發(fā)布時(shí)間：2017-07-19 15:02

  本文關(guān)鍵詞：經(jīng)典瞬時(shí)受體電位通道3在間質(zhì)狀態(tài)非小細(xì)胞肺癌生長(zhǎng)中的作用研究

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【摘要】：研究背景：肺癌是全世界最常見(jiàn)診斷的惡性腫瘤,也是死亡率最高腫瘤之一。臨床上發(fā)現(xiàn)的肺癌病人大多數(shù)已經(jīng)處于中晚期,以目前的治療手段,病人的五年總生存率只有約15%左右。在肺癌病人中,80%的患者是非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)。改進(jìn)和提高NSCLC病人的診斷和治療是迫切需要解決的問(wèn)題。自從第三代抗腫瘤藥物和以表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)酪氨酸酶抑制劑(tyrosine kinases inhibitors, TKIs)為代表的靶分子治療方法的應(yīng)用,部分NSCLC患者的生存時(shí)間有了一定的提高。但TKIs如厄洛替尼(Erlotinib)和吉非替尼(Gefibinib)治療的敏感性與EGFR基因突變相關(guān)。這種突變?cè)贜SCLC病人中實(shí)際發(fā)生的比例不高。先前的研究已經(jīng)表明,上皮癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitions, EMT)是影響EGFR-TKIs敏感性的因素之一。因此,進(jìn)一步加深理解NSCLC發(fā)展過(guò)程中與EMT相關(guān)的分子表達(dá)的變異及功能,或許能為NSCLC提供新的治療策略。EMT是多種動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中的基礎(chǔ)事件,涉及組織器官的形成。在疾病方面的研究也發(fā)現(xiàn)與癌癥的發(fā)展密切相關(guān),涉及癌細(xì)胞生物學(xué)的多個(gè)方面。上皮狀態(tài)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)狀態(tài)后,獲得侵襲和轉(zhuǎn)移的能力,是癌癥發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要原因。此外,研究表明間質(zhì)樣癌細(xì)胞常常對(duì)傳統(tǒng)治療較耐受,和癌癥預(yù)后差有關(guān)。體外NSCLC細(xì)胞系的對(duì)比研究表明間質(zhì)狀態(tài)癌細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs更耐受。連續(xù)TKIs處理上皮狀態(tài)癌細(xì)胞,藥物的敏感性逐步下降并發(fā)生EMT。臨床試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)在獲得藥物抵抗的病人中有部分患者癌組織有EMT。最近的研究發(fā)現(xiàn),上皮狀態(tài)的NSCLC細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)EMT后,癌細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子受體信號(hào)依賴發(fā)生改變。這可能是間質(zhì)狀態(tài)癌對(duì)EGFR-TKIs的藥物抵抗的原因。盡管已有大量的研究在揭示EMT發(fā)生發(fā)展機(jī)制,但直至目前還沒(méi)有較好的抑制其發(fā)展過(guò)程的手段應(yīng)用于臨床。細(xì)胞鈣信號(hào)參與調(diào)控各種細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程,如細(xì)胞增殖,周期,凋亡,基因轉(zhuǎn)錄表達(dá),血管生成等,是細(xì)胞對(duì)外界刺激做出應(yīng)答的快速反應(yīng)信號(hào)。鈣信號(hào)形成涉及受體,鈣通道,傳感器,效應(yīng)器,鈣敏感激酶,鈣泵和鈣交換器。在許多類型癌細(xì)胞,鈣信號(hào)相關(guān)蛋白表達(dá)異常和激活,有助于癌細(xì)胞的惡性增殖。過(guò)去十年中,有研究表明在致癌金屬鎳誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞EMT過(guò)程中,以及幾種因子或缺氧環(huán)境誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生EMT,需要鈣離子信號(hào)的參與。