本文關鍵詞：1、NF-κB抑制劑倍半萜內酯對糖尿病小鼠腎組織胰島素抵抗改善的分子機制初探 2、碘海醇清除率在慢性腎臟病兒童腎功能評價方面的應用研究

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【摘要】：研究背景：糖尿病腎病(DN)是糖尿病的嚴重并發(fā)癥,目前仍以較晚期的降壓、降糖治療為主,缺乏針對其早期發(fā)病機制的深入研究及干預措施。目前針對糖尿病腎病發(fā)病機制的研究主要集中在多元醇及蛋白激酶C通路激活,糖基化終末產物累積以及炎癥信號通路活化等方面。而這些因素與胰島素抵抗(insulin resistance,IR)密不可分。但目前關于IR在糖尿病腎病中的具體表現(xiàn)形式及針對IR干預措施的研究相對較少。AS160是一種Rab-GTP酶活化蛋白,可以調控包括葡萄糖轉運體在內的多種物質轉運蛋白的胞內轉位過程。在腎臟,AS160被發(fā)現(xiàn)可以調控鈉、水通道蛋白的轉運,但對于腎臟糖轉運蛋白的調控未見報道。葡萄糖轉運體4(GLUT4)是介導胰島素刺激的糖攝取的主要糖轉運體,是胰島素信號通路的重要效應器,與IR密切相關。在經典胰島素敏感組織如骨骼肌和脂肪細胞中,AS160被發(fā)現(xiàn)是糖代謝胰島素信號通路中GLUT4的上游分子,其磷酸化形式可促進GLUT4囊泡的轉運過程,與GLUT4的功能密不可分。研究已表明,條件性敲除骨骼肌或脂肪細胞GLUT4及AS160可導致全身和局部組織的IR。近端腎小管上皮細胞鈉葡萄糖轉運體1(SGLT1)和鈉葡萄糖轉運體2(SGLT2)通過重吸收葡萄糖對維持機體糖穩(wěn)態(tài)有重要作用,已成為新型降糖藥物的靶點。因此,針對糖尿病腎組織中AS160與糖轉運體GLUT4及SGLT1/SGLT2的研究有助于探索腎臟IR的分子機制,以期為早期干預糖尿病腎損害和改善DN預后提供可能的分子靶點。我們前期研究結果顯示,NF-KB抑制劑倍半萜內酯(PTN)可以改善糖尿病小鼠全身IR及腎臟病理損傷,其是否對腎臟IR有作用及可能的機制尚未見報道。研究目的：在db/db糖尿病腎病小鼠基礎上研究糖尿病腎組織是否存在AS160與糖轉運體GLUT4及SGLT1/SGLT2導致的胰島素抵抗。了解NF-KB抑制劑PTN是否可以改善糖尿病腎組織IR,進而延緩DN進展。研究方法：建立db/db糖尿病腎病小鼠模型并設立PTN干預組。將小鼠分為三組：對照組(db/m+NS)、糖尿病腎病組(db/db+NS)、PTN干預組(db/db+PTN)。所有小鼠在8周齡開始進入實驗,分別在處理的T0(8周齡)、T4(12周齡)T8(16周齡)及T12(20周齡)留取血清、尿液及腎組織標本。利用實時定量PCR、免疫組化／熒光、免疫印跡(WB)等方法檢測小鼠AS160、p-AS160 (Thr642) 及糖轉運體GLUT4、SGLT1/SGLT2在糖尿病腎組織中的表達情況；對AS160/p-AS160與GLUT4、SGLT1/SGLT2進行共定位,初步探索AS160對腎臟糖轉運體的調控情況,了解AS160在糖尿病腎組織胰島素抵抗中的作用。研究結果：(1)db/db小鼠糖尿病腎病模型建立成功。自8周齡起,db/db小鼠體重即高于db/m小鼠。隨著周齡增加,db/db小鼠表現(xiàn)出尿蛋白增加,高血脂、高血糖、高胰島素血癥,以及腎小球肥大、系膜基質增多等生化和腎臟病理改變。(2)免疫組化和免疫熒光顯示AS160在腎臟有表達,主要表達在腎臟皮質和髓質的腎小管中,在腎小球的鮑曼氏囊上皮細胞側可見較弱的表達。AS160蛋白在db/m小鼠腎臟的表達不隨周齡增加而改變。而在db/db、鼠,AS160蛋白表達較db/m小鼠輕度增加。給予PTN干預后,兩組并無明顯差別。免疫組化測定db/db小鼠AS160蛋白水平表達：8w 1.22±0.26,12w 1.27±0.38,16w 1.35±0.25,20w1.22±0.30。給予PTN干預0周、4周、8周及12周后AS160蛋白表達為T0(8w)1.17±0.22,T4(12w)1.22±0.31,T8(16w)1.24±0.39,T12(20w)1.03±0.35。