本文關(guān)鍵詞：miR-135b及其靶點(diǎn)FOXO1在骨肉瘤中的作用及其機(jī)制研究

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【摘要】：背景：骨肉瘤(OS)是骨科中最為常見(jiàn)的原發(fā)惡性骨腫瘤,多發(fā)生于15-25歲的兒童和青少年,好發(fā)部位為四肢長(zhǎng)管狀骨的干骺端,其中發(fā)生在股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端約占總病例數(shù)的50%。由于骨肉瘤的局部破壞性強(qiáng),致殘率及死亡率高,且極易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,多累及肺部,因此受到研究者的廣泛重視。隨著新技術(shù)的快速發(fā)展,加上骨肉瘤的手術(shù)及抗骨肉瘤藥物的聯(lián)合使用,使原發(fā)部位的OS患者的5年存活率已經(jīng)達(dá)到約70%。然而盡管通過(guò)各種積極的治療方式,對(duì)轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)患者的長(zhǎng)期生存機(jī)會(huì)仍低于20%。這一情況在過(guò)去的30年內(nèi)變化仍然不大。因此,通過(guò)研究骨肉瘤的組織異質(zhì)性、耐藥性以及轉(zhuǎn)移的的基本分子機(jī)制,為骨肉瘤患者尋找新型標(biāo)志物進(jìn)行準(zhǔn)確的診斷、治療和預(yù)后的評(píng)判顯得尤為必要。微小RNA是一類(lèi)小分子內(nèi)源性單鏈非編碼RNA分子,它通過(guò)與信使RNA(mRNA)的3’端非翻譯區(qū)(3’UTR)結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá),主要抑制靶基因的翻譯或目的mRNA的降解。目前越來(lái)越多的證據(jù)表明,miRNA在許多疾病的生理和病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要的作用,特別是腫瘤的生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移和侵襲。由于miRNA本身的多樣性導(dǎo)致其既可以作為腫瘤的抑制因子也可以作為腫瘤的啟動(dòng)子。目前研究發(fā)現(xiàn)特定miRNA的異常表達(dá)與多種癌癥的生長(zhǎng)和臨床預(yù)后有關(guān),但miRNA的失調(diào)及其在腫瘤發(fā)生中的作用仍然是未知。關(guān)于骨肉瘤,雖然也有一些研究表明miRNA與骨肉瘤有關(guān),如miR-34a, miR-183和miR-132,但對(duì)這些miRNA在骨肉瘤中的作用我們?nèi)匀蝗狈α私�。根�?jù)最新研究我們發(fā)現(xiàn)miR-135b在許多人類(lèi)腫瘤如：結(jié)腸癌、乳腺癌和肺癌中表達(dá)上調(diào)并可能是一種腫瘤促進(jìn)因子。Wu等人在大腸癌及其淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組織中發(fā)現(xiàn)mir-135b表達(dá)上調(diào),而mir-135b抑制劑可以有效的減少該類(lèi)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。此外在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、胰腺導(dǎo)管腺癌及淋巴瘤中都發(fā)現(xiàn)miR-135b有促進(jìn)腫瘤進(jìn)展作用。最近研究也顯示在神經(jīng)外胚層的發(fā)育過(guò)程中mir-135b被激活,人類(lèi)胚胎干細(xì)胞中niR-135b的異常表達(dá)可通過(guò)抑制TGF-β和BMP信號(hào)通路促進(jìn)hESC向神經(jīng)外胚層轉(zhuǎn)化。mri-135b還參與了受損成骨的分化,通過(guò)作用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞而達(dá)到對(duì)成骨作用的負(fù)調(diào)控。以上這些研究都提示mir-135b在人類(lèi)的生理和病理生理過(guò)程中都起到了重要的作用。但是miR-135b是否在骨肉瘤中的作用及其作用機(jī)制仍不清楚。而FOXO1是FOXO轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員,其特點(diǎn)是具有保守的含有DNA結(jié)合域的叉頭狀結(jié)構(gòu)�，F(xiàn)有的研究表明FOXO1在多種生物學(xué)過(guò)程包括細(xì)胞增殖,凋亡,分化,DNA損傷修復(fù)和應(yīng)激反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。例如FOXO1可以通過(guò)下調(diào)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白D1和上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑p27和p21蛋白從而導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)FOXO1與多種癌癥有關(guān)。miR-107負(fù)調(diào)控FOXO1的表達(dá)與人胃癌細(xì)胞的增殖有關(guān)。已經(jīng)證實(shí)核內(nèi)和轉(zhuǎn)錄水平的FOXO1在前列腺癌中均下降,因此可以得出FOXO1的過(guò)表達(dá)可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的結(jié)論。在肺癌的細(xì)胞和體內(nèi)模型中FOXO1可抑制EGFR信號(hào)的激活,姜黃素可通過(guò)誘導(dǎo)FOXO1的表達(dá)而抑制肺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。