細(xì)胞鈣信號(hào)形成是膜上鈣離子通道在各種刺激因素作用下打開(kāi),胞外的鈣離子內(nèi)流,激活鈣的效應(yīng)器和敏感激酶及下游信號(hào)分子,從而介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄等細(xì)胞周期和增殖必要的分子事件。鈣離子通道包括電壓門控通道(voltage operated calcium channel, VOCC)、蓄積釋放操控鈣離子通道(storage operated calcium channel, SOCC)和受體操控鈣離子通道(receptor operated calcium channel, ROCC)。在腫瘤細(xì)胞,鈣通道蛋白異常表達(dá)有助于癌細(xì)胞的惡性生長(zhǎng)。如T型VGCC發(fā)現(xiàn)在食管癌細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用,L型VGCC在結(jié)腸癌表達(dá)水平升高。瞬時(shí)受體電位(transient receptor potential, TRP)通道蛋白家族中部分成員參與細(xì)胞膜SOCC和ROCC通道構(gòu)成。近十多年研究發(fā)現(xiàn)其家族成員在人類腫瘤中表達(dá)異常,成為鈣通道與腫瘤發(fā)展關(guān)系的研究熱點(diǎn)。瞬時(shí)受體電位(transient receptor potential, TRP)通道廣泛分布于多種哺乳動(dòng)物系統(tǒng)組織,參與調(diào)節(jié)各種細(xì)胞功能。根據(jù)其序列的相似性,TRP超家族可分為7個(gè)亞家族：TRPC (canonical), TRPV(vanilloid), TRPM (melastatin), TRPN (Drosophila NOMPC), TRPA (ankyrin), TRPML (mucolipin)和TRPP (polycystin)。而每一個(gè)亞家族又含有7個(gè)成員。越來(lái)越多的證據(jù)表明TRP通道分子在癌組織異常表達(dá),并通過(guò)調(diào)節(jié)鈣離子內(nèi)流及激活下游信號(hào),參與癌癥的發(fā)展,如增殖,轉(zhuǎn)移,侵襲和藥物抵抗等方面。TRPC3和TRPC6在分子序列上有75%同源性,而且已有報(bào)道在介導(dǎo)細(xì)胞外的鈣內(nèi)流功能方面有互補(bǔ)作用。TRPC6已被證明與人類神經(jīng)細(xì)胞膠質(zhì)瘤、肝癌、乳腺癌和前列腺癌細(xì)胞增殖相關(guān),而TRPC3在卵巢癌組織表達(dá)增高,涉及癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。在肺癌,有調(diào)查表明TRPC3表達(dá)與腺癌患者的預(yù)后相關(guān),但作者并未對(duì)相關(guān)的機(jī)制做進(jìn)一步的研究。而另一個(gè)研究表明TRPC家族成員可能參與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞分化。最近在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞誘導(dǎo)EMT轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭邪l(fā)現(xiàn)間質(zhì)狀態(tài)癌細(xì)胞中TRPC3在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)增高。然而,關(guān)于這種間質(zhì)狀態(tài)表達(dá)增高在癌細(xì)胞生長(zhǎng)中功能還未知曉。本研究中,我們擬先在細(xì)胞水平上檢測(cè)TRPC3通道在上皮狀態(tài)和間質(zhì)狀態(tài)細(xì)胞系之間的表達(dá)差異,進(jìn)一步檢測(cè)其在癌細(xì)胞生長(zhǎng)方面發(fā)揮的作用以及對(duì)活體成瘤的影響,并分析在癌細(xì)胞生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用的MAPK-ERK和PI3K-AKT信號(hào)通路是否參與TRPC3通道調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的生長(zhǎng),以及抑制TRPC3通道是否會(huì)影響EMT標(biāo)志分子表達(dá)。最后,我們用非小細(xì)胞肺癌患者組織芯片上驗(yàn)證是否TRPC3分子在間質(zhì)狀態(tài)癌組織上表達(dá)增高以及與患者臨床信息有無(wú)關(guān)系。