本文關(guān)鍵詞：ERCC1表達(dá)和p53突變狀態(tài)聯(lián)合預(yù)測(cè)HDACi增敏非小細(xì)胞肺癌中順鉑療效

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【摘要】：第一章非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株對(duì)順鉑及順鉑和Panobinostat聯(lián)合用藥的敏感性目的：在8個(gè)NSCLC細(xì)胞株中,檢測(cè)各個(gè)細(xì)胞株對(duì)順鉑以及順鉑和Panobinostat聯(lián)合用藥的敏感性。方法：在8個(gè)NSCLC細(xì)胞株中,首先通過qPCR和Western檢測(cè)ERCC1在各細(xì)胞株中的表達(dá)水平,然后分別用順鉑和順鉑聯(lián)合組蛋白去乙�；敢种苿�(Panobinostat)處理,通過對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的測(cè)量觀察不同細(xì)胞株對(duì)順鉑以及聯(lián)合用藥的敏感性。結(jié)果：在8個(gè)NSCLC細(xì)胞株中,我們檢測(cè)到在細(xì)胞株A549, HCC827, NCI-H23, NCI-H441和NCI-H1975中,ERCC1勻?yàn)榈捅磉_(dá)；而在另外三個(gè)細(xì)胞株NCI-H1299, NCI-H2172和PC-14中,ERCC1為高表達(dá)。8個(gè)細(xì)胞株中,除了A549以外的7個(gè)細(xì)胞株均對(duì)順鉑耐藥,與ERCC1的表達(dá)水平?jīng)]有顯著的相關(guān)性；而當(dāng)順鉑和組蛋白去乙�；敢种苿㏄anobinostat和順鉑聯(lián)用時(shí),5個(gè)ERCC1低表達(dá)的細(xì)胞株中,4個(gè)細(xì)胞株均對(duì)聯(lián)合用藥敏感性顯著增高,而3個(gè)ERCC1高表達(dá)細(xì)胞株對(duì)聯(lián)合用藥仍表現(xiàn)為不敏感。結(jié)論：ERCC1的表達(dá)水平對(duì)于NSCLC細(xì)胞株對(duì)順鉑單藥的敏感性的預(yù)測(cè)并不明顯；Panobinostat可以增加ERCC1低表達(dá)NSCLC細(xì)胞株對(duì)順鉑的敏感性。第二章ERCC1表達(dá)水平和p53狀態(tài)對(duì)順鉑和Panobinostat聯(lián)合用藥療效的預(yù)測(cè)作用目的：研究NSCLC細(xì)胞株中ERCC1表達(dá)水平和p53狀態(tài)對(duì)順鉑和Panobinostat聯(lián)合用藥的預(yù)測(cè)性。方法：在ERCC1高表達(dá)的細(xì)胞株中進(jìn)行ERCC1的敲低(Knockdown, KD)實(shí)驗(yàn),同時(shí)選取2個(gè)ERCC1低表達(dá)細(xì)胞株進(jìn)行ERCC1的過表達(dá)來驗(yàn)證ERCC1對(duì)順鉑和Panobinostat聯(lián)合用藥的預(yù)測(cè)性。通過敲低功能獲得型(Gain of function, GOF)突變的p53,以及在p53缺失的細(xì)胞株中過表達(dá)野生型及GOF p53來驗(yàn)證p53狀態(tài)對(duì)順鉑和Panobinostat聯(lián)合用藥的預(yù)測(cè)作用。最后在PC-14細(xì)胞株中,同時(shí)敲低ERCC1及GOF p53,觀察細(xì)胞對(duì)順鉑和Panobinostat聯(lián)合用藥的敏感性的變化結(jié)果：在ERCC1高表達(dá)的細(xì)胞株NCI-H1299, NCI-H2172和PC-14中,敲低ERCC1可以增加NCI-H1299和NCI-H2172細(xì)胞株對(duì)順鉑和Panobinostat聯(lián)合用藥的敏感性。而在ERCC1低表達(dá)的細(xì)胞株HCC827和NCI-H23中,過表達(dá)ERCC1可以降低細(xì)胞對(duì)聯(lián)合用藥的敏感性。在攜帶GOF突變p53的細(xì)胞株NCI-H1975中敲低p53,在攜帶GOF突變p53和ERCC1高表達(dá)的PC-14細(xì)胞株中同時(shí)敲低ERCC1和p53可以增加細(xì)胞對(duì)聯(lián)合用藥的敏感性,而在野生型p53細(xì)胞株A549和HCC827中,則未觀察到該現(xiàn)象；相反的,我們?cè)趐53缺失的細(xì)胞株NCI-H2172中,過表達(dá)野生型p53可以增加細(xì)胞對(duì)聯(lián)合用藥的敏感性,而過表達(dá)GOF突變p53則可以逆轉(zhuǎn)該細(xì)胞中ERCC1敲低時(shí)細(xì)胞對(duì)聯(lián)合用藥敏感性的增加。結(jié)論：同時(shí)檢測(cè)ERCC1的表達(dá)水平和p53突變狀態(tài)可以預(yù)測(cè)NSCLC細(xì)胞株對(duì)順鉑和Panobinostat聯(lián)合用藥的敏感性。第三章Panobinostat可以增加順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡目的：進(jìn)一步探討Panobinostat對(duì)順鉑增敏作用的機(jī)制,從而深入了解ERCC1和p53預(yù)測(cè)NSCLC細(xì)胞株對(duì)兩藥聯(lián)用的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。方法：通過qPCR檢測(cè)p21的表達(dá),western blot檢測(cè)p53,磷酸化p53,cleaved-PARP的蛋白水平的表達(dá),以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。結(jié)果：在A549,HCC827和NCI-H23等三個(gè)ERCC1低表達(dá)以及不攜帶GOF突變型p53的細(xì)胞株中,聯(lián)合應(yīng)用Panobinostat較單用順鉑時(shí)細(xì)胞內(nèi)磷酸化p53,p21和cleaved-PARP表達(dá)均顯著升高,流式細(xì)胞儀檢測(cè)PI/Annexin V顯示細(xì)胞凋亡顯著增高；而在攜帶GOF突變型p53的細(xì)胞株NCI-H1975和PC-14中,只能檢測(cè)到磷酸化p53的增高,而不能檢測(cè)到p21,cleaved-PARP等表達(dá)增高。在ERCC1低表達(dá)的NCI-H1975細(xì)胞株中,敲低GOF突變型p53后我們檢測(cè)到cleaved-PARP表達(dá)增高以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)到凋亡細(xì)胞顯著增加；在ERCC1高表達(dá)并且攜帶有GOF突變型p53的細(xì)胞株P(guān)C-14中,同時(shí)敲低ERCC1和GOF突變型p53時(shí),也成功檢測(cè)到細(xì)胞凋亡的顯著增加。結(jié)論：Panobinostat可以通過增加順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡來增敏順鉑在NSCLC細(xì)胞株中的敏感性。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簶?gòu)建pET28a-HBVcAg-Mage A3質(zhì)粒,并進(jìn)行HBVcAg-Mage A3融合蛋白的表達(dá)和提純。實(shí)驗(yàn)方法：構(gòu)建pET28a-HBVcAg-Mage A3質(zhì)粒,摸索HBVcAg-Mage A3融合蛋白的表達(dá)條件和純化方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：pET28a-HBVcAg-Mage A3質(zhì)粒構(gòu)建成功,HBVcAg-Mage A3融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)優(yōu)化后條件為細(xì)菌OD值搖至1.3-1.5左右,IPTG濃度1.0mM,10mM葡萄糖和100μg/mL Kan的LB液體培養(yǎng)基,再在23℃下?lián)u床140rpm搖17小時(shí),收菌并在冰上超聲破碎菌體后SDS-page膠證實(shí)融合蛋白為內(nèi)涵體,再用鎳柱純化和超濾脫鹽。SDS-Page膠及BCA法測(cè)定提純蛋白濃度。
【關(guān)鍵詞】：HBVcAg-Mage A3融合蛋白 提純 表達(dá) 順鉑 組蛋白去乙�；敢种苿� Panobinostat 非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞株 ERCC1 GOF突變型p53 ERCC1 NSCLC細(xì)胞株 順鉑 Panobinostat GOF突變型p53 ERCC1 NSCLC細(xì)胞株 順鉑 Panobinostat
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R734.2
【目錄】：

