,SOCE的升支、降支斜率即顯著下降(p0.05),于處理72h后更加明顯。2.2.2 ox-LDL對(duì)EPC的SOC分子表達(dá)的影響隨后我們觀(guān)察了SOC關(guān)鍵分子蛋白水平表達(dá)的變化,結(jié)果顯示,ox-LDL處理72h后,STIM1、Orai1和TRPC1蛋白表達(dá)雖然有降低趨勢(shì),但差異不明顯。2.2.3 ox-LDL對(duì)STIM1蛋白磷酸化的影響鑒于SOC分子蛋白表達(dá)變化不足以充分解釋SOCE改變的原因,我們又進(jìn)一步觀(guān)察了STIM1蛋白磷酸化的變化。結(jié)果顯示,ox-LDL處理24h后,STIM1的磷酸化水平顯著低于對(duì)照組(p0.05),此效應(yīng)于處理72h后更加明顯。3.SOCE與EPC增殖、遷移功能的關(guān)系3.1抑制SOCE對(duì)EPC增殖、遷移功能的影響SOCE抑制劑2-APB和ML-9顯著抑制SOCE振幅,分別降低65.1%和34.7%(p0.05)。2-APB處理72h后,EPC的數(shù)量、增殖活性及遷移數(shù)量較對(duì)照組分別降低52.0%、49.7%和54.5%(p0.05),ML-9處理后分別降低48.4%、57.0%和49.7%(p0.05)。此外,干擾STIM1基因轉(zhuǎn)錄也顯著抑制SOCE振幅,較對(duì)照組下降72.1%(p0.05),并且顯著影響EPC的功能,對(duì)EPC的數(shù)量、增殖活性及遷移數(shù)量較對(duì)照組分別降低59.4%、64.0%和66.4%(p0.05)。3.2抑制SOCE對(duì)EPC的e NOS的表達(dá)和磷酸化影響2-APB和干擾STIM1基因轉(zhuǎn)錄處理使e NOS的表達(dá)分別下降41.3%和52.7%(p0.05),此外,干擾STIM1基因轉(zhuǎn)錄后,e NOS的磷酸化水平也顯著降低(p0.05)。結(jié)論1.在A(yíng)S的發(fā)展過(guò)程中,EPC的增殖、遷移功能受到抑制2.在A(yíng)S的發(fā)展過(guò)程中,EPC的SOCE受到顯著抑制3.在A(yíng)S的發(fā)展過(guò)程中,EPC的鈣振蕩和e NOS的表達(dá)及磷酸化降低4.體外給予ox-LDL處理也顯著抑制EPC增殖、遷移功能以及SOCE5.SOCE與EPC增殖、遷移功能及e NOS的表達(dá)和磷酸化相關(guān)6.在A(yíng)S小鼠以及體外給予ox-LDL都證實(shí),在A(yíng)S的發(fā)展過(guò)程中,EPC的增殖和遷移功能受到抑制。其作用機(jī)制可能是通過(guò)改變SOCE,進(jìn)而影響鈣振蕩和e NOS的表達(dá)和磷酸化而實(shí)現(xiàn)。這提示SOCE有望成為治療EPC功能異常的新靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：鈣庫(kù)操縱性鈣內(nèi)流 內(nèi)皮祖細(xì)胞 動(dòng)脈粥樣硬化 鈣振蕩 內(nèi)皮型一氧化氮合酶
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R543.5
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-5
• 英文摘要5-12
• 中文摘要12-18
• 第一章 前言18-21
• 第二章 AS小鼠EPC增殖、遷移功能及SOCE的改變21-55
• 2.1 材料與方法22-37
• 2.2 結(jié)果37-51
• 2.3 討論51-54
• 2.4 小結(jié)54-55
• 第三章 ox-LDL對(duì)EPC增殖、遷移功能及SOCE的影響55-73
• 3.1 材料與方法55-64
• 3.2 結(jié)果64-71
• 3.3 討論71-72
• 3.4 小結(jié)72-73
• 第四章 SOCE與EPC增殖、遷移功能的關(guān)系73-92
• 4.1 材料與方法73-84
• 4.2 結(jié)果84-89
• 4.3 討論89-91
• 4.4 小結(jié)91-92
• 全文總結(jié)92-93
• 參考文獻(xiàn)93-102
• 文獻(xiàn)綜述一 動(dòng)脈粥樣硬化與內(nèi)皮祖細(xì)胞功能異常的關(guān)系102-116
• 參考文獻(xiàn)108-116
• 文獻(xiàn)綜述二 鈣庫(kù)操縱性鈣內(nèi)流的研究進(jìn)展116-132
• 參考文獻(xiàn)122-132
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果132-133
• 致謝133

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