為鑒定TRPC3通道分子作為癌組織發(fā)生EMT的NSCLC患者的治療靶分子提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究目的：(1)選用永生化的人類支氣管上皮細(xì)胞16HBE和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、H460、H1299和95D,用Western-blot檢測(cè)上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-鈣粘連蛋白(E-Cadherin)和間質(zhì)標(biāo)志分子波紋蛋白(vimentin)的表達(dá),鑒定這些細(xì)胞系的上皮和間質(zhì)狀態(tài)狀態(tài)。(2)在5個(gè)細(xì)胞系,用real time RT-PCR檢測(cè)TRP通道分子mRNA的表達(dá)變化,包括有TRPM1, TRPM7, TRPM8, TRPC1, TRPC3, TRPC4 和 TRPC6。在轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)TRPC3在間質(zhì)和上皮兩種狀態(tài)間存在表達(dá)差異,同時(shí)鑒定其他與癌癥相關(guān)的TRP通道是否也有相似變化。在此基礎(chǔ)上,用Western-blot檢測(cè)在兩種狀態(tài)癌細(xì)胞間存在差異的TRPC3蛋白表達(dá)水平,并進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)表達(dá)定位檢測(cè)。(3)構(gòu)建發(fā)夾RNA (short hairpin RNA, shRNA)質(zhì)粒,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染癌細(xì)胞,下調(diào)TRPC3通道分子表達(dá),和用特異阻斷劑抑制通道來(lái)檢測(cè)該通道對(duì)癌細(xì)胞體外增殖,周期及相關(guān)周期蛋白表達(dá),和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響,以及對(duì)用刺激物誘導(dǎo)細(xì)胞外的鈣離子內(nèi)流的影響。(4)抑制TRPC3通道,檢測(cè)MAPK-ERK和PI3K-AKT通路中ERK和AKT蛋白磷酸化,鑒定TRPC3通道是否影響這兩條信號(hào)通路。并進(jìn)一步用抑制劑分別或聯(lián)合阻斷MAPK-ERK和PI3K-AKT通路,分析細(xì)胞周期。鑒定TRPC3通道影響癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用中是否有這兩條通路的參與。(5)用裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)通道抑制后對(duì)癌細(xì)胞在皮下成瘤生長(zhǎng),及瘤體組織中相關(guān)信號(hào)通路分子磷酸化、周期蛋白、EMT標(biāo)志分子E-Cadherin和vimentin表達(dá)的影響。(6)檢測(cè)NSCLC病人組織E-Cadherin、vimentin、TRPC3通道分子的表達(dá)。根據(jù)上皮和間質(zhì)標(biāo)志分子表達(dá)水平將病人組織分為上皮狀態(tài)癌和間質(zhì)狀態(tài)癌,分析通道分子表達(dá)水平在兩類狀態(tài)癌組織的差異。并與病人的臨床資料做進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析,尋找與癌癥惡性有關(guān)的信息。研究方法：(1)細(xì)胞系鑒定：實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H460和H1299在美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)網(wǎng)站上有原始細(xì)胞系的短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat, STR)圖譜,我們將這三株細(xì)胞送南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)鑒定中心做STR測(cè)序,與原始圖譜比對(duì),鑒定細(xì)胞是否有錯(cuò)誤識(shí)別和交叉污染。(2)化學(xué)合成shRNA序列,用pSilencerTM puro試劑盒中提供的載體構(gòu)建干擾質(zhì)粒,電穿孔轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞,嘌呤霉素篩選建立穩(wěn)定干擾癌細(xì)胞株(shNC, shC3i1和shC3i.2)。(3)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞TRP通道的mRNA相對(duì)表達(dá)量,以及鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shRNA質(zhì)粒的H1299細(xì)胞TRPC亞家族成員的mRNA表達(dá)狀況。