本文關(guān)鍵詞：孕期生殖道微生物組與不良妊娠結(jié)局的關(guān)聯(lián)

  更多相關(guān)文章： 孕婦 陰道菌群 細菌16S rRNA 菌型 胎膜早破

【摘要】：研究背景：生殖道菌群在女性一生的不同年齡段各具特征,其結(jié)構(gòu)組成與體內(nèi)雌激素、孕激素水平緊密相關(guān)。健康育齡期女性生殖道微生物群落結(jié)構(gòu)通�？梢詣澐譃槲宸N：CST Ⅰ, CSTⅡ, CST Ⅲ, CST Ⅳ和CST Ⅴ。而CST Ⅳ則是以多樣性菌屬為主,又可分為兩種亞類：CST Ⅳ-A和CST Ⅳ-B。妊娠期是育齡女性特殊的生理時期。妊娠期母體內(nèi)雌激素、孕激素發(fā)生了劇烈變化,雌激素最高峰期水平比非孕期上升了1000倍。受高濃度雌激素水平的影響,陰道上端1/3的表皮細胞生長、細胞內(nèi)糖原增多,乳酸的產(chǎn)量亦隨之增高,維持陰道較低的pH值,妊娠期生殖道菌群與陰道內(nèi)皮細胞、陰道分泌物形成一道天然屏障,共同促進母嬰健康。妊娠期除了激素水平的劇增,還包括眾多干擾因素對陰道菌群的影響,如：母體免疫狀態(tài)的改變、母體的體重增加、全身各大系統(tǒng)適應(yīng)性變化、胎兒發(fā)育、營養(yǎng)需求增加、藥物使用等。我們想了解在妊娠的不同時期,隨著孕周增長,生殖道菌群是否也隨之發(fā)生適應(yīng)性變化,孕期母體自身因素、環(huán)境改變、機能狀態(tài)的改變等是否會影響生殖道菌群的結(jié)構(gòu)。分娩過程中羊水、血液等對陰道進行了徹底的沖刷,同時體內(nèi)激素水平迅速下降,生殖道微生物必須適應(yīng)機體的變化,面臨重建微生態(tài)環(huán)境的過程。產(chǎn)后全身各系統(tǒng)(除乳房外),尤其是生殖系統(tǒng),因妊娠所引起的變化將逐步恢復到孕前狀態(tài),產(chǎn)后生殖道群落結(jié)構(gòu)是否也恢復到孕期狀態(tài),需要進一步研究。妊娠期生殖道菌群失調(diào)在臨床上最常見表現(xiàn)為細菌性陰道炎(Bacterial Vaginosis, BV)。BV的生殖道菌群是以乳酸桿菌(Lactobacillus spp.)豐富度降低,繼而由兼性厭氧菌或者絕對厭氧菌代替,菌群多樣性顯著增加。與BV密切相關(guān)的菌屬包括：Gardnerella(加德納菌屬),Anaerococcus (氣球菌屬),Corynebacterium(棒狀桿菌屬), Finegoldia(達芬戈爾德菌),Streptococcus(鏈球菌),Atopobium(奇異菌屬), Prevotella(普氏菌屬),Parvimonas(微單胞菌屬),Sneathia(纖毛菌屬),Mobiluncus(動彎桿菌屬),Peptoniphilus(吲哚嗜胨菌),BVAB1,BVAB2,BVAB3。BV可導致眾多妊娠不良結(jié)局如：胎膜早破(Premature rupture of membranes, PROM)、早產(chǎn)(Preterm birth, PTB)、低出生體重兒(Low birth weight)、絨毛膜炎(Chorioamnionitis)等,對孕婦和新生兒健康均產(chǎn)生了不利影響。與陰道細菌感染密切相關(guān),且又能影響圍產(chǎn)期母嬰健康的主要不良妊娠事件有胎膜早破和早產(chǎn),是新生兒病死率最主要和最常見的原因。近年來研究認為,孕期感染與胎膜早破和早產(chǎn)密切相關(guān)。胎膜早破指臨產(chǎn)前胎膜破裂,與羊膜腔感染、早產(chǎn)組成的與感染密切相關(guān)的綜合癥候群,是妊娠晚期的嚴重并發(fā)癥。傳統(tǒng)方法采用穿刺手段診斷胎膜早破,但是具有創(chuàng)傷性。目前,研究者致力于炎癥細胞因子與胎膜早破的關(guān)聯(lián),誤診率和漏診率較高。截止目前,臨床尚缺乏無創(chuàng)性診斷胎膜早破的金標準,快速、方便、準確診斷胎膜早破仍然是研究者面臨的挑戰(zhàn)。