• 英文縮略詞表6-7
• 第一部分 ERCC1表達(dá)和p53突變狀態(tài)聯(lián)合預(yù)測(cè)HDACi增敏非小細(xì)胞肺癌中順鉑療效7-68
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-15
• 第一章 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株對(duì)順鉑及順鉑和Panobinostat聯(lián)合用藥的敏感性15-30
• 材料和方法15-18
• 1. 材料15-17
• 2. 方法17-18
• 結(jié)果18-24
• 討論24-26
• 參考文獻(xiàn)26-30
• 第二章 ERCC1表達(dá)水平和p53狀態(tài)對(duì)順鉑和Panobinostat聯(lián)合用藥療效的預(yù)測(cè)作用30-44
• 材料和方法30-34
• 1. 材料30-31
• 2. 方法31-34
• 結(jié)果34-42
• 討論42-43
• 參考文獻(xiàn)43-44
• 第三章 Panobinostat可以促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡44-56
• 材料和方法44-47
• 1. 材料44-45
• 2. 方法45-47
• 結(jié)果47-52
• 討論52-54
• 參考文獻(xiàn)54-56
• 全文總結(jié)56-57
• 文獻(xiàn)綜述57-68
• 參考文獻(xiàn)62-68
• 第二部分 博士期間的其它工作HBVcAg-Mage A3融合蛋白的提取和純化68-96
• 中文摘要68
• Abstract68-70
• 前言70-71
• 實(shí)驗(yàn)材料71-75
• 實(shí)驗(yàn)方法75-79
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果79-81
• 結(jié)論81-82
• 文獻(xiàn)綜述82-96
• 參考文獻(xiàn)90-96
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章96-97
• 致謝97

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本文編號(hào)：573662