本文關(guān)鍵詞：microRNA-21在骨肉瘤細(xì)胞MG63中作用機(jī)制的研究

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【摘要】：背景骨肉瘤是一種高度惡性的骨腫瘤,死亡率高,常發(fā)生于兒童或者青少年。盡管近幾十年來,骨肉瘤治療技術(shù)的不斷進(jìn)步,如手術(shù)治療,假體置換,聯(lián)合化療等,但是骨肉瘤患者的預(yù)后仍然不理想。骨肉瘤的早期轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、藥物抵抗以及其它繼發(fā)性腫瘤仍然是廣大醫(yī)務(wù)人員面臨的難題。因此,了解骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲以及凋亡的信號通路對于獲得更加有效的治療顯得尤為重要。Micro RNAs(mi RNAs)是一類內(nèi)源性的非編碼小RNA分子,約20~25個核苷酸大小,廣泛存在于真核生物,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控可能的靶m RNAs。mi RNAs在很多腫瘤中異常表達(dá),它們與腫瘤相關(guān)的進(jìn)程密切相關(guān)。大量研究發(fā)現(xiàn)mi RNAs在不同的生物進(jìn)程中起著癌基因或抑癌基因的作用。因此,越來越多的關(guān)于mi RNAs對腫瘤相關(guān)進(jìn)程影響的研究正在進(jìn)行。研究發(fā)現(xiàn)micro RNA-21(mi R-21)在很多腫瘤中通常起著癌基因的作用,在很多腫瘤中通常呈高表達(dá)。然而,有關(guān)mi R-21在骨肉瘤中所起作用的研究并不十分明確。因此,本實驗以mi R-21作為主要研究目標(biāo),研究其在骨肉瘤細(xì)胞MG63增殖、侵襲以及凋亡中的所起的作用以及可能的作用機(jī)制。目的通過對mi R-21在骨肉瘤細(xì)胞MG63中功能的研究,探討mi R-21對骨肉瘤細(xì)胞MG63的調(diào)節(jié)機(jī)制,為臨床骨肉瘤的治療提供一種新的思路。方法(1)本實驗通過轉(zhuǎn)染人工合成的寡核苷酸片段(mi R-21抑制物:anti-21;mi R-21模擬物:mi-21;無關(guān)序列:Scr)來調(diào)節(jié)mi R-21在骨肉瘤細(xì)胞MG63中表達(dá)水平,進(jìn)而研究mi R-21在骨肉瘤細(xì)胞MG63中所起的作用。通過實時定量PCR技術(shù)檢測mi R-21在骨肉瘤細(xì)胞MG63中表達(dá)水平的差異。以未轉(zhuǎn)染的MG63細(xì)胞(blank組)作為對照。(2)通過上調(diào)及下調(diào)mi R-21在骨肉瘤細(xì)胞MG63中的表達(dá)水平來研究骨肉瘤細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞周期、侵襲能力以及細(xì)胞凋亡。(3)通過調(diào)節(jié)mi R-21在骨肉瘤細(xì)胞MG63中表達(dá),來研究mi R-21與骨肉瘤細(xì)胞對順鉑耐藥性的關(guān)系。(4)采用mi RNA基因組數(shù)據(jù)庫來驗證mi R-21在骨肉瘤細(xì)胞MG63中調(diào)節(jié)靶基因PDCD4的表達(dá)水平。通過生物信息學(xué)技術(shù)(Pic Tar,mi Randa,Target Scan)尋找以PDCD4編碼或非編碼序列為靶基因的mi RNAs。(5)為進(jìn)一步驗證在骨肉瘤細(xì)胞MG63中mi R-21和PDCD4表達(dá)水平的關(guān)系,采用實時定量PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染mi R-21模擬物、mi R-21抑制劑后PDCD4-m RNA的水平,Western blotting觀察PDCD4蛋白水平的變化。(6)通過構(gòu)建熒光報告基因進(jìn)一步驗證PDCD4是mi R-21的靶基因。同時采用免疫組織印染技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染mi R-21模擬物、mi R-21抑制劑后PDCD4的表達(dá)。結(jié)果(1)實時定量PCR檢測mi R-21的表達(dá),結(jié)果表明轉(zhuǎn)染mi R-21抑制劑后,與blank組相比顯著抑制了mi R-21的表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染mi R-21模擬物后,與blank組相比顯著上調(diào)了mi R-21的表達(dá)水平(P0.05)。(2)上調(diào)mi R-21的表達(dá)水平后,與blank組相比細(xì)胞生長能力增強(qiáng),下調(diào)mi R-21的表達(dá)水平后,細(xì)胞生長受抑制。流式細(xì)胞學(xué)檢測細(xì)胞周期結(jié)果顯示:上調(diào)mi R-21的表達(dá)水平后,與blank組比較,細(xì)胞均增殖能力增強(qiáng),并且呈現(xiàn)較低的G0/G1期細(xì)胞比率和較高的S期細(xì)胞比率。與之相反的是,下調(diào)mi R-21的表達(dá)水平后,細(xì)胞增殖能力受抑制,并且呈現(xiàn)較高的G0/G1期細(xì)胞比率和較低的S期細(xì)胞比率。