不良妊娠結(jié)局與母體個體差異、免疫狀態(tài)、營養(yǎng)、藥物、環(huán)境因素有關(guān)。由于研究者側(cè)重點差異,種族文化差異、是否納入了重要的影響因素,生殖道菌群與圍產(chǎn)期母嬰健康的關(guān)聯(lián)研究在該領(lǐng)域似乎沒有得到一致的結(jié)果。生殖道菌群與不良妊娠結(jié)局的關(guān)聯(lián),還需要更多的數(shù)據(jù)闡釋。研究目的：1.孕婦的生殖道不同采樣部位(宮頸、后穹窿、陰道下1/3)的菌群是否具有差異；2.觀察女性孕期生殖道菌群的特征及動態(tài)變化過程；3.了解產(chǎn)后42天生殖道菌群恢復情況；4.運用孕期生殖道菌屬信息結(jié)合元數(shù)據(jù)(臨床信息)預測不良妊娠結(jié)局。研究方法：第一章2012年12月～2013年01月,在南方醫(yī)院婦產(chǎn)科門診進行常規(guī)檢查,簽署知情同意書的情況下,納入志愿者共34人,分別是：非孕婦5人,孕早期6人(孕周14周),孕中期6人(孕14～28.6周),孕晚期12人(孕29～42周),產(chǎn)后5人,編號為S1～S34。由經(jīng)驗豐富的婦產(chǎn)科醫(yī)生,使用窺陰器撐開陰道,在肉眼直視下,使用一次性使用棉簽拭子,分別采集宮頸(Cervix, C)、后穹窿(Posterior fornix, P)、陰道下1/3 (Vaginal canal, V)三個部位的分泌物,每個部位采集三個平行樣品,共計306個樣品。采集的樣品暫時存放于生物樣品運輸箱,在4小時內(nèi)轉(zhuǎn)移至-80度低溫冰箱保存,直到提取樣品中細菌的總DNA。使用細菌16S通用引物,PCR擴增陰道拭子樣品的16S rRNA V46保守區(qū)。將PCR終產(chǎn)物經(jīng)過Illumina Hiseq 2000平臺進行PE100-bp測序后,得到高通量下機原始堿基序列,采用QIIME分析流程結(jié)合臨床信息分析數(shù)據(jù)。QIIME生物分析主要包括操作分類單元(Operational Taxonomy Units, OTU)的生成及主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)、假設(shè)驗證分析、進化樹分析及菌群特征性分析、菌屬豐富度分析、群落結(jié)構(gòu)多樣性分析、菌群間差異比較分析(LEfSe在線統(tǒng)計分析工具)等。采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標準差(Mean±S)表示;兩組之間均數(shù)比較采用兩樣本t檢驗,三組及以上均數(shù)比較采用One-way ANOVA,多個處理組兩兩比較用Bonfferonii比較,矯正檢驗水準。P0.05具有統(tǒng)計學顯著性差異。第二章2013年01月～12月,在南方醫(yī)院婦產(chǎn)科門診首次進行常規(guī)產(chǎn)科檢查,同意參與隊列研究,簽署知情同意書,經(jīng)過HCG、B超診斷等確診為宮內(nèi)妊娠的對象,根據(jù)末次月經(jīng)推算孕周,若孕周大小與主訴相差甚大,則以孕早期B超結(jié)果計算孕周。由經(jīng)驗豐富的婦產(chǎn)科醫(yī)生,使用窺陰器動作輕柔撐開陰道,在肉眼直視下,使用一次性棉簽拭子,采集后穹窿的分泌物,同時評估陰道分泌物的性狀、顏色、氣味、宮頸糜爛情況。使用一次性pH(3.8～5.5)精密試紙檢測陰道分泌物的酸堿度。采集樣品的同時,記錄每次孕婦的產(chǎn)檢信息,包括：入組時采集孕婦基本信息、產(chǎn)檢信息、全身各系統(tǒng)疾病、丈夫健康狀態(tài)、既往孕產(chǎn)史、既往生殖道患病史、用藥史、妊娠合并癥等。隨訪時查閱孕婦的陰道分泌物、臨床常規(guī)檢查資料。隊列隨訪完畢,通過檔案中心調(diào)閱孕婦的分娩結(jié)局、分娩方式和新生兒體重等信息。