本文關鍵詞：ADAMTS-5在腰椎軟骨終板退變中的表達變化及其機制研究

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【摘要】：研究背景和目的慢性下腰痛是目前最常見的疾病之一,并成為致殘的重要原因。它已造成極大的社會經濟負擔。慢性下腰痛的主要原因是椎間盤退變。作為最大的無血管器官,髓核和內層纖維環(huán)所需的氧氣和營養(yǎng)物質是通過軟骨終板(CEP)的擴散提供的。軟骨終板是位于椎間盤上下緣薄薄一層厚度小于1毫米軟骨,在脊柱局部的生物力學和生化功能中扮演非常重要的角色。軟骨終板的退行性變可導致低養(yǎng)分供應、低氧張力、乳酸堆積,從而誘導椎間盤變性。因此,軟骨終板退變與椎間盤變性和下腰痛息息相關。椎體終板及軟骨下骨在磁共振成像(MRI)上信號強度的變化是脊柱退行性疾病中的一種常見現象。1988年,Modic總結了這些變化,稱他們?yōu)镸odic改變(Modic changes, MCs),并分為三種類型。Ⅰ型,在T1加權像上顯示為低信號,T2加權像上相對正常終板顯示為高信號,組織病理學表現為組織水腫和血管化增加；Ⅱ型,在T1加權像上為高信號,T2加權像上表現為等信號或輕度高信號,組織病理學表現為紅骨髓被黃骨髓取代；Ⅲ型,在T1加權像及T2加權像上均表現為低信號,組織病理學表現為骨質硬化。盡管Modic改變的原因和病理生理學尚不清楚,但是多數學者認為炎癥介質可能在軟骨終板退化中起著重要的作用。Crock認為髓核中的炎癥因子彌漫可能導致軟骨終板的炎癥反應,從而繼發(fā)退變。在兩個臨床研究中發(fā)現,化學髓核溶解術后鄰近終板發(fā)生了Modic改變。Ohtori等發(fā)現,腫瘤壞死因子(TNF)陽性的免疫反應性細胞在伴有Modic改變的軟骨終板明顯比MRI正常的軟骨終板多。然而,到目前為止,關于軟骨終板變性的炎癥機制的研究還很少。軟骨細胞外基質(ECM)的2種主要成分是膠原蛋白和蛋白多糖(PG)。膠原蛋白是一種框架蛋白,而PG保持滲透性腫脹和控制溶質運輸。軟骨終板中的蛋白多糖(PG)主要類型是聚蛋白聚糖,它與連接蛋白和透明質酸一起形成大型復合物,能夠填補膠原蛋白網的空隙。聚蛋白聚糖的核心蛋白質折疊成三個球狀域：G1,G2和G3。聚蛋白聚糖的糖胺聚糖側鏈位于G2和G3之間,主要由硫酸軟骨素和角質素構成,帶負電荷并保持水分,使其具有抗壓能力。有學者認為,軟骨終板變性與聚蛋白聚糖和II型膠原蛋白進行性的丟失有關。聚蛋白聚糖的丟失是軟骨損傷最早的表現形式。負責降解聚蛋白聚糖的核心蛋白有兩種主要的降解酶：基質金屬蛋白酶(MMPs)和聚蛋白聚糖酶�；|金屬蛋白酶已被證實能夠降解蛋白聚糖和膠原蛋白,以及纖連蛋白。多個研究表明,在動物模型和體外軟骨組織中降解聚蛋白聚糖的主要酶是聚蛋白聚糖酶-1和2,也稱為ADAMTS-4(a disintegrin-like and metalloprotease with thrombospondin type I motifs,4)和DAMTS-5。n端的前兩個域G1和G2由128-氨基酸組成的短多肽連接,被稱為蛋白聚糖球域(IGD)。已經觀察到導致聚蛋白聚糖從軟骨組織消耗的主要切割位點在蛋白聚糖球域(IGD)。因為這個原因導致聚蛋白聚糖缺失G1結構域,并從軟骨的矩陣結構中游離出來而不能促成軟骨的功能。在蛋白聚糖球域(IGD)中,兩個主要的蛋白酶切的位點已確定：一個在Asn341-Phe342,被基質金屬蛋白酶作用,另外一個在Glu373-Ala374,被ADAMTS作用。聚蛋白聚糖酶負責軟骨重塑早期變化中的聚蛋白聚糖的裂解。聚蛋白聚糖缺失后,膠原纖維就暴露出來被基質金屬蛋白酶切割�；|金屬蛋白酶(MMPs)通過降解膠原蛋白參與軟骨重塑的進展階段。聚蛋白聚糖的合成和降解是一個動態(tài)的平衡,來維持軟骨終板(CEP)的生理功能。嚴格調控這些聚蛋白聚糖酶的活性對維持這種平衡是至關重要的。雖然已報道在退變的關節(jié)軟骨和髓核中ADAMTS-4和ADAMTS-5的表達水平比沒有退變組有顯著升高。