本文關(guān)鍵詞：miR-135b及其靶點FOXO1在骨肉瘤中的作用及其機制研究

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【摘要】：背景：骨肉瘤(OS)是骨科中最為常見的原發(fā)惡性骨腫瘤,多發(fā)生于15-25歲的兒童和青少年,好發(fā)部位為四肢長管狀骨的干骺端,其中發(fā)生在股骨遠端和脛骨近端約占總病例數(shù)的50%。由于骨肉瘤的局部破壞性強,致殘率及死亡率高,且極易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移,多累及肺部,因此受到研究者的廣泛重視。隨著新技術(shù)的快速發(fā)展,加上骨肉瘤的手術(shù)及抗骨肉瘤藥物的聯(lián)合使用,使原發(fā)部位的OS患者的5年存活率已經(jīng)達到約70%。然而盡管通過各種積極的治療方式,對轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)患者的長期生存機會仍低于20%。這一情況在過去的30年內(nèi)變化仍然不大。因此,通過研究骨肉瘤的組織異質(zhì)性、耐藥性以及轉(zhuǎn)移的的基本分子機制,為骨肉瘤患者尋找新型標志物進行準確的診斷、治療和預(yù)后的評判顯得尤為必要。微小RNA是一類小分子內(nèi)源性單鏈非編碼RNA分子,它通過與信使RNA(mRNA)的3’端非翻譯區(qū)(3’UTR)結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達,主要抑制靶基因的翻譯或目的mRNA的降解。目前越來越多的證據(jù)表明,miRNA在許多疾病的生理和病理生理過程中發(fā)揮重要的作用,特別是腫瘤的生長、增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移和侵襲。由于miRNA本身的多樣性導(dǎo)致其既可以作為腫瘤的抑制因子也可以作為腫瘤的啟動子。目前研究發(fā)現(xiàn)特定miRNA的異常表達與多種癌癥的生長和臨床預(yù)后有關(guān),但miRNA的失調(diào)及其在腫瘤發(fā)生中的作用仍然是未知。關(guān)于骨肉瘤,雖然也有一些研究表明miRNA與骨肉瘤有關(guān),如miR-34a, miR-183和miR-132,但對這些miRNA在骨肉瘤中的作用我們?nèi)匀蝗狈α私�。根�?jù)最新研究我們發(fā)現(xiàn)miR-135b在許多人類腫瘤如：結(jié)腸癌、乳腺癌和肺癌中表達上調(diào)并可能是一種腫瘤促進因子。Wu等人在大腸癌及其淋巴結(jié)和遠處轉(zhuǎn)移組織中發(fā)現(xiàn)mir-135b表達上調(diào),而mir-135b抑制劑可以有效的減少該類腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。此外在頭頸部鱗狀細胞癌、胰腺導(dǎo)管腺癌及淋巴瘤中都發(fā)現(xiàn)miR-135b有促進腫瘤進展作用。最近研究也顯示在神經(jīng)外胚層的發(fā)育過程中mir-135b被激活,人類胚胎干細胞中niR-135b的異常表達可通過抑制TGF-β和BMP信號通路促進hESC向神經(jīng)外胚層轉(zhuǎn)化。mri-135b還參與了受損成骨的分化,通過作用人骨髓間充質(zhì)干細胞而達到對成骨作用的負調(diào)控。以上這些研究都提示mir-135b在人類的生理和病理生理過程中都起到了重要的作用。但是miR-135b是否在骨肉瘤中的作用及其作用機制仍不清楚。而FOXO1是FOXO轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員,其特點是具有保守的含有DNA結(jié)合域的叉頭狀結(jié)構(gòu)�，F(xiàn)有的研究表明FOXO1在多種生物學(xué)過程包括細胞增殖,凋亡,分化,DNA損傷修復(fù)和應(yīng)激反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。例如FOXO1可以通過下調(diào)細胞周期調(diào)節(jié)蛋白D1和上調(diào)細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p27和p21蛋白從而導(dǎo)致細胞周期停滯。