發(fā)布時間：2017-07-19 17:01

  本文關鍵詞：活性氧簇和內質網應激在艱難梭菌毒素B誘導的腫瘤細胞死亡中的作用

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【摘要】：艱難梭菌是一種革蘭氏陽性的人類腸道正常菌群,在腸道菌群失衡時(尤其在抗生素濫用的背景下),是住院性腹瀉和偽膜性腸炎的主要致病菌。在過去十幾年中,由于超毒力菌株的出現(xiàn),艱難梭菌感染(Clostridium difficile infection,CDI)的發(fā)病率和死亡率顯著增加。毒素A(Tcd A)和毒素B(Tcd B)是艱難梭菌的兩個主要毒力因子,具有相似的作用機制,二者的致炎和致凋亡作用已經被廣泛報道。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),重組的Tcd B(r Tcd B)可以在結腸癌細胞系CT26中誘導免疫原性細胞死亡(immunogenic cell death,ICD)。ICD是一種近年來提出的新的死亡模式,主要特征是瀕臨死亡的腫瘤細胞會釋放或表面表達一些可以激活機體免疫系統(tǒng)的死亡相關損傷因子(deth association molecular patterns,DAMPs),從而誘導抗腫瘤抗原的免疫效應。目前只有少數(shù)幾種臨床上成功應用的抗腫瘤藥物具有刺激ICD的作用,而且研究發(fā)現(xiàn)活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)和內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)在調控瀕死癌細胞的免疫原性和幾種關鍵DAMPs釋放的通路中發(fā)揮重要作用。雖然對Tcd A和Tcd B的毒性機制的研究已經有了很大進展,但關于其誘導細胞死亡的機制卻存在很多爭議,是否ROS和ER stress參與其中也無系統(tǒng)報道。本文主要檢測了ROS和ER stress在r Tcd B中毒細胞中的發(fā)生情況,并研究了它們在r Tcd B誘導的細胞死亡中的作用。研究結果表明,在CT26細胞中r Tcd B誘導的ROS增加不依賴于毒素濃度,胞內的ROS在毒素(100 ng/m L)處理后的24小時內處于動態(tài)變化中。三種ROS的藥理學抑制劑N-乙酰半胱氨酸(NAC,使用濃度5 m M)、二甲基碘苯翁(DPI,使用濃度5μM)和抗霉素A(Antimycin A,使用濃度5μM)不僅可以顯著抑制r Tcd B誘導的PS膜外表達和sub-G1期細胞含量,也顯著抑制了因r Tcd B處理引起的Bcl-2蛋白表達的減少和磷酸化STAT3蛋白表達的增加,說明ROS通過調控Bcl-2和磷酸化STAT3蛋白表達參與r Tcd B誘導的細胞死亡。此外,r Tcd B也可以在人類結腸癌細胞系HCT-8中誘導ROS產生。NAC通過抑制胞內ROS產生、抵抗線粒體膜電位改變、抑制Bcl-2蛋白表達下調和抑制自噬蛋白LC3B(Light Chain 3 B isoforms)的轉歸保護r Tcd B中毒的細胞。ER stress的兩條關鍵的未折疊蛋白反應支路—PERK和IRE1α支路在r Tcd B中毒的CT26細胞中被活化。然而,葡萄糖基轉移酶雙位點突變的Tcd B也可以在CT26細胞中誘導這兩條支路的活化,說明rTcd B對ER stress的誘導不依賴于毒素的葡萄糖基轉移酶活性的。此外,r Tcd B并不影響內質網凋亡途徑關鍵蛋白CHOP(C/EBP-homologous protein)的表達,相反,突變毒素B可以誘導它上調,說明CHOP蛋白的表達受到葡萄糖基轉移酶或其下游的Rho蛋白活性的調控。