胎膜早破(Premature Rupture of Membranes, PROM)指臨產(chǎn)前胎膜破裂,是一組與感染密切相關(guān)的綜合癥候群,診斷標準：(1)突然見陰道內(nèi)有較多液體流出,可見胎脂及胎糞,肛診將胎先露部上推見陰道流液量增多；(2)窺器檢查見液體自宮頸口流出或陰道后穹隆有較多混有胎脂和胎糞的液體；(3)陰道分泌物酸堿試紙測定陰道液可用試紙法測定pH6.5。早產(chǎn)(Preterm Birth, PTB)是指在妊娠滿28周至不滿37周分娩者。絨毛膜炎是通過病理組織切片發(fā)現(xiàn)絨毛膜上面覆蓋炎癥細胞而作出的病理檢查診斷。新生兒窒息是指出生后1min Apar評分7分。納入志愿者共340人,首次產(chǎn)檢并建立圍產(chǎn)保健卡,動態(tài)隨訪孕期生殖道菌群動態(tài)變化。分別采集孕18周(Sample 1, S1)、孕29周(Sample 2, S2)、孕37.6周(Sample 3, S3)、產(chǎn)后6.4周(Postpartum, PP)后穹窿的分泌物。孕期三個時間點采集到樣品的人數(shù)分別為：340人、298人、205人,產(chǎn)后采集到73人的樣品,總共采集樣品916個樣品。采集的樣品暫時存放于生物樣品運輸箱,在4小時內(nèi)轉(zhuǎn)移至-80度低溫冰箱保存,直到提取樣品中細菌的總DNA。使用細菌16S通用引物,PCR擴增陰道拭子樣品的16S rRNA V4保守區(qū)。將PCR終產(chǎn)物經(jīng)過Illumina Hiseq 2000平臺進行PE100-bp測序后,得到高通量下機原始堿基序列,采用QIIME分析流程結(jié)合臨床信息分析數(shù)據(jù)。QIIME生物分析主要包括OTU的生成及PCA、假設(shè)驗證分析、進化樹分析及菌群特征性分析、菌屬豐富度分析、群落結(jié)構(gòu)多樣性分析、菌群間差異比較分析(LEfSe在線統(tǒng)計分析工具)、運用機器學習隨機森林預測模型分析孕期菌屬與不良妊娠結(jié)局的關(guān)聯(lián)。采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標準差(Mean±S)表示：兩組之間均數(shù)比較采用兩樣本t檢驗,三組及以上均數(shù)比較采用One-way ANOVA,多個處理組兩兩比較用Bonfferonii比較,矯正檢驗水準。P0.05具有統(tǒng)計學顯著性差異。研究結(jié)果：第一章1.從306個樣品中,我們獲取了720,601條高質(zhì)量16S rRNA基因序列,每個樣品平均2,354條序列。35個樣品由于測序深度1000條而被濾過剔除,271個樣品納入后續(xù)分析。2.陰道菌型(Community State Type, CST)主要分為四型：CST Ⅰ (L. crispatus), CST Ⅱ (L. gasseri), CST Ⅲ (L.iners), CST Ⅳ主要以多樣性菌屬為特征,乳酸桿菌豐富度降低,陰道菌群主要以Lactobacillus spp.為優(yōu)勢菌。3.宮頸(Cervix)、后穹窿(Posterior fornix)、陰道下1/3(Vaginal canal)三個部位的菌群分布相似,都未能有顯著區(qū)分,菌群alpha多樣性無統(tǒng)計學差異。4.宮頸(Cervix)、后穹窿(Posterior fornix)、陰道下1/3(Vaginal canal)三個部位細菌種屬的“屬”水平分布相似,6名研究對象的菌屬內(nèi)部構(gòu)成的有微小差異,但并未影響其整體菌群結(jié)構(gòu)。第二章1.隊列入組孕婦340例,總共采集了916個樣品。我們獲取了15,606,477條高質(zhì)量16S rRNA基因序列,序列數(shù)最低為3070條,最高為71,839條,將測序深度標化到3000條,所有的樣品納入后續(xù)分析。每個樣品平均17,037條序列。2.孕婦年齡從19.0-40.0歲,平均(28.5±3.7)歲,分娩孕周平均為(39.1±1.2)周,新生兒體重平均為(3297.2±398.7)克,23例孕婦由于失訪而未能記錄分娩結(jié)局,317例孕婦能查詢到分娩結(jié)局。