本文關(guān)鍵詞：小分子RNA-195通過負(fù)性調(diào)控S6K1的表達(dá)抑制人類前列腺癌的進(jìn)展

  更多相關(guān)文章： 前列腺癌 小分子 RNA-195 核糖體蛋白S6激酶多肽1 腫瘤抑制因子 預(yù)后

【摘要】：研究背景及目的：目前,前列腺癌在全球范圍內(nèi)仍然是個(gè)嚴(yán)峻的問題。2014年北美地區(qū)男性非皮膚性腫瘤中,前列腺癌依舊是發(fā)病率最高的腫瘤,死亡率僅次于肺癌。前列腺癌的自然病程個(gè)體差異很大,導(dǎo)致臨床工作者難以準(zhǔn)確地判斷其預(yù)后。惡性程度高的病例即使被早期發(fā)現(xiàn)并及時(shí)地接受了根治性的治療,也會(huì)在短期內(nèi)出現(xiàn)生化復(fù)發(fā)或臨床轉(zhuǎn)移。這種類型的腫瘤除了在確診后及時(shí)接受根治性的治療,還必須在術(shù)后接受輔助性的化療或放療,并密切隨訪。然而,大部分病例屬于“惰性”的前列腺癌,其特點(diǎn)是進(jìn)展緩慢,甚至終生不發(fā)病。研究發(fā)現(xiàn)積極地治療48個(gè)前列腺癌患者,只有1個(gè)人因此而避免死于該疾病,原因在于大部分前列腺癌的病程較長,患者死于心腦血管等并存疾病的幾率高,此類型的前列腺癌即使不接收任何治療,對(duì)預(yù)期壽命的影響也很小。近幾十年,隨著PSA篩選的普遍推廣,過度干預(yù)低度惡性的病例成為目前前列腺癌的治療過程中凸顯的問題。根治性的治療往往給患者的生活質(zhì)量及身心帶來沉重的負(fù)面影響,因而對(duì)低度惡性的病例應(yīng)采取定期隨訪的方案,而不積極地干預(yù)它。另一方面,保守治療可能會(huì)導(dǎo)致病情突然惡化而錯(cuò)過最佳的治療時(shí)機(jī),使患者產(chǎn)生焦慮,致使許多屬于“惰性”腫瘤的患者不愿意接受保守治療。因此,正確地判斷前列腺癌的惡性程度及預(yù)后十分關(guān)鍵,決定前列腺癌的治療方案是否合理。目前臨床中判斷前列腺癌惡性程度和預(yù)后主要依賴術(shù)前的指標(biāo)(臨床腫瘤分期、Gleason評(píng)分、血清PSA濃度)和術(shù)后的指標(biāo)(腫瘤病理分期、Gleason評(píng)分、血清PSA濃度、切緣狀態(tài)、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移)。術(shù)后的指標(biāo)相對(duì)術(shù)前的指標(biāo)能更準(zhǔn)確地評(píng)估前列腺癌的惡性程度及預(yù)后。這些指標(biāo)被組合成不同的模型用于預(yù)測(cè)前列腺癌的預(yù)后,但是有研究表明即便是采用術(shù)后指標(biāo)的組合,其預(yù)測(cè)前列腺癌預(yù)后的準(zhǔn)確率也只有75%-85%。如果是接受保守治療的患者,其準(zhǔn)確率更低。因此,單純依靠傳統(tǒng)的臨床病理指標(biāo)不能精確地區(qū)分“惰性”和高度惡性的病例,我們迫切需要深入研究和探索介導(dǎo)前列腺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制,如果能找到潛在的關(guān)鍵通路和分子,除了能協(xié)助傳統(tǒng)的指標(biāo)制定更合理的治療方案,也能為前列腺癌的分子靶向治療提供可靠的理論依據(jù)。近年來,小分子RNA (microRNAs, miRNAs)在各種腫瘤中的作用越來越受到關(guān)注。它是內(nèi)源性的小分子單鏈的非編碼RNA,由大約22個(gè)核苷酸構(gòu)成,它們以堿基配對(duì)的方式與編碼蛋白的mRNA的3’端非編碼區(qū)(3'UTR)結(jié)合,通過抑制翻譯起始和(或)降解mRNA的途徑來抑制基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)。niRNAs已被大量的研究證實(shí)了在腫瘤中表達(dá)失調(diào),主要是通過直接調(diào)控下游編碼蛋白的基因表達(dá)參與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。miRNAs調(diào)控了人類超過一半的編碼蛋白的基因,并且它們的表達(dá)水平異�；蛘吖δ芪蓙y與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)。目前已有許多研究明確了miRNAs在前列腺癌扮演重要的角色,如miR-34a、miR-373和miR-520c、因此,miRNAs是研究前列腺癌分子機(jī)制重要的組成部分及潛在的治療靶點(diǎn)。眾多miRNAs中,對(duì)于miR-15/107家族基因成員miR-195在腫瘤中作用的研究是近幾年miRNAs領(lǐng)域的熱點(diǎn)。