這些基質酶基因表達的細胞調節(jié)機制還沒有很好地被解釋。聚蛋白聚糖酶在人的軟骨細胞和髓核細胞中被促炎細胞因子,如白細胞介素1β和腫瘤壞死因子α等上調。核轉錄因子κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)是一個轉錄因子家族,在介導對損傷、應激和炎癥的細胞反應中起著核心作用。NF-κB是關節(jié)軟骨細胞和髓核細胞中基質金屬蛋白酶(MMPs)和聚蛋白聚糖酶表達調控的一個至關重要的途徑。盡管多項研究已經關注聚蛋白聚糖酶在退變關節(jié)軟骨和髓核的作用和相關調控機制,但在軟骨終板仍幾乎沒有報道。我們已經發(fā)現,在伴Modic改變的軟骨終板中,退變相關的細胞外基質蛋白的表達與ADAMTS-5表達水平增加相關,但與ADAMTS-4沒有關聯(lián)。并證實,在培養(yǎng)的牛終板軟骨細胞中TNF-α可以通tNF-κB途徑刺激ADAMT S-5的表達。IL-1p對人的軟骨終板的ADAMTS-4或ADAMTS-5表達的影響,及相關機制尚未見報道�；谏鲜龅挠^察,我們假設IL-1p參與軟骨終板退變中ADAMTS-5的表達,且通過NF-κB途徑上調終板軟骨細胞的ADAMTS-5表達。通過以下實驗來驗證這個假設：分析伴Modic改變的人腰椎軟骨終板中ADAMTS-5的表達水平及其與IL-1β表達的相關性；通過牛終板軟骨細胞的體外實驗,研究IL-1p對終板軟骨細胞的ADAMTS-5表達的刺激作用,及其調控機制。方法1.使用geNorm、NormFinder和BestKeeper三種軟件篩選出在Modic改變(MCs)腰椎軟骨終板細胞中表達最為穩(wěn)定的管家基因作為內參,對qRT-PCR進行標準化。所有腰椎軟骨標本選自各種腰椎疾患而行椎體間融合術的患者。軟骨終板有MCs的患者納入到MCs組,沒有MCs的歸為對照組。MCs組和對照組分別有來自12個患者的樣本。兩組間患者的的年齡、性別相匹配,無統(tǒng)計學差異。從既往文獻中常用的管家基因及關于骨性關節(jié)炎軟骨的基因芯片表達數據中選取12個備選基因。終板軟骨的RNA提取依照Untergasser所述方法進行操作。逆轉錄采用Reverse TRanscription System試劑盒Reverse Transcription System。qRT-PCR采用GoTaq qRCP Master Mix試劑盒操作完成。每個樣本Ct值的數據分析采用3個基于微軟Excel平臺的宏程序：即geNorm, NormFinder和BestKeeper。這些統(tǒng)計算法被用來評估12個候選內參基因的穩(wěn)定性,并確定Modic改變腰椎軟骨終板細胞中最適合作內參的管家基因,對qRT-PCR進行標準化。2.確定腰椎軟骨終板退變中ADAMTS-5表達的變化及其與IL-1p的相關性所有腰椎退行性軟骨終板標本選自因伴Modic改變的下腰痛疾患而行椎體間融合術的患者,納入到MCs組。沒有下腰痛病史而因胸腰椎爆裂性骨折需病椎和相鄰椎間盤切除并植骨重建的患者納入到對照組。組織學分析伴Modic改變的軟骨終板(CEP)中細胞外基質蛋白表達的變化。RNA提取和qRT-PCR技術分析軟骨組織退變相關的細胞外基質、ADAMTS和IL-1β的mRNA在MCs組和對照組兩者間的表達差異。免疫組織化學方法研究兩組CEP中ADAMTS-4,ADAMTS-5和IL-1p各自的免疫反應陽性的細胞百分數。用Spearman相關系數(Spearman p test)方法,從mRNA表達及免疫反應陽性細胞的百分率兩個方面,分析腰椎軟骨終板退變中ADAMTS-5表達與IL-1p之間的相關性。3.通過牛終板軟骨細胞的體外實驗,明確IL-1p能促進終板軟骨細胞ADAMTS-5表達,并通過NF-κB信號通路來調控ADAMTS-5的表達用qRT-PCR技術,免疫細胞化學方法,Western Blot等多種分子生物技術,檢測IL-1p對牛終板軟骨細胞中ADAMTS-5表達的刺激效應。