(4)用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)細(xì)胞系和裸鼠腫瘤組織的上皮和間質(zhì)標(biāo)志分子、各細(xì)胞系中TRPC3基礎(chǔ)表達(dá)量和干擾后蛋白表達(dá)水平、周期蛋白的表達(dá),以及磷酸化ERK和AKT蛋白。(5)用細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)TRPC3通道分子在細(xì)胞中表達(dá)定位。(6)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：用噻唑藍(lán)比色法(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide, MTT)檢測(cè)癌細(xì)胞增殖及在阻斷或干擾目的TRPC3通道情況下對(duì)增殖的抑制作用。用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)通道抑制對(duì)癌細(xì)胞惡性增殖的影響。(7)細(xì)胞周期檢測(cè)：用碘化丙啶(1propidium iodide, PI)染細(xì)胞核,流式細(xì)胞儀檢測(cè)目的TRPC3通道抑制對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程的影響。(8)細(xì)胞鈣內(nèi)流實(shí)驗(yàn)：用綠色熒光染料Fluo-4/AM染色細(xì)胞內(nèi)外鈣離子,鈣內(nèi)流影像圖用FV10-ASW 1.7 viewer軟件在激光共聚焦顯微鏡下記錄。(9)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)：5-7周齡裸鼠皮下注射1×107個(gè)細(xì)胞,檢測(cè)成瘤的大小和重量來(lái)反映TRPC3通道抑制對(duì)癌細(xì)胞活體成瘤的能力和生長(zhǎng)的影響。(10)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)：用傷口劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)來(lái)鑒定抑制TRPC3通道對(duì)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。(11)人類NSCLC組織芯片檢測(cè)：用免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistry, IHC)檢測(cè)組織上E-cadherin, vimentin和目的TRPC3通道分子表達(dá)水平。根據(jù)染色深度和染色細(xì)胞比例判斷染色等級(jí)。用E-cadherin 和 vimentin表達(dá)將癌組織分為上皮型和間質(zhì)型兩類,比較兩類癌組織中TRPC3高表達(dá)的比率。(12)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)資料的統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)于計(jì)量數(shù)據(jù)資料用Shapiro-Wilk法進(jìn)行數(shù)據(jù)的正態(tài)性檢驗(yàn),符合正態(tài)分布計(jì)量資料均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述。兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用q檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料率之間比較采用卡方檢驗(yàn),間質(zhì)和上皮狀態(tài)癌組織患者資料與TRPC3通道表達(dá)水平之間關(guān)系分析采用Fisher確切概率法。所有統(tǒng)計(jì)分析均為雙側(cè)檢驗(yàn),P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果：(1)細(xì)胞系EMT標(biāo)志分子檢測(cè)Western blot檢測(cè)上皮和間質(zhì)標(biāo)志分子條帶,16HBE和A549細(xì)胞表達(dá)上皮標(biāo)志E-cadherin, H460、H1299和95D細(xì)胞未見(jiàn)顯影；而H1299細(xì)胞和95D細(xì)胞表達(dá)間質(zhì)標(biāo)志vimentin,其他三個(gè)細(xì)胞未見(jiàn)顯影。