本研究跟蹤到的結(jié)局中,胎膜早破發(fā)生率為28.7%(66/230)。早產(chǎn)發(fā)生率為3.5%(11/317)。絨毛膜炎發(fā)生率為4.4%(14/317)。剖宮產(chǎn)的機率為32.8%(106/317)。新生兒窒息發(fā)生率為5.0%(16/317)。根據(jù)常規(guī)陰道分泌物檢查,將結(jié)果分為：“好”、“臨界”、“差”三級�！昂谩�(58.9%)是指：清潔度(Ⅰ/Ⅱ)、霉菌(-)、滴蟲(-)、白細胞數(shù)量(+/++)、BV(-),占,用藥率為0.6%；“臨界”(15.1%)是指：清潔度(Ⅱ/Ⅲ)、霉菌(-/+)、滴蟲(-/+)、白細胞數(shù)量(++/+++)、BV(-/+),用藥率為16.0%；“差”(26.0%)是指清潔度(Ⅲ/Ⅳ)、霉菌(-/+)、滴蟲(-/+)、白細胞數(shù)量(+++/++++)、BV(-/+),用藥率為36.3%。3.生殖道菌群主要分為五大型(CSTⅠ-CST Ⅴ),其中有四型屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus spp.),占絕對的優(yōu)勢(占85%)。它們分別是：L. crispatus (CST Ⅰ,39.1%), L. gasseri (CST Ⅱ,3.9%), L. iners (CST Ⅲ,36.3%)和L. jensenii (CST Ⅴ,4.5%)。CST Ⅳ又可以分為兩大亞類：CST Ⅳ-A (14.7%)和CST Ⅳ-B(1.5%)。各菌型的pH比較發(fā)現(xiàn),以CST Ⅳ-A (4.8%)最高,和其他各組相比,差異具有統(tǒng)計學意義。4.孕期菌型保持相對穩(wěn)定達78.8%,菌型發(fā)生波動占21.2%,但主要還是在乳酸桿菌屬之間波動,很少轉(zhuǎn)化為多樣性豐富的菌型(CST Ⅳ-A).其中,孕期28例陰道局部使用藥物(抗生素、抗真菌藥)治療后,菌型保持穩(wěn)定達78.6%(20/28),菌型波動比例占21.4%(8/28),與未用藥的孕期菌型穩(wěn)定性相比,差異無統(tǒng)計學意義(χ2檢驗,P=0.303)。說明孕婦陰道局部使用藥物對生殖道群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性影響不大。5.孕期陰道菌群主要以乳酸桿菌(Lactobacillus spp.)為優(yōu)勢菌維持較低的pH值(4.1),群落結(jié)構(gòu)單一。產(chǎn)后42天主要以CST Ⅳ-A (78.1%)為主要菌型,菌群結(jié)構(gòu)多樣性豐富,pH值(5.2)顯著高于孕期樣品。產(chǎn)后42天陰道菌群大部分都未恢復到以乳酸桿菌屬(Lactobacillus spp.)為優(yōu)勢菌的狀態(tài)。菌屬的alpha多樣性評估指標,包括：Chao 1, PD whole tree, Observed species, Shannon index結(jié)果顯示：孕期三個樣品(S1, S2, S3)的alpha多樣性較低,各組之間差異無統(tǒng)計學意義。但是產(chǎn)后(Postprtum) alpha多樣性較孕期顯著升高,差異具有統(tǒng)計學意義(秩和檢驗,P0.05)。順產(chǎn)、剖宮產(chǎn)陰道菌型CST Ⅳ-A所占比例分別為73.5%(36/49)和87.5%(21/24),兩者比較差異無統(tǒng)計學意義(卡方檢驗,P=0.173)。說明產(chǎn)后菌型恢復情況與分娩方式(順產(chǎn)或剖宮產(chǎn))無關(guān)。6.孕期陰道菌型(CST)與不良妊娠結(jié)局包括：胎膜早破(Premature rupture of membranes, PROM)、分娩方式(剖宮產(chǎn)發(fā)生率)、絨毛膜炎(Chorioamnionitis)、 早產(chǎn) (Preterm birth, PTB)、新生兒窒息(Asphyxia)尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)聯(lián)。