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)FOXO1與多種癌癥有關(guān)。miR-107負調(diào)控FOXO1的表達與人胃癌細胞的增殖有關(guān)。已經(jīng)證實核內(nèi)和轉(zhuǎn)錄水平的FOXO1在前列腺癌中均下降,因此可以得出FOXO1的過表達可顯著誘導(dǎo)細胞凋亡的結(jié)論。在肺癌的細胞和體內(nèi)模型中FOXO1可抑制EGFR信號的激活,姜黃素可通過誘導(dǎo)FOXO1的表達而抑制肺癌的進展和轉(zhuǎn)移。此外,FOXO1可抑制骨肉瘤細胞的增殖。本研究以miR-135b為主要研究目標,研究其在骨肉瘤中的作用機制并證實FOXO1為其作用靶點,并通過影響FOXO1來達到對骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展進行調(diào)節(jié)作用。目的：研究人體骨肉瘤組織中miR-135b及FOXO1的表達情況及其之間是否存在相關(guān)性,探討niR-135b在骨肉瘤進展過程中的作用；在骨肉瘤細胞系Saos-2和U2OS中驗證niR-135b是否直接調(diào)控FOXO1的表達,研究miR-135b在骨肉瘤細胞中對FOXO1的表達調(diào)控及其相互間的作用關(guān)系。為臨床上對骨肉瘤的治療、診斷及預(yù)后的判斷提供治療的靶點,并為今后進一步的使用提供一定的實驗基礎(chǔ)。方法：第一部分：收集共7例骨肉瘤患者(武漢大學(xué)人民醫(yī)院)的骨腫瘤組織及腫瘤周圍正常骨組織,將組織收集后立即將組織置入液氮罐中,通過RT-PCR及Western-blot實驗檢測骨肉瘤組織及周圍正常骨組織中的niR-135b的蛋白表達水平。通過公共數(shù)據(jù)庫來查找miR-135b的靶點,并選擇FOXO1作為可能靶點,通過RT-PCR及Western-blot實驗檢測骨肉瘤組織及周圍正常骨組織中的FOXO1的蛋白表達水平,并研究對比其是否存在相關(guān)性。第二部分：在骨肉瘤細胞系Saos-2和U2OS的細胞中轉(zhuǎn)染miR-135b抑制劑后,通過RT-PCR及Western-blot實驗檢測其中miR-135b和FOXO1的蛋白含量,評價miR-135b抑制劑對miR-135b及FOXO1表達的影響。通過在骨肉瘤細胞系Saos-2和U2OS的細胞中分別轉(zhuǎn)染FOXO1野生型基因載體和FOXO1突變型基因載體,與pMir熒光素酶報告基因載體、Prl-TK Renilla雙熒光素酶載體、miR-135b抑制劑共同轉(zhuǎn)染后,采用熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-135b抑制劑對分別轉(zhuǎn)染FOXO1野生型基因載體和FOXO1突變型基因載體中FOXO1蛋白的表達水平,同時與未轉(zhuǎn)染miR-135b抑制劑中的骨肉瘤細胞中的FOXO1蛋白的表達水平相對比。第三部分：主要研究miR-135b是否對骨肉瘤細胞的生物學(xué)特性產(chǎn)生影響,并是否通過影響其靶點FOXO1的表達來達到對骨肉瘤細胞增值和侵襲能力的影響。1)將miR-135b抑制物及對照物轉(zhuǎn)染骨肉瘤細胞后,利用MTS檢測mR-135b對骨肉瘤細胞增殖的影響,利用Trans well實驗檢測niR-135b對骨肉瘤細胞侵襲的影響。2)為了驗證miR-135b是否通過FOXO1對骨肉瘤細胞增殖及侵襲產(chǎn)生影響,我們首先通過MTS及Transwell實驗驗證FOXO1在骨肉瘤中的作用,其次再通過轉(zhuǎn)染特異性調(diào)控FOXO1的質(zhì)粒siRNA及miR-135b抑制物或?qū)φ瘴镌诠侨饬黾毎礥20S及Saos-2中后通過MTS及Transwell實驗檢測其對骨肉瘤細胞在增值及侵襲方面的影響。結(jié)果：第一部分：miRNA-135b在人骨肉瘤組織中表達明顯上調(diào),并與FOXO1的表達呈負相關(guān)：我們分別檢測了7例人骨肉瘤組織及其鄰近的非腫瘤骨組織中miR-135b的表達情況。我們發(fā)現(xiàn)骨肉瘤組織中的miR-135b表達明顯高于臨近非腫瘤正常骨組織。通過公共數(shù)據(jù)庫(http://www.targetscan.org)來查找miR-135b可能的靶點,并最終選擇了具有高度保守結(jié)合位點的FOXO1來檢測其表達情況和與miR-135b相關(guān)性。