(3)免疫熒光顯示p-AS160 (phospho T642)主要分布在腎皮質小管的管腔側,在髓質腎小管的表達較弱,而在腎小球未見陽性表達。腎臟中p-AS160蛋白表達在db/db小鼠早期(8w)高于db/m小鼠,但隨著周齡的增加,其表達呈下降趨勢。給予db/db小鼠PTN干預后,p-AS160的下降趨勢有所改善。免疫組化顯示db/db小鼠腎臟p-AS160表達為：8w 1.55±0.30,12w 1.18±0.22,16w 1.06±0.20,20w0.98±0.18。給予PTN干預0周、4周、8周及12周后p-AS160表達為TO(8w)1.54±0.32,T4(12w)1.42±0.26,T8(16w)1.41±0.21,T12(20w)1.34±0.08。(4)免疫組化和免疫熒光結果顯示GLUT4同樣以腎小管為主要表達部位,皮質和髓質腎小管均有表達,腎小球未見陽性表達。GLUT4在db/m小鼠腎臟表達不隨周齡增加而改變；但在db/db小鼠,GLUT4無論是在mRNA水平還是在蛋白水平,均表現(xiàn)出早期(8周齡)升高,隨著周齡的增加,表達逐漸降低的趨勢。而PTN可以增加DN小鼠腎臟GLUT4的表達。GLUT4 mRNA與GLUT4蛋白在不同周齡db/db小鼠腎臟表達情況分別為：GLUT4mRNA水平8w 1.79±0.25,12w 1.32±0.33,16w 0.98±0.23,20w 1.00±0.12；GLUT4蛋白水平8w 1.32±0.28,12w 1.05±0.47,16w 0.85±0.10,20w 0.88±0.25。PTN干預db/db小鼠0周(TO)、4周(T4)、8周(T8)及12周(T12)后GLUT4蛋白表達分別為T0(8w)1.31±0.21,T4(12w)1.20±0.39,T8(16w)1.42±0.43,T12(20w)1.53±0.15。(5)免疫熒光共染顯示AS160及p-AS160 ((phospho T642)均與部分GLUT4在腎小管上皮細胞有共表達。雖然SGLT1/SGLT2主要表達在近端腎小管管腔側,但p-AS160與SGLT1僅有少量的共表達,與SGLT2在腎小管上皮細胞無共表達。研究結論：(1)db/db糖尿病腎病小鼠模型具有全身胰島素抵抗的特點,并伴有糖尿病腎病病理改變。給予PTN干預后可改善其全身全身胰島素抵抗情況及腎臟病理變化。(2)AS160及其功能形式p-AS160在腎臟有表達,以腎小管為主要表達部位。隨著DN小鼠周齡增加,p-AS160糖尿病腎組織的表達逐漸降低。(3)GLUT4在小鼠腎臟主要表達腎小管中,其在db/db小鼠腎臟表達呈降低趨勢。部分GLUT4與AS160及P-AS160在腎小管上皮細胞有共表達,提示腎臟可能存在AS160調控GLUT4轉運的物質基礎。(4)給予PTN干預后,糖尿病腎組織p-AS160與GLUT4表達增加,提示PTN可能通過增加糖轉運,改善糖尿病腎組織糖代謝及胰島素敏感性。(5) SGLT1/SGLT21與p-AS160(Thr 642)無明顯共表達,考慮AS160并不參與SGLT1/SGLT2的轉運調控或不是其主要調控蛋白。研究目的：準確評價兒童腎功能對兒童腎臟疾病早期診斷、早期治療具有重要意義。中國成人估算腎小球濾過率公式(eGFR)在臨床上的應用相對成熟，而國外兒童GFR估算公式在我國兒童人群中的應用并未得到驗證。目前我國關于兒童GFR測定方法的研究較少，我國仍缺乏一種準確評價兒童腎功能的方法。碘海醇血漿清除率已被證實是測定腎小球濾過率(GFR)的可靠方法，然而該方法在中國尚未被廣泛應用及推廣。本課題前期工作己建立利用高效液相色譜法(HPLC)測定血清碘海醇濃度的方法，該方法穩(wěn)定可靠。本研究擬在慢性腎臟病兒童中以99m7c-DTPA血漿清除率為參照評價碘海醇清除率評估兒童腎小球濾過率的準確性；評估單次采血法和干血濾紙片法在碘海醇清除率應用中的可行性。研究方法：設定HPLC色譜條件，建立碘海醇血清濃度測定的標準曲線，對標準曲線的線性、方法的精密度、真實性進行驗證。