miR-195已被證實(shí)了在多種惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào),并發(fā)揮關(guān)鍵的抑癌作用,包括乳腺癌、肝細(xì)胞癌、食管鱗癌和腎上腺皮質(zhì)癌。這些研究結(jié)果證明了miR-195通過直接調(diào)控下游靶基因的表達(dá)從而參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲和血管生長等過程,從而發(fā)揮抑制腫瘤進(jìn)展的作用。與miRNAs的生物學(xué)功能具有高度組織和細(xì)胞特異性的特點(diǎn)一致,在惡性黑色素瘤中,miR-195被發(fā)現(xiàn)通過調(diào)控WEE1能夠促進(jìn)黑色素癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲進(jìn)而發(fā)揮促癌作用。目前,miR-195在前列腺癌中的表達(dá)情況和分子生物學(xué)功能尚不清楚。本研究旨在探索miR-195在前列腺癌中的作用及其調(diào)控的靶基因。材料：1.人臨床組織來源：12對(duì)配對(duì)的原發(fā)性前列腺癌及癌旁良性冰凍前列腺組織從廣州市第一人民醫(yī)院組織庫獲得；Taylor數(shù)據(jù)庫是一個(gè)公用的數(shù)據(jù)平臺(tái),其中miRNA表達(dá)譜芯片包含帶有臨床隨訪數(shù)據(jù)的113個(gè)原發(fā)性前列腺癌病例；人的前列腺組織芯片(Tissue microarrays, TMA)包含225例人原發(fā)性前列腺癌組織和25例癌旁良性前列腺組織,是1993年9月到1995年3月期間在美國麻省總醫(yī)院(MGH)接受前列腺癌根治術(shù)的病例。2.動(dòng)物：20只年齡在4-5周的BALB/c雄性裸鼠購買于廣東醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。3.細(xì)胞株：3種前列腺癌細(xì)胞株(PC3/DU145/LNCaP)是2012年從美國馬納薩斯(Manassas, VA, USA)的American Type Culture Collection (ATCC)公司購買得到,而良性的前列腺上皮細(xì)胞系PrEC是從Lonza公司購買。方法：1.慢病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染DU145和LNCaP構(gòu)建miR-195過表達(dá)和抑制表達(dá)的細(xì)胞株；核酸或質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染DU145和LNCaP構(gòu)建靶基因S6K1、miR-195和靶基因S6K1同時(shí)過表達(dá)等細(xì)胞株。2. Taylor公用數(shù)據(jù)庫分析miR-195的表達(dá)水平與人前列腺癌的臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性。3.細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)分析miR-195在體外對(duì)前列腺癌細(xì)胞功能的影響,以及靶基因S6K1能否拮抗miR-195對(duì)前列腺癌細(xì)胞引起的效應(yīng),包括細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、凋亡實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)。裸鼠皮下接種DU145和LNCaP細(xì)胞株形成裸鼠皮下移植瘤模型,用于分析miR-195在體內(nèi)對(duì)前列腺癌成瘤和轉(zhuǎn)移方面的影響。4. iTRAQ技術(shù)對(duì)穩(wěn)定過表達(dá)miR-195和空白對(duì)照的LNCaP細(xì)胞株進(jìn)行質(zhì)譜分析,探索由miR-195引起的差異表達(dá)的蛋白。結(jié)合IPA軟件和GO功能分析差異蛋白所涉及的信號(hào)通路和分子生物學(xué)功能。5. miRNAs靶基因預(yù)測(cè)軟件Target-Scan、miRWalk和miRanda同時(shí)預(yù)測(cè)受miR-195調(diào)控的靶基因；熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)確認(rèn)miR-195直接調(diào)控的靶基因。6. qRT-PCR檢測(cè)miR-195過表達(dá)和空白對(duì)照的LNCaP細(xì)胞株中候選靶基因S6K1、SMAP2、DCUN1D1、SMAD4、IP091、CAPZA2和CPNE1的表達(dá)水平。