定量分析結(jié)果顯示16HBE細(xì)胞的E-cadherin相對(duì)表達(dá)量高于其他四個(gè)細(xì)胞系,A549的表達(dá)量低于16HBE,而高于H460、H1299和95D細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；16HBE、A549和H460細(xì)胞的vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量無(wú)差異(P0.05),而顯著低于H1299和95D細(xì)胞的表達(dá)水平(P0.05)。(2)細(xì)胞系TRP通道的mRNA表達(dá)TRPC3通道在四個(gè)癌細(xì)胞的mRNA表達(dá)相對(duì)16HBE增高,在四個(gè)癌細(xì)胞間,其中H1299和95D細(xì)胞表達(dá)無(wú)差異,高于H460細(xì)胞,而H460細(xì)胞又高于A549,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。同時(shí)檢測(cè)的其他TRP通道分子,發(fā)現(xiàn)在5個(gè)細(xì)胞系間的表達(dá)變化與EMT變化無(wú)相關(guān)性。(3)細(xì)胞系TRPC3通道蛋白表達(dá)考慮商業(yè)化抗體的特異性問(wèn)題,先用HEK293細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染T3-IRES質(zhì)粒(TRPC3野生型)來(lái)確定條帶位置。然后對(duì)5個(gè)肺細(xì)胞系樣本檢測(cè),結(jié)果顯示,在16HBE、A549和H460細(xì)胞顯影較弱,而H1299和95D細(xì)胞有較強(qiáng)顯影。定量分析表明,H1299和95D細(xì)胞TRPC3蛋白表達(dá)高于另外三個(gè)細(xì)胞系(P0.05)。用免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TRPC3表達(dá)主要定位在細(xì)胞膜。(4)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shRNA的H1299細(xì)胞干擾效率鑒定用shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞,shC3i.1和shC3i.2細(xì)胞TRPC3的mRNA表達(dá)相對(duì)shNC細(xì)胞分別下降了75%和80%,蛋白表達(dá)水平分別下降了63.%和65%(P0.05)。(5)抑制TRPC3通道對(duì)H1299細(xì)胞在誘導(dǎo)鈣內(nèi)流的影響用TRPC3/C6通道的直接激活劑1-油�；�-2-乙�；�-sn-甘油(1-oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol, OAG),或胎牛血清刺激細(xì)胞,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)瞬時(shí)的鈣升高,然后逐步下降,維持在一個(gè)比起始鈣濃度較高水平。而阻斷TRPC3通道或下調(diào)分子表達(dá)使瞬時(shí)峰值及平臺(tái)水平值較對(duì)照組低(P0.05)。(6)抑制TRPC3通道對(duì)癌細(xì)胞增殖的影響分別用不同濃度的TRPC3通道特異抑制劑Pyr3處理4個(gè)非NSCLC細(xì)胞,MTT檢測(cè)結(jié)果顯示在藥物劑量1、3和5uM三個(gè)劑量處理下,H1299和95D細(xì)胞增殖顯著低于A549和H460細(xì)胞(P0.05)。用3uM濃度的Pyr3處理H1299細(xì)胞,在加藥后第2-6天,增殖均顯著低于對(duì)照組細(xì)胞(P0.05)。MTT檢測(cè)兩個(gè)穩(wěn)定干擾細(xì)胞株在鋪板后從第2天至第7天增殖均低于shNC細(xì)胞�？寺⌒纬蓪�(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示干擾組的細(xì)胞克隆數(shù)少于對(duì)照組(P0.05)。而在shC3i.1細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染T3-IRES質(zhì)粒,TRPC3表達(dá)恢復(fù),也使細(xì)胞增殖恢復(fù)到和shNC細(xì)胞的增殖相同水平。(7)抑制TRPC3通道對(duì)H1299細(xì)胞周期影響結(jié)果顯示加阻斷劑和穩(wěn)定干擾組的S期細(xì)胞的比例均較shNC細(xì)胞降低,而G0-G1期細(xì)胞比例增高(P0.01)。G1-S期轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮重要作用的周期蛋白D1(cyclin D1)表達(dá)亦降低。