Salubrinal是一種特異性的e IF2α(α-subunit of eukaryotic translational initiation factor 2)蛋白脫磷酸化抑制劑,研究發(fā)現(xiàn)它通過抑制caspase 9活化和自噬、影響Rac1蛋白的葡萄糖基化來保護r Tcd B中毒的細胞。綜上,由rTcd B在CT26細胞中誘導的ER stress并不參與最終的細胞死亡,它更可能是對抗r Tcd B中毒的一種保護機制。動物實驗結果表明,經活細胞challenge后,用r Tcd B(500 ng/m L)處理6小時的細胞免疫的小鼠沒有腫瘤生長。用ER stress藥理學抑制劑(TUDCA(tauroursodeoxycholic acid)或4-PBA(4-phenylbuturate))與r Tcd B共處理6小時的細胞免疫的小鼠也沒有腫瘤生長,說明ER stress不參與r Tcd B誘導的ICD。用DPI或Anti.A與r Tcd B共處理的CT26細胞免疫的小鼠在challenge后部分長出了腫瘤,但用NAC與r Tcd B共處理細胞接種的小鼠并無腫瘤生長,這可能與NAC是在ROS產生后才發(fā)揮清除作用,而DPI和Anit.A則直接從源頭上抑制ROS產生有關。對HSP90、HSP70和HMGB1蛋白胞外表達、鈣網織蛋白(CRT)質膜表達、自噬蛋白LC3B表達以及胞內外ATP含量的檢測結果表明,DPI和Anti.A顯著抑制了r Tcd B誘導的三種蛋白的胞外分泌和CRT質膜表達,但NAC對它們的影響有限。三種抑制劑均顯著抑制了自噬蛋白LC3B的轉歸,但并不影響ATP的胞外分泌。由以上數(shù)據可知,ROS可以通過抑制關鍵DAMPs的分泌或位移(HSP90、HSP70、HMGB1和鈣網織蛋白)以及影響自噬來影響ICD。綜上所述,本研究證明rTcd B處理導致了胞內ROS的增加和ER stress的發(fā)生,ROS參與rTcd B誘導的細胞凋亡和ICD,但ER stress并不參與這兩種細胞死亡形式。
【關鍵詞】：艱難梭菌毒素B 活性氧簇 內質網應激 細胞死亡 免疫原性細胞死亡
【學位授予單位】：華南理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R730.2
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 中英文對照和縮略詞表14-16
• 第一章 緒論16-28
• 1.1 艱難梭菌及其致病機制16-19
• 1.1.1 艱難梭菌簡介及其感染現(xiàn)狀16-17
• 1.1.2 艱難梭菌的致病因子17-18
• 1.1.3 毒素A和毒素B的作用機制18-19
• 1.2 細胞死亡及其研究進展19-24
• 1.2.1 細胞凋亡20-21
• 1.2.2 自噬21-22
• 1.2.3 免疫原性細胞死亡（Immunogenic cell death，ICD）22-23
• 1.2.4 壞死23-24
• 1.3 艱難梭菌毒素誘導的細胞死亡24-25
• 1.4 本課題的研究目的、意義與主要內容25-28
• 1.4.1 研究目的25
• 1.4.2 研究意義25-26
• 1.4.3 主要研究內容26-28
• 第二章 活性氧簇在TcdB誘導的細胞凋亡中的作用28-56
• 2.1 引言28-29
• 2.2 實驗材料29-34
• 2.2.1 細胞和毒素29
• 2.2.2 主要設備與耗材29-30
• 2.2.3 主要藥品與試劑30-31
• 2.2.4 主要實驗用溶液配制31-34
• 2.3 實驗方法34-43
• 2.3.1 細胞培養(yǎng)34
• 2.3.2 細胞復蘇34-35
• 2.3.3 細胞傳代35
• 2.3.4 細胞凍存35
• 2.3.5 重組艱難梭菌毒素B的表達純化35-36
• 2.3.6 親和層析純化蛋白36-37
• 2.3.7 細胞病變效應及細胞毒性檢測37
• 2.3.8 細胞內活性氧的檢測37
• 2.3.9 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡37-38