納入慢性腎臟病兒童33例(前期工作已納入12例，總共45例)，同時進行99mc-DTPA清除率與碘海醇血漿清除率測定，即分別在99mTc-DTPA和碘海醇注射后2h和4h以及2h和5h進行兩次采血測量99mTc-DTPA和碘海醇血漿清除率。評價兩種方法測得的腎小球濾過率的相關性和一致性。對碘海醇單次采血法(2h)與碘海醇雙次采血法(2h和5h)進行比較，評價單次采血的可行性。對13例患兒同時采用干血濾紙片法測定碘海醇清除率，并與碘海醇雙次采血法進行比較，評價干血斑濾紙片碘海醇清除率可行性。研究結果：(1)本研究建立的HPLC法側定碘海醇濃度在10～1000mg/L范圍內線性良好(R2=0.9998)，該方法的精密度、真實性較好(批間誤差與批內誤差RSD%5%,平均回收率R%96%)。(2)45例患兒均完成碘海醇血漿清除率測定。其中36例患兒同時完成99mTc-DTPA血漿清除率測定，13例患兒完成干血濾紙片碘海醇清除率測定。(3)碘海醇血漿清除率與99mTc-DTPA血漿清除率比較，兩者有很好的相關性(r=0.941,P0.01)，，兩者結果的差值較小，為(6.53±11.6)ml/(min. 1.73m2)。(4)單次采血與雙次采血測得的碘海醇清除率相關性為r=0.958,差值為(4.26±9.06)ml/(min. 1.73m2)。(5)干血濾紙片碘海醇清除率與血清碘海醇清除率比較,兩者相關性為r＝0.95,差值為(0.48±10.89)ml/(min. 1.73m2)。研究結論：碘海醇血漿清除率與99mTc-DTPA血漿清除率之間的相關性及一致性較好，是一種理想的評估腎功能的方法。單次采血法與千血濾紙片法使碘海醇清除率測定更簡便、可行。
【關鍵詞】：糖尿病腎病 胰島素抵抗 GLUT4 AS160 倍半萜內酯 碘海醇清除率 兒童 慢性腎臟病 腎小球濾過率
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R587.2
【目錄】：

• 英文縮略詞表6-7
• 課題1 NF-κB抑制劑倍半萜內酯對糖尿病小鼠腎組織胰島素抵抗改善的分子機制初探7-65
• 中文摘要7-9
• Abstract9-13
• 前言13-14
• 1 實驗材料和方法14-26
• 2 實驗結果26-46
• 2.1 db/db糖尿病腎病小鼠動物模型的建立26-28
• 2.2 db/db小鼠腎臟AS 160分布、表達變化及PTN對其影響28-31
• 2.3 db/db小鼠腎臟p-AS160(phospho Thr642)表達變化及PTN對其影響31-37
• 2.4 db/db小鼠腎臟GLUT4表達變化及PTN對其影響37-42
• 2.5 小鼠腎臟AS160/p-AS160與腎臟糖轉運體關系的研究42-46
• 3 討論46-48
• 4 結論48-49
• 5 參考文獻49-52
• 文獻綜述 AS160與GLUT4在胰島素抵抗、糖尿病腎病中的作用52-65
• 參考文獻59-65
• 課題2 碘海醇清除率在慢性腎臟病兒童腎功能評價方面的應用研究65-99
• 英文縮略詞表66-67
• 中文摘要67-68
• Abstract68-70
• 前言70-71
• 1 實驗材料和方法71-73
• 2 實驗結果73-79
• 2.1 HPLC方法測定血清碘海醇濃度標準曲線建立73-74
• 2.2 患兒一般資料74
• 2.3 ~(99m)Tc-DTPA血漿清除率與碘海醇血漿清除率比較74-76
• 2.4 碘海醇單次取血與碘海醇雙次取血血漿清除率比較76-77
• 2.5 干血濾紙片與血清碘海醇清除率比較77-79
• 2.6 碘海醇清除率安全性79
• 3 討論79-82
• 4 結論82
• 5 參考文獻82-85
• 文獻綜述 碘海醇清除率在慢性腎臟病兒童腎功能評價方面的應用研究85-99
• 參考文獻94-99
• 致謝99-100
• 個人簡歷100

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本文編號：534940