而瞬時(shí)轉(zhuǎn)染T3質(zhì)粒的shC3i.1細(xì)胞周期進(jìn)程和cyclin D1蛋白表達(dá)均得到恢復(fù)。(8)抑制TRPC3通道對(duì)ERK和AKT活力的影響 shC3i.1和shC3i.2細(xì)胞的p-AKT和p-ERK表達(dá)均下降,而3uM濃度Pyr3處理的H1299細(xì)胞在有血清培養(yǎng)條件下的兩個(gè)分子磷酸化都被抑制,而在無(wú)血清培養(yǎng)條件下的p-AKT下降,p-ERK表達(dá)未見(jiàn)明顯變化。用Pyr3處理的A549細(xì)胞,AKT和ERK磷酸化作用未見(jiàn)明顯變化。(9)ERK和AKT通路與細(xì)胞周期的關(guān)系用兩個(gè)信號(hào)通路的抑制劑(U0126和LY294002)單獨(dú)或聯(lián)合處理H1299細(xì)胞,EKT和AKT在各自抑制劑作用下,蛋白磷酸化下降,而G0-G1期細(xì)胞百分比在升高,S期百分比下降(P0.01)。(10)抑制TRPC3通道對(duì)裸鼠成瘤及瘤體組織中相關(guān)蛋白表達(dá)影響 出生后6周左右裸鼠右側(cè)皮下接種107個(gè)細(xì)胞,包括shNC, shNC+Pyr3, shC3i.1和shC3i.2四個(gè)組別。從21-35天,腫瘤體積在阻斷通道或下調(diào)TRPC3表達(dá)的三個(gè)組都低于shNC組(P0.05)。第36d處死小鼠,瘤體組織稱重結(jié)果顯示在shNC+Pyr3,shC3i.1和shC3i.2三個(gè)組間無(wú)差異,都比shNC組低(P0.05)。進(jìn)一步檢查p-AKT, p-ERK, cyclin D1, E-cadherin 和 vimentin的表達(dá),以p-actin為內(nèi)參,結(jié)果顯示磷酸化AKT及cyclin D1 和 vimentin的表達(dá)下調(diào)(P0.05),ERK磷酸化雖然在shC3i.2組有一定程度下調(diào),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義,而上皮標(biāo)志E-cadhenin表達(dá)無(wú)變化。(11)抑制TRPC3通道對(duì)H1299和95D細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在劃痕后48h,添加Pyr3的細(xì)胞劃痕愈合較對(duì)照組細(xì)胞慢。向中心的移動(dòng)距離小于對(duì)照組細(xì)胞(P0.05)。Transwell轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示干擾或添加Pyr3組的細(xì)胞數(shù)少于對(duì)照組細(xì)胞數(shù)(P0.05)。(12)TRPC3通道分子在非小細(xì)胞肺癌病人組織中的表達(dá)及意義 根據(jù)E-cadherin 和 vimentin染色強(qiáng)度將患者組織分為上皮狀態(tài)和間質(zhì)狀態(tài)兩類,各有39例和36例。TRPC3染色強(qiáng)度在2-3級(jí)的組織樣本在兩種狀態(tài)癌組織中分別為占33.3%和63.9%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。TRPC3表達(dá)水平與總肺癌病例以及間質(zhì)狀態(tài)肺癌病例的病理分級(jí)相關(guān)(P0.01,P0.05),與上皮狀態(tài)肺癌病例的臨床分期無(wú)關(guān)(／0.05)。在TRPC3表達(dá)水平與患者年齡、性別、組織學(xué)類型、腫瘤大小和T分期之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)系(P0.05)。研究結(jié)論：(1)檢測(cè)上皮和間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志分子來(lái)鑒定細(xì)胞系的狀態(tài)。支氣管上皮細(xì)胞16HBE為對(duì)照,4個(gè)癌細(xì)胞系中A549表達(dá)上皮標(biāo)志分子,未見(jiàn)間質(zhì)標(biāo)志分子表達(dá),為上皮狀態(tài)癌細(xì)胞；H460、H1299和95D上皮標(biāo)志分子表達(dá)缺失,為發(fā)生EMT的癌細(xì)胞,其中H1299和95D細(xì)胞間質(zhì)標(biāo)志分子表達(dá)陽(yáng)性。(2)對(duì)細(xì)胞系TRP通道m(xù)R_NA表達(dá)量檢測(cè)。結(jié)果顯示TRPC3表達(dá)在癌細(xì)胞系相對(duì)16HBE細(xì)胞增高,其中以間質(zhì)標(biāo)志分子表達(dá)陽(yáng)性的H1299和95D細(xì)胞表達(dá)水平最高。