此外,FOXO1可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖。本研究以miR-135b為主要研究目標(biāo),研究其在骨肉瘤中的作用機(jī)制并證實(shí)FOXO1為其作用靶點(diǎn),并通過(guò)影響FOXO1來(lái)達(dá)到對(duì)骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)行調(diào)節(jié)作用。目的：研究人體骨肉瘤組織中miR-135b及FOXO1的表達(dá)情況及其之間是否存在相關(guān)性,探討n(yōu)iR-135b在骨肉瘤進(jìn)展過(guò)程中的作用；在骨肉瘤細(xì)胞系Saos-2和U2OS中驗(yàn)證niR-135b是否直接調(diào)控FOXO1的表達(dá),研究miR-135b在骨肉瘤細(xì)胞中對(duì)FOXO1的表達(dá)調(diào)控及其相互間的作用關(guān)系。為臨床上對(duì)骨肉瘤的治療、診斷及預(yù)后的判斷提供治療的靶點(diǎn),并為今后進(jìn)一步的使用提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法：第一部分：收集共7例骨肉瘤患者(武漢大學(xué)人民醫(yī)院)的骨腫瘤組織及腫瘤周?chē)９墙M織,將組織收集后立即將組織置入液氮罐中,通過(guò)RT-PCR及Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)骨肉瘤組織及周?chē)９墙M織中的niR-135b的蛋白表達(dá)水平。通過(guò)公共數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)查找miR-135b的靶點(diǎn),并選擇FOXO1作為可能靶點(diǎn),通過(guò)RT-PCR及Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)骨肉瘤組織及周?chē)９墙M織中的FOXO1的蛋白表達(dá)水平,并研究對(duì)比其是否存在相關(guān)性。第二部分：在骨肉瘤細(xì)胞系Saos-2和U2OS的細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-135b抑制劑后,通過(guò)RT-PCR及Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其中miR-135b和FOXO1的蛋白含量,評(píng)價(jià)miR-135b抑制劑對(duì)miR-135b及FOXO1表達(dá)的影響。通過(guò)在骨肉瘤細(xì)胞系Saos-2和U2OS的細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染FOXO1野生型基因載體和FOXO1突變型基因載體,與pMir熒光素酶報(bào)告基因載體、Prl-TK Renilla雙熒光素酶載體、miR-135b抑制劑共同轉(zhuǎn)染后,采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-135b抑制劑對(duì)分別轉(zhuǎn)染FOXO1野生型基因載體和FOXO1突變型基因載體中FOXO1蛋白的表達(dá)水平,同時(shí)與未轉(zhuǎn)染miR-135b抑制劑中的骨肉瘤細(xì)胞中的FOXO1蛋白的表達(dá)水平相對(duì)比。第三部分：主要研究miR-135b是否對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性產(chǎn)生影響,并是否通過(guò)影響其靶點(diǎn)FOXO1的表達(dá)來(lái)達(dá)到對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增值和侵襲能力的影響。1)將miR-135b抑制物及對(duì)照物轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞后,利用MTS檢測(cè)mR-135b對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響,利用Trans well實(shí)驗(yàn)檢測(cè)niR-135b對(duì)骨肉瘤細(xì)胞侵襲的影響。2)為了驗(yàn)證miR-135b是否通過(guò)FOXO1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖及侵襲產(chǎn)生影響,我們首先通過(guò)MTS及Transwell實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證FOXO1在骨肉瘤中的作用,其次再通過(guò)轉(zhuǎn)染特異性調(diào)控FOXO1的質(zhì)粒siRNA及miR-135b抑制物或?qū)φ瘴镌诠侨饬黾?xì)胞系U20S及Saos-2中后通過(guò)MTS及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)骨肉瘤細(xì)胞在增值及侵襲方面的影響。結(jié)果：第一部分：miRNA-135b在人骨肉瘤組織中表達(dá)明顯上調(diào),并與FOXO1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)：我們分別檢測(cè)了7例人骨肉瘤組織及其鄰近的非腫瘤骨組織中miR-135b的表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)骨肉瘤組織中的miR-135b表達(dá)明顯高于臨近非腫瘤正常骨組織。通過(guò)公共數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.targetscan.org)來(lái)查找miR-135b可能的靶點(diǎn),并最終選擇了具有高度保守結(jié)合位點(diǎn)的FOXO1來(lái)檢測(cè)其表達(dá)情況和與miR-135b相關(guān)性。