• 2.3.10 Sub-G1 法檢測細胞凋亡38-39
• 2.3.11 DNA ladder39-40
• 2.3.12 Western blot40-42
• 2.3.13 羅丹明檢測胞內線粒體膜電位的改變42-43
• 2.4 結果與討論43-55
• 2.4.1 重組艱難梭菌毒素B(rTcdB)的表達純化及其性質鑒定43-46
• 2.4.2 rTcdB處理誘導細胞內ROS的水平升高46-47
• 2.4.3 ROS參與r TcdB引起的細胞凋亡47-50
• 2.4.4 NAC保護艱難梭菌毒素B引起的細胞死亡效應的機制50-55
• 2.5 小結55-56
• 第三章 內質網應激在TcdB誘導的細胞凋亡中的作用56-80
• 3.1 引言56-57
• 3.2 實驗材料57-59
• 3.2.1 細胞和毒素57
• 3.2.2 主要設備及耗材57
• 3.2.3 主要試劑57-58
• 3.2.4 主要溶液配制58
• 3.2.5 引物58-59
• 3.3 實驗方法59-64
• 3.3.1 細胞培養(yǎng)、傳代、復蘇及凍存方法59
• 3.3.2 重組突變毒素B（mrTcdB）的表達純化59
• 3.3.3 實時定量PCR （Real-time PCR）59-61
• 3.3.4 逆轉錄PCR61-62
• 3.3.5 Western Blot檢測蛋白表達62
• 3.3.6 細胞凋亡檢測62
• 3.3.7 細胞病變和細胞毒性效應62-63
• 3.3.8 乳酸脫氫酶（LDH）測試63-64
• 3.4 結果與討論64-78
• 3.4.1 重組突變毒素B（mrTcdB）的表達、純化與細胞毒性和病變效應測定64-65
• 3.4.2 rTcd B 誘導 ER stress65-68
• 3.4.3 艱難梭菌毒素B對凋亡性ER stress分子標記物的影響68-71
• 3.4.4 rTcdB引起的ER stress是葡萄糖基轉移酶非依賴的71-72
• 3.4.5 Salubrinal對rTcdB中毒細胞的保護效應及其機制研究72-78
• 3.5 小結78-80
• 第四章 ROS和ER stress在TcdB誘導的免疫原性細胞死亡中的作用80-96
• 4.1 引言80-84
• 4.1.1 ICD相關DAMPs簡介80-83
• 4.1.2 ICD誘導劑83-84
• 4.2 實驗材料84-85
• 4.2.1 細胞和毒素84
• 4.2.2 主要試劑84-85
• 4.2.3 主要實驗用試劑配制85
• 4.2.4 主要儀器85
• 4.3 主要實驗方法85-89
• 4.3.1 Western blot檢測上清和全細胞蛋白85-86
• 4.3.2 細胞凋亡狀態(tài)分析86-87
• 4.3.3 CRT膜轉位分析87-88
• 4.3.4 小鼠免疫模型的建立88-89
• 4.4 結果和討論89-95
• 4.4.1 ROS和ER stress對r TcdB中毒的CT26 細胞凋亡的影響89-90
• 4.4.2 ROS和ER stress在r TcdB中毒的CT26 細胞腫瘤免疫模型中的作用90-93
• 4.4.3 ROS影響r TcdB在腫瘤細胞中誘導的ICD的相關機制93-95
• 4.5 小結95-96
• 結論與展望96-98
• 結論96
• 論文創(chuàng)新點96
• 展望96-98
• 參考文獻98-113
• 攻讀博士學位期間取得的研究成果113-114
• 致謝114-115
• 附件115

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據庫 前1條

1 ;Clostridium difficile infections in China[J];Journal of Biomedical Research;2010年06期

，

本文編號：563876