其他TRP通道分子未見(jiàn)與癌細(xì)胞EMT有相似變化。而TRPC3通道蛋白在上述兩個(gè)間質(zhì)狀態(tài)癌細(xì)胞表達(dá)亦增高。(3)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明阻斷TRPC3通道對(duì)間質(zhì)狀態(tài)的H1299細(xì)胞增殖有抑制作用,可能是通過(guò)抑制胞外的鈣離子內(nèi)流,調(diào)節(jié)AKT和ERK生長(zhǎng)信號(hào)通路,抑制cyclin D1表達(dá),使癌細(xì)胞不能順利通過(guò)G1期,從而影響細(xì)胞DNA復(fù)制和倍增。(4)瘤體組織細(xì)胞的上皮和間質(zhì)標(biāo)志分子檢測(cè)結(jié)果表明抑制TRPC3通道并不能直接逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生的EMT,但阻斷通道能中等程度抑制間質(zhì)標(biāo)志分子vimer tin表達(dá)。另外,與EMT相關(guān)的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移特性,我們發(fā)現(xiàn)阻斷TRPC3通道后,癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移都受到一定程度的抑制。(5)NSCLC患者組織檢查結(jié)果表明TRPC3通道在間質(zhì)狀態(tài)癌組織相對(duì)上皮狀態(tài)癌組織中表達(dá)增高,而且與該類型癌癥患者的病理分級(jí)相關(guān)。(6)在細(xì)胞系和癌癥組織,TRPC3通道分子都在間質(zhì)狀態(tài)癌的表達(dá)增高,抑制該通道使細(xì)胞阻滯在G0-G1期,細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制,而且能中度下調(diào)間質(zhì)標(biāo)志分子的表達(dá),抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。這些結(jié)果都表明TRPC3通道是間質(zhì)狀態(tài)NSCLC癌細(xì)胞的生長(zhǎng)相關(guān)分子,或許能作為此類型肺癌患者治療的目的分子。
【關(guān)鍵詞】：非小細(xì)胞肺癌 間質(zhì)狀態(tài) 瞬時(shí)受體電位通道3 增殖 周期
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R734.2
【目錄】：

• 摘要3-13
• ABSTRACT13-27
• 第1章 前言27-32
• 第2章 材料和方法32-67
• 2.1 材料32-41
• 2.2 方法41-67
• 第3章 結(jié)果67-89
• 3.1 細(xì)胞系EMT標(biāo)志分子檢測(cè)67-68
• 3.2 細(xì)胞系TRP通道的mRNA表達(dá)檢測(cè)68-69
• 3.3 細(xì)胞系TRPC3蛋白表達(dá)和定位69-72
• 3.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shRNA的干擾效率72-73
• 3.5 抑制TRPC3通道對(duì)細(xì)胞鈣內(nèi)流的影響73-75
• 3.6 抑制TRPC3通道對(duì)細(xì)胞增殖的影響75-78
• 3.7 抑制TRPC3通道對(duì)細(xì)胞周期的影響78-80
• 3.8 抑制TRPC3通道對(duì)MAPK/ERK和PI3K/AKT通路的影響80-81
• 3.9 MAPK/ERK和PI3K/AKT通路涉及細(xì)胞周期G1-S期轉(zhuǎn)化81-82
• 3.10 抑制TRPC3通道對(duì)H1299細(xì)胞成瘤及瘤體組織中相關(guān)分子表達(dá)的影響82-85
• 3.11 抑制TRPC3通道對(duì)H1299和95D細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響85-86
• 3.12 NSCLC病人組織中EMT標(biāo)志分子和TRPC3的表達(dá)86-88
• 3.13 TRPC3表達(dá)與病人臨床參數(shù)之間的關(guān)系88-89
• 第4章 討論89-99
• 第5章 結(jié)論99-101
• 參考文獻(xiàn)101-113
• 攻讀博士期間發(fā)表論著113-114
• 致謝114-116
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)審稿證明116

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本文編號(hào)：563427