qRT-PCR分別檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3、DU145和LNCaP,正常前列腺上皮細(xì)胞株P(guān)rEC,以及12對(duì)前列腺癌和對(duì)應(yīng)的癌旁良性前列腺組織的miR-195和靶基因S6K1的表達(dá)水平。7. Western bolt檢測(cè)miR-195異常表達(dá)的DU145和LNCaP細(xì)胞株以及裸鼠皮下移植瘤組織中靶基因S6K1的蛋白水平；Western bolt檢測(cè)靶基因S6K1表達(dá)異常的相關(guān)細(xì)胞株構(gòu)建是否成功；Western bolt檢測(cè)miR-195過表達(dá)或S6K1被抑制表達(dá)的DU145和LNCaP細(xì)胞株中靶基因S6K1下游已被研究證實(shí)的潛在效應(yīng)因子MMP-9、VEGF、BAD和E-cadherin的蛋白水平。8.免疫組織化學(xué)分析S6K1在包含225例人前列腺癌和25例癌旁良性前列腺癌的組織芯片的表達(dá)情況；免疫組織化學(xué)分析miR-195異常表達(dá)的DU145和LNCaP細(xì)胞株接種形成的裸鼠皮下腫瘤組織中CD31和Vimentin的表達(dá)情況。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理。連續(xù)變量以X±s的形式展示。計(jì)數(shù)資料采用皮爾森卡方檢驗(yàn)。Kolmogorov-Smirnov (K-S)檢驗(yàn)用于評(píng)估Taylor數(shù)據(jù)庫中miR-195芯片值分布是否符合正態(tài)分布。qRT-PCR、免疫組化、Western blot和細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)等定量結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和One-way ANOVA檢驗(yàn)用于分析Taylor數(shù)據(jù)庫中miR-195表達(dá)水平和前列腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系。LSD法用于兩個(gè)以上分組的組間兩兩比較。重復(fù)測(cè)量方差分析分析不同時(shí)間點(diǎn)上兩組數(shù)據(jù)之間的比較。配對(duì)t檢驗(yàn)用于分析miR-195和S6K1各自在12對(duì)匹配的前列腺癌和癌旁良性組織中的mRNA水平的差異o Kaplan-Meier方法及l(fā)og-rank檢驗(yàn)用于生存分析,COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型單因素和多因素分析評(píng)估m(xù)iR-195和S6K1是否能作為預(yù)測(cè)前列腺癌預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。Pearson相關(guān)性分析用于分析前列腺癌組織標(biāo)本中miR-195和S6K1之間表達(dá)量的相關(guān)性。P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：1.相對(duì)正常前列腺上皮細(xì)胞株P(guān)rEC, miR-195在PC3、DU145和LNCaP細(xì)胞株中的表達(dá)量均顯著性下調(diào)(P0.001); miR-195在人臨床前列腺癌組織中的表達(dá)量相對(duì)于癌旁良性前列腺組織的表達(dá)量同樣顯著性下調(diào)(P=0.020)。2.利用Taylor公用數(shù)據(jù)庫分析顯示miR-195的表達(dá)水平跟前列腺癌Gleason評(píng)分成顯著性負(fù)相關(guān)(P=0.001), miR-195表達(dá)水平的下調(diào)與前列腺癌根治術(shù)后發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及生化復(fù)發(fā)密切相關(guān)(P=0.01,0.009),然而,miR-195的表達(dá)水平與患者的術(shù)前血清PSA濃度、腫瘤臨床分期、腫瘤病理分期以及是否死亡不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)性。Kaplan-Meier和Log rank方法顯示miR-195的表達(dá)水平與患者的總體生化復(fù)發(fā)率和無轉(zhuǎn)移生化復(fù)發(fā)率存在顯著性負(fù)相關(guān)(P=0.001,0.009),但與患者的總體生存率和無轉(zhuǎn)移生存率不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)性(P=0.721,0.806)。COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型單因素分析結(jié)果提示腫瘤病理分期、Gleason評(píng)分和miR-195的表達(dá)水平都是預(yù)測(cè)前列腺癌患者接受前列腺癌根治術(shù)后出現(xiàn)生化復(fù)發(fā)的重要指標(biāo),而年齡、術(shù)前血清PSA水平、腫瘤臨床分期不能作為判斷前列腺癌預(yù)后的預(yù)測(cè)因子。COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型多因素分析結(jié)果提示miR-195表達(dá)水平[HR:0.58 (0.39-0.85)]、Gleason評(píng)分[HR：5.83(2.71-12.54)]和病理分期[2.71(1.09-6.71)]能夠作為預(yù)測(cè)生化復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立指標(biāo)。3.體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)顯示miR-195過表達(dá)的DU145和LNCaP細(xì)胞株的增殖、遷移、侵襲能力相對(duì)空白對(duì)照組明顯下降,而發(fā)生凋亡的比率明顯增加。相反,miR-195抑制表達(dá)的DU145和LNCaP細(xì)胞株的增殖、遷移、侵襲能力相對(duì)對(duì)照組明顯增加,而發(fā)生凋亡的比率明顯降低(P0.05)。4.裸鼠皮下移植瘤模型顯示miR-195過表達(dá)能夠顯著性抑制由DU145和LNCaP形成的移植瘤的成瘤大小和生長速度(P0.05)；相反,miR-195的表達(dá)被抑制后移植瘤成瘤大小比對(duì)照組大,且生長速度加快。免疫組化分析結(jié)果顯示miR-195能夠顯著性抑制移植瘤組織中新生血管指標(biāo)CD31和腫瘤侵襲力指標(biāo)Vimentin的表達(dá)水平(P0.05)。5. iTRAQ發(fā)現(xiàn)的差異性表達(dá)蛋白總共有3194個(gè),其中有78個(gè)蛋白的差異表達(dá)倍數(shù)≤-1.5或≥1.5 (miR-195 vs miR-NC),包括28個(gè)上調(diào)蛋白和50個(gè)下調(diào)蛋白。IPA軟件的KEGG通路分析顯示大部分上調(diào)蛋白參與代謝類的通路,例如檸檬酸循環(huán)、纈氨酸降解、丙氨酸生物合成、輔酶生物合成和脂肪酸氧化。大部分下調(diào)的蛋白參與mTOR通路、IL-8通路、AMPK通路和IGF-1通路等腫瘤相關(guān)通路。GO功能會(huì)聚系統(tǒng)分析結(jié)果顯示差異蛋白涉及的與腫瘤相關(guān)的生物學(xué)功能包括細(xì)胞周期、細(xì)胞侵襲、細(xì)胞形態(tài)變化和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。6.3個(gè)miRNAs靶基因軟件共同預(yù)測(cè)50個(gè)下調(diào)蛋白中可能被miR-195調(diào)控的候選靶基因,結(jié)果顯示SMAP2、DCUNID1、SMAD4、IP09、S6K1、CAPZA2和CPNE1為候選靶基因。qRT-PCR結(jié)果顯示SMAP2、S6K1、IP09和DCUNIDI在miR-195過表達(dá)的LNCaP細(xì)胞株和裸鼠皮下移植瘤組織中表達(dá)下調(diào)(P0.05)。熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)一步揭示S6K1是miR-195直接調(diào)控的靶基因(P0.001)。qRT-PCR和western blot證實(shí)miR-195和S6K1在前列腺癌細(xì)胞株、移植瘤和人臨床前列腺癌組織中的基因和蛋白表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)的關(guān)系。7.體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)示S6K1過表達(dá)可以拮抗miR-195對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用,以及減緩miR-195對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用(P0.05)。另外,siRNA抑制S6K1的表達(dá)后在體外對(duì)前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡功能的影響與miR-195對(duì)前列腺癌細(xì)胞產(chǎn)生的效應(yīng)一致(P0.05)。這些結(jié)果進(jìn)一步揭示了S6K1可能是miR-195發(fā)揮抑制前列腺癌進(jìn)展作用下游重要的媒介。8.