我們通過(guò)檢測(cè)FOXO1在上述組織中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)FOXO1的mRNA和蛋白在骨肉瘤組織中的表達(dá)量比相應(yīng)的非腫瘤正常骨組織更低。而且miR-135b的表達(dá)水平與FOXO1的mRNA和蛋白的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。其結(jié)果存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第二部分：miR-135b直接調(diào)控FOXO1:我們將miR-135b抑制劑及已被證實(shí)的miR-135b表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)染OS細(xì)胞系Saos-2和U20S。結(jié)果顯示加入miR-135b抑制劑轉(zhuǎn)染的骨肉瘤細(xì)胞系Saos-2和U20S細(xì)胞中FOXO1的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯增高。分別構(gòu)建了含F(xiàn)OXO13'端非翻譯區(qū)公認(rèn)的miR-135b下游結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶報(bào)告基因載體(pMir-FOXO1-Wt,設(shè)定為野生型)和敲除了種子區(qū)8個(gè)堿基對(duì)的突變型載體(pMir-FOXO1-Mut,設(shè)定為突變型),在轉(zhuǎn)染了niR-135b抑制劑的骨肉瘤細(xì)胞系Saos-2和U20S中發(fā)現(xiàn)野生型載體的熒光素酶活性被顯著的增強(qiáng),而突變型載體的熒光素酶活性與未轉(zhuǎn)染miR-135b抑制劑的骨肉瘤細(xì)胞系Saos-2和U20S中熒光素酶活性相比無(wú)明顯變化,其結(jié)果存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了miR-135b是通過(guò)與FOXO13'端非翻譯區(qū)公認(rèn)的結(jié)合位點(diǎn)直接結(jié)合來(lái)達(dá)到對(duì)FOXO1表達(dá)的負(fù)調(diào)控作用。第三部分：miR-135b通過(guò)調(diào)控FOXO1的表達(dá)來(lái)達(dá)到對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響：首先通過(guò)轉(zhuǎn)染pLEX-FOXO1可以特異性增強(qiáng)FOXO1的表達(dá),驗(yàn)證FOXO1是否對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力的影響,發(fā)現(xiàn)FOXO1可以顯著的抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力；其次選擇最有特異性調(diào)低FOXO1表達(dá)的siRNA質(zhì)粒,通過(guò)轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒及miR-135b抑制物或?qū)φ瘴锏焦侨饬黾?xì)胞后,檢測(cè)其對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)調(diào)低FOXO1的表達(dá)后,miR-135抑制劑對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力的抑制作用被抵消。結(jié)論：我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了miR-135b在骨肉瘤患者的癌旁正常組織和骨肉瘤組織中均存在著表達(dá),并發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤組織中miR-135b的表達(dá)水平與周?chē)悄[瘤正常組織相比有著明顯升高。我們通過(guò)生物信息學(xué)分析和上述實(shí)驗(yàn)證實(shí),在骨肉瘤細(xì)胞中FOXO1是miR-135b的直接作用靶點(diǎn),同時(shí)在骨肉瘤細(xì)胞中miR-135b表達(dá)的水平與FOXO1的表達(dá)水平存在著負(fù)相關(guān)性。因此我們發(fā)現(xiàn)miR-135b通過(guò)對(duì)FOXO1靶點(diǎn)的直接作用可以促進(jìn)及增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞對(duì)局部正常組織的增殖和侵襲,這實(shí)驗(yàn)表明了miR-135b通過(guò)對(duì)FOXO1的調(diào)節(jié)參與到了骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中。從而對(duì)骨肉瘤的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程起到了推動(dòng)作用。
【關(guān)鍵詞】：骨肉瘤 MIR-135B FOXO1 增殖 侵襲
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R738.1
【目錄】：

• 中文摘要8-12
• 英文摘要12-17
• 主要中英文縮略詞匯表17-18
• 引言18-24
• 第一部分 miR-135b及FOXO1在骨肉瘤中的表達(dá)及調(diào)控作用的研究24-41
• 第二部分 miR-135b與FOXO1在骨肉瘤細(xì)胞系Saos-2和U2OS中的表達(dá)及調(diào)控41-57
• 第三部分 miR-135b與FOXO1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞Saos-2和U2OS的生物學(xué)特性的影響57-68
• 參考文獻(xiàn)68-75
• 綜述75-93
• 參考文獻(xiàn)83-93
• 博士期間成果93-94
• 致謝94

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