無關(guān)序列轉(zhuǎn)染組(Scr組)與blank組無明顯差異。G2/M期各組細(xì)胞比率無統(tǒng)計學(xué)差異。以上結(jié)果表明mi R-21可以誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞MG63的增殖。流式細(xì)胞凋亡實驗顯示:上調(diào)mi R-21的表達(dá)水平后,與blank組比較,顯著降低了細(xì)胞凋亡率,而下調(diào)mi R-21的表達(dá)水平后,顯著增加了細(xì)胞凋亡率。Scr組與blank組無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。細(xì)胞侵襲試驗顯示:轉(zhuǎn)染anti-21后,與blank組相比較細(xì)胞侵襲能力顯著受抑制,而轉(zhuǎn)染mi-21后,細(xì)胞侵襲能力顯著增強(qiáng)。Scr組與blank組無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。以上結(jié)果進(jìn)一步證明了mi R-21是促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞侵襲能力的重要因子。(3)通過轉(zhuǎn)染mi-21、anti-21調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)mi R-21表達(dá)水平,來研究mi R-21與骨肉瘤細(xì)胞MG63對順鉑耐藥性的關(guān)系。(4)生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測mi RNAs靶向作用于PDCD4的編碼或非編碼序列顯示人類基因PDCD4的3′-UTR區(qū)域包含mi R-21的靶位點。(5)Western Blotting結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染mi-21后,內(nèi)源性的PDCD4條帶較blank組明顯減弱,實時定量PCR顯示內(nèi)源性的PDCD4-m RNA表達(dá)水平明顯降低。而轉(zhuǎn)染anti-21后,結(jié)果與轉(zhuǎn)染mi-21相反。(6)熒光報告基因顯示轉(zhuǎn)染mi-21后構(gòu)建的熒光報告基因載體p MIR-PDCD4-3'-UTR活性明顯降低,免疫組織化學(xué)顯示細(xì)胞膜PDCD4蛋白染色減弱同時伴隨細(xì)胞的高增殖性。而轉(zhuǎn)染anti-21后呈現(xiàn)相反的結(jié)果。結(jié)論(1)轉(zhuǎn)染mi-21或anti-21可以顯著上調(diào)或下調(diào)骨肉瘤細(xì)胞MG63的mi R-21表達(dá)水平。(2)mi-21可以顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖、增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲能力并且降低細(xì)胞凋亡,anti-21可以顯著降低細(xì)胞增殖、減弱細(xì)胞的侵襲能力并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果提示mi R-21在骨肉瘤細(xì)胞MG63中起癌基因的作用。(3)改變細(xì)胞內(nèi)mi R-21表達(dá)水平可以影響骨肉瘤細(xì)胞對順鉑的耐受性。(4)PDCD4蛋白水平與mi R-21表達(dá)水平在很多腫瘤中呈負(fù)相關(guān),在骨肉瘤細(xì)胞MG63中PDCD4-m RNA也是mi R-21的一個直接功能靶基因。mi R-21通過下調(diào)PDCD4表達(dá)水平在骨肉瘤細(xì)胞中起著癌基因的作用。
【關(guān)鍵詞】：microRNA-21 骨肉瘤 MG63 作用機(jī)制 細(xì)胞增殖 細(xì)胞周期 侵襲 凋亡
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R738.1
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-14
• 前言14-16
• 文獻(xiàn)回顧16-25
• 實驗一 mi R-21在骨肉瘤細(xì)胞MG63 中的表達(dá)25-34
• 1 材料25-27
• 2 方法27-30
• 3 結(jié)果30-32
• 4 討論32-34
• 實驗二 mi R-21 對骨肉瘤細(xì)胞MG63 生物學(xué)特性的影響34-44
• 1 材料34-35
• 2 方法35-38
• 3 結(jié)果38-42
• 4 討論42-44
• 實驗三 mi R-21 對骨肉瘤細(xì)胞MG63 順鉑耐藥性的研究44-50
• 1 材料44-45
• 2 方法45-46
• 3 結(jié)果46-48
• 4 討論48-50
• 實驗四 mi R-21 在骨肉瘤細(xì)胞MG63 中靶向調(diào)節(jié)PDCD4 的表達(dá)50-70
• 1 材料50-54
• 2 方法54-64
• 3 結(jié)果64-68
• 4 討論68-70
• 小結(jié)70-72
• 參考文獻(xiàn)72-82
• 個人簡歷和研究成果82-84
• 致謝84

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本文編號：536938