組織芯片免疫染色分析顯示前列腺癌組織標(biāo)本的S6K1陽性表達(dá)率[174/225(77.3%)]顯著高于癌旁良性前列腺組織[10/25(40%)](χ2=16.140,P0.001); S6K1的陽性表達(dá)與前列腺癌患者的病理分期較晚(χ2=4.396,P=0.036)、手術(shù)切緣陽性(χ3=5.371,P=0.02)、生化復(fù)發(fā)(χ2=5.696,P=0.017)和總體生存率降低(χ2=5.417,P=0.02)有關(guān)。Kaplan-Meier和Log rank方法分析結(jié)果顯示S6K1的陽性表達(dá)跟患者總體無生化復(fù)發(fā)生存率和總體生存率降低有關(guān)(P=0.011,0.022),但與無轉(zhuǎn)移生存率的降低不存在相關(guān)性(P=0.058)。COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型顯示S6K1可作為預(yù)測(cè)前列腺癌患者無生化復(fù)發(fā)生存率和總體生存率的獨(dú)立指標(biāo),HR(95% CI)分別是2.041(1.098-3.792)和2.992(1.058-8.462)。9.在前列腺癌細(xì)胞株LNCaP和DU145中,抑制S6K1的表達(dá)或miR-195過表達(dá)均可以導(dǎo)致MMP-9和VEGF的蛋白水平下降,而E-cadherin和BAD的蛋白水平上調(diào),這結(jié)果說明MMP-9、VEGF、E-cadherin和BAD是miR-195-S6K1軸下游的重要效應(yīng)因子。結(jié)論：1.miR-195在前列腺癌中是一個(gè)重要的抑癌基因；miR-195通過負(fù)性調(diào)控S6K1的表達(dá)抑制人類前列腺癌的進(jìn)展。2.miR-195和S6K1均可單獨(dú)作為預(yù)測(cè)患者在接受前列腺癌根治術(shù)后出現(xiàn)生化復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo)；S6K1還可單獨(dú)作為預(yù)測(cè)前列腺癌患者總體生存時(shí)間長短的指標(biāo)�？傊�,有望通過檢測(cè)前列腺癌組織中miR-195和S6K1的表達(dá)水平,協(xié)助傳統(tǒng)的臨床病理指標(biāo)更準(zhǔn)確地區(qū)分低度惡性和高度惡性的前列腺癌,優(yōu)化治療方案。3. miR-195-S6K1信號(hào)軸進(jìn)一步揭示了前列腺癌發(fā)生進(jìn)展的分子機(jī)制,并有望成為治療前列腺癌的新靶標(biāo)。
【關(guān)鍵詞】：前列腺癌 小分子 RNA-195 核糖體蛋白S6激酶多肽1 腫瘤抑制因子 預(yù)后
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.25
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-24
• 第1章 前言24-49
• 1.1 前列腺癌的流行病學(xué)24-25
• 1.2 前列腺癌發(fā)生和進(jìn)展的機(jī)制25-26
• 1.3 前列腺癌早期發(fā)現(xiàn)和診斷的方法26-27
• 1.3.1 直腸指檢(Digital rectal examination,DRE)26-27
• 1.3.2 前列腺特異性抗原(Prostate-specific antigen,PSA)27
• 1.3.3 經(jīng)直腸超聲檢查(Transrectal ultrasonography,TRUS)27
• 1.4 前列腺癌治療的現(xiàn)狀27-33
• 1.4.1 前列腺癌的自然病程27-28
• 1.4.2 前列腺癌的治療方案28-30
• 1.4.3 判斷前列腺癌的預(yù)后及治療難點(diǎn)30-33
• 1.5 miRNAs與前列腺癌33-39
• 1.5.1 miRNAs的基本結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能33-34
• 1.5.2 miRNAs在腫瘤中的角色34-37
• 1.5.3 miRNAs的功能和表達(dá)具有組織特異性37-38
• 1.5.4 miRNAs在前列腺癌中的角色38-39
• 1.6 miR－195的研究進(jìn)展39-42
• 1.6.1 miR-195的基本結(jié)構(gòu)39-40
• 1.6.2 miR-195的生物學(xué)功能40-41
• 1.6.3 miR-195與疾病41
• 1.6.4 miR-195與腫瘤41-42
• 1.7 S6K1的研究進(jìn)展42-47
• 1.7.1 S6K1的基本結(jié)構(gòu)42
• 1.7.2 S6K1是mTOR通路下游重要的效應(yīng)因子42-43
• 1.7.3 S6K1的下游和互相作用的蛋白43-45
• 1.7.4 S6K1與腫瘤相關(guān)的功能45-47
• 1.8 本研究擬解決的問題47-49