我們通過檢測FOXO1在上述組織中的表達情況,發(fā)現(xiàn)FOXO1的mRNA和蛋白在骨肉瘤組織中的表達量比相應(yīng)的非腫瘤正常骨組織更低。而且miR-135b的表達水平與FOXO1的mRNA和蛋白的表達水平呈負相關(guān)。其結(jié)果存在統(tǒng)計學(xué)意義。第二部分：miR-135b直接調(diào)控FOXO1:我們將miR-135b抑制劑及已被證實的miR-135b表達產(chǎn)物轉(zhuǎn)染OS細胞系Saos-2和U20S。結(jié)果顯示加入miR-135b抑制劑轉(zhuǎn)染的骨肉瘤細胞系Saos-2和U20S細胞中FOXO1的mRNA和蛋白表達水平明顯增高。分別構(gòu)建了含F(xiàn)OXO13'端非翻譯區(qū)公認的miR-135b下游結(jié)合位點的熒光素酶報告基因載體(pMir-FOXO1-Wt,設(shè)定為野生型)和敲除了種子區(qū)8個堿基對的突變型載體(pMir-FOXO1-Mut,設(shè)定為突變型),在轉(zhuǎn)染了niR-135b抑制劑的骨肉瘤細胞系Saos-2和U20S中發(fā)現(xiàn)野生型載體的熒光素酶活性被顯著的增強,而突變型載體的熒光素酶活性與未轉(zhuǎn)染miR-135b抑制劑的骨肉瘤細胞系Saos-2和U20S中熒光素酶活性相比無明顯變化,其結(jié)果存在統(tǒng)計學(xué)差異。上述實驗結(jié)果證明了miR-135b是通過與FOXO13'端非翻譯區(qū)公認的結(jié)合位點直接結(jié)合來達到對FOXO1表達的負調(diào)控作用。第三部分：miR-135b通過調(diào)控FOXO1的表達來達到對骨肉瘤細胞增殖和侵襲能力的影響：首先通過轉(zhuǎn)染pLEX-FOXO1可以特異性增強FOXO1的表達,驗證FOXO1是否對骨肉瘤細胞的增殖和侵襲能力的影響,發(fā)現(xiàn)FOXO1可以顯著的抑制骨肉瘤細胞的增殖和侵襲能力；其次選擇最有特異性調(diào)低FOXO1表達的siRNA質(zhì)粒,通過轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒及miR-135b抑制物或?qū)φ瘴锏焦侨饬黾毎?檢測其對骨肉瘤細胞增殖和侵襲能力的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)當調(diào)低FOXO1的表達后,miR-135抑制劑對骨肉瘤細胞增殖和侵襲能力的抑制作用被抵消。結(jié)論：我們通過實驗證明了miR-135b在骨肉瘤患者的癌旁正常組織和骨肉瘤組織中均存在著表達,并發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤組織中miR-135b的表達水平與周圍非腫瘤正常組織相比有著明顯升高。我們通過生物信息學(xué)分析和上述實驗證實,在骨肉瘤細胞中FOXO1是miR-135b的直接作用靶點,同時在骨肉瘤細胞中miR-135b表達的水平與FOXO1的表達水平存在著負相關(guān)性。因此我們發(fā)現(xiàn)miR-135b通過對FOXO1靶點的直接作用可以促進及增強骨肉瘤細胞對局部正常組織的增殖和侵襲,這實驗表明了miR-135b通過對FOXO1的調(diào)節(jié)參與到了骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展過程中。從而對骨肉瘤的發(fā)生及發(fā)展過程起到了推動作用。
【關(guān)鍵詞】：骨肉瘤 MIR-135B FOXO1 增殖 侵襲
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R738.1
【目錄】：

• 中文摘要8-12
• 英文摘要12-17
• 主要中英文縮略詞匯表17-18
• 引言18-24
• 第一部分 miR-135b及FOXO1在骨肉瘤中的表達及調(diào)控作用的研究24-41
• 第二部分 miR-135b與FOXO1在骨肉瘤細胞系Saos-2和U2OS中的表達及調(diào)控41-57
• 第三部分 miR-135b與FOXO1對骨肉瘤細胞Saos-2和U2OS的生物學(xué)特性的影響57-68
• 參考文獻68-75
• 綜述75-93
• 參考文獻83-93
• 博士期間成果93-94
• 致謝94

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