7.孕婦年齡是影響胎膜早破的最重要的因素,隨著孕婦年齡的增長,胎膜早破的發(fā)生率逐漸增加。當孕婦年齡30歲,孕期致病菌的差異對胎膜早破并未造成影響。但是,當孕婦年齡30歲,Megasphaera(巨球菌屬),Gardnerella(加德納菌),Sneathia(纖毛菌屬),Prevotella(普氏菌屬)的豐富度增高與胎膜早破呈現(xiàn)正相關(guān),是危險因素；而Lactobacillus spp.(乳酸桿菌屬)與胎膜早破呈現(xiàn)負相關(guān),是保護因素。結(jié)論：1.宮頸(Cervix)、后穹窿(Posterior fornix)、陰道下1/3 (Vaginal canal)三個部位的細菌群落結(jié)構(gòu)具有高度相似性,任意部位的菌群能夠代表生殖道群落結(jié)構(gòu)特征。2.生殖道菌群主要分為五大型(CSTⅠ-Ⅴ),其中有四型屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus spp.),它們分別是：L. crispatus (CSTⅠ), L. gasseri (CST Ⅱ), L. iners (CST Ⅲ)和L. jensenii (CST Ⅴ)。CST Ⅳ又可以分為兩大亞類：CST Ⅳ-A和CST Ⅳ-B。3.孕期生殖道菌群主要以乳酸桿菌屬(Lactobacillus spp.)為優(yōu)勢菌,且菌群結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定,孕期陰道局部使用藥物并不影響整體群落結(jié)構(gòu)。產(chǎn)后6周主要以CST Ⅳ-A為主要菌型,菌群結(jié)構(gòu)多樣性豐富。分娩方式并未影響產(chǎn)后菌群的恢復。4.孕期生殖道菌型(CST)與不良妊娠結(jié)局包括：胎膜早破、剖宮產(chǎn)、絨毛膜炎、早產(chǎn)、新生兒窒息尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)聯(lián)。5.孕婦年齡是影響胎膜早破的最重要的因素,當孕婦年齡30歲,孕期致病菌的差異對胎膜早破并未造成影響。但是,當孕婦年齡30歲,Megasphaera(巨球菌屬),Gardnerella(加德納菌),Sneathia(纖毛菌屬),Prevotella(普氏菌屬)可與胎膜早破發(fā)生率呈現(xiàn)正相關(guān),是胎膜早破的危險因素。而Lactobacillus spp.(乳酸桿菌屬)與胎膜早破發(fā)生率呈現(xiàn)負相關(guān),是保護因素。
【關(guān)鍵詞】：孕婦 陰道菌群 細菌16S rRNA 菌型 胎膜早破
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R714.25
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-23
• 前言23-37
• 第一章 孕婦宮頸、后穹窿、陰道下1/3的微生物群落結(jié)構(gòu)相似度分析37-54
• 1.1 引言37-38
• 1.2 研究對象和方法38-46
• 1.3 結(jié)果46-52
• 1.4 討論52-53
• 1.5 小結(jié)53-54
• 第二章 孕期生殖道微生物組結(jié)合元數(shù)據(jù)(臨床信息)預測不良妊娠結(jié)局54-96
• 2.1 引言54-57
• 2.2 研究對象和方法57-64
• 2.3 結(jié)果64-89
• 2.4 討論89-95
• 2.5 小結(jié)95-96
• 全文結(jié)論96-97
• 參考文獻97-109
• 成果109-110
• 附錄110-113
• 致謝113-116
• 統(tǒng)計學合格證明116

，

本文編號：525667