• 1.8.1探索miR-195在人類前列腺癌中的表達(dá)情況、臨床意義以及生物學(xué)功能47-48
• 1.8.2 探索并明確miR-195在前列腺癌中直接調(diào)控的關(guān)鍵靶基因48
• 1.8.3 驗(yàn)證靶基因是否為miR-195在前列腺癌中發(fā)揮作用的關(guān)鍵媒介48
• 1.8.4 探索靶基因下游的關(guān)鍵效應(yīng)因子48-49
• 第2章 材料與方法49-78
• 2.1 材料49-52
• 2.1.1 組織來源及臨床資料49-50
• 2.1.2 動(dòng)物50
• 2.1.3 細(xì)胞株50-51
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)主要試劑51
• 2.1.5 實(shí)驗(yàn)主要儀器51-52
• 2.2 方法52-78
• 2.2.1 慢病毒載體轉(zhuǎn)染構(gòu)建細(xì)胞株52-53
• 2.2.2 核酸和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染構(gòu)建細(xì)胞株53-57
• 2.2.3 建立裸鼠移植瘤模型57
• 2.2.4 熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析57-60
• 2.2.5 miRNA靶基因生物信息學(xué)預(yù)測(cè)60
• 2.2.6 熒光實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)60-67
• 2.2.7 免疫組織化學(xué)染色67-70
• 2.2.8 Western blot70-71
• 2.2.9 應(yīng)用iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)技術(shù)進(jìn)行質(zhì)譜分析71-75
• 2.2.10 細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)75-76
• 2.2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理76-78
• 第3章 結(jié)果78-118
• 3.1 miR-195在人類前列腺癌細(xì)胞株和臨床組織中表達(dá)下調(diào)78-80
• 3.2 miR-195的表達(dá)水平與前列腺癌患者的臨床病理特征的相關(guān)性80-82
• 3.3 miR-195的低水平表達(dá)與前列腺癌預(yù)后差有關(guān)82-83
• 3.4 miR-195可作為判斷前列腺癌預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)83-84
• 3.5 miR-195在體外能夠抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡84-92
• 3.6 miR-195在體內(nèi)能夠抑制腫瘤生長、侵襲和血管生成92-95
• 3.7 iTRAQ質(zhì)譜分析由miR-195介導(dǎo)的蛋白質(zhì)合成的變化95-97
• 3.8 S6K1是miR-195直接調(diào)控的下游靶基因97-103
• 3.9 S6K1是miR-195抑制前列腺癌進(jìn)展的重要媒介103-112
• 3.10 S6K1的表達(dá)與前列腺癌的進(jìn)展和臨床預(yù)后差密切相關(guān)112-116
• 3.11 MMP-9、VEGF、BAD和E-cadherin是miR-195-S6K1軸的下游效應(yīng)因子116-118
• 第4章 討論118-124
• 4.1 miR-195在前列腺癌中的表達(dá)下調(diào)118-119
• 4.2 miR-195表達(dá)水平與前列腺癌的惡性程度和預(yù)后負(fù)相關(guān)119
• 4.3 miR-195在前列腺癌中的分子生物學(xué)功能119-120
• 4.4 高通量數(shù)據(jù)分析miR-195在前列腺癌中涉及的分子功能及通路120-121
• 4.5 S6K1是受miR-195直接調(diào)控的靶基因121-122
• 4.6 MMP-9、VEGF、BAD和E-cadherin是miR-195-S6K1信號(hào)軸下游的效應(yīng)因子122
• 4.7 miR-195-S6K1信號(hào)軸聯(lián)合調(diào)控前列腺癌的進(jìn)展122-124
• 結(jié)論124-125
• 本研究的不足之處125-126
• 參考文獻(xiàn)126-144
• 附錄144-147
• 攻讀博士學(xué)位期間的成果147-149
• 致謝149-151
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)證明151

，

本文編號(hào)：569484