應用Western Blot分析IL-1p對牛終板軟骨細胞的NF-κB信號通路的激活作用。并通過應用NF-κB抑制劑SN50阻斷IL-1β對牛終板軟骨細胞ADAMTS-5表達的刺激,反向證實IL-1β通過NF-κB信號通路上調ADAMTS-5的表達。結果1.12個備選內參基因的Ct值范圍為從17.6 (18S rRNA)到33.5 (ACTB).在GeNorm分析中,M值最小的為SDHA和B2M(0.45),因此它們是表達水平最穩(wěn)定的兩個基因。按照表達水平穩(wěn)定性從最高到最低進行排序,具體順序為SDHA= B2MLDHATBPGUSBGAPDHIPO8HMBSACTBHPRT118S rRNARPL13A.在NormFinder分析中,所有樣本中最穩(wěn)定的基因是LDHA,其M值為0.102,隨后依次為SDHA、B2M、GUSB、GAPDH、IPO8、HMBS、ACTB、 TBP、18S rRNA、HPRT1和RPL13A.在BestKeeper分析中,SDHA和ACTB的CV±SD值最小,因此被認為是所有樣本中表達最穩(wěn)定的兩個基因。SDHA是所有樣本中表達最穩(wěn)定的單個基因,而SDHA、B2M和LDHA則是最佳的聯(lián)合內參基因選擇。2.MCs組表現為軟骨細胞外基質(ECM)纖維化、硬化,以及軟骨細胞密度顯著降低。 并可觀察到細胞肥大、集群和呈現多種細胞形態(tài)。番紅O-固綠染色顯示MCs組PG含量明顯減少。細胞外基質的基因表達水平的qRT-PCR檢測中,MC組的II型膠原的mRNA表達水平較對照組明顯降低(P0.05)；MC組中ADAMTS-5mRNA表達與對照組相比顯著增加(P0.05)。免疫組織化學實驗顯示,MC組ADAMTS-5免疫檢測陽性的細胞百分比明顯高于對照組(P0.01)。而MC組中ADAMTS-4mRNA表達水平和免疫檢測陽性的細胞百分率只較對照組稍微增加而無統(tǒng)計學意義。在mRNA表達及免疫反應陽性細胞的百分率兩個方面,Spearman相關系數(Spearman p test)分析均證實腰椎軟骨終板退變中IL-1p表達增強與ADAMTS-5高水平表達之間呈正相關。3.IL-1β能上調牛終板軟骨細胞的ADAMTS-5的mRNA和蛋白表達水平。經IL-1β(10 ng/mL)作用48小時后,RT-PCR和Western Blot分別顯示牛終板軟骨細胞ADAMTS-5的]mRNA和蛋白表達水平均顯著增加(P0.01)。免疫細胞化學的方法發(fā)現IL-1p作用以后,ADAMTS-5蛋白陽性的牛終板軟骨細胞數及細胞內ADAMTS-5蛋白的熒光強度較與對照組顯著增強。在(10ng/mL) IL-1β作用15min后,牛終板軟骨細胞的p-p65的蛋白濃度明顯升高,IκB-α的蛋白濃度明顯降低,而p65在始終基本保持不變。IL-1p對牛終板軟骨細胞ADAMTS-5表達的刺激作用可以被NF-κB抑制劑SN50(50微克／毫升)有效阻斷。結論1.這是第一個為確保腰椎終板軟骨細胞中基因表達水平評估的可靠性而選擇合適內參基因的研究。我們的研究發(fā)現在所有樣本中,表達最穩(wěn)定的基因是SDHA,聯(lián)合采用SDHA、B2M和LDHA作為內參基因,可以獲得更為精準的結果。2.伴Modic改變的腰椎終板軟骨細胞中ADAMTS-5mRNA表達水平較正常軟骨終板有顯著增加,而ADAMTS-4表達水平無明顯改變。ADAMTS-5mRNA表達水平與IL-1β表達呈正相關,提示IL-1β可能選擇性地上調終板軟骨細胞ADAMTS-5的表達。3.我們的研究首次證實,IL-1β可以誘導牛終板軟骨細胞中的ADAMTS-5表達,但不作用于ADAMTS-4。從IL-1β對牛終板軟骨細胞NF-κB信號通路的有效激活及NF-κB抑制劑SN50對IL-1p刺激的有效阻斷兩方面證實IL-1β可通過NF-κB信號通路上調終板軟骨細胞ADAMTS-5的表達。
【關鍵詞】：聚蛋白聚糖酶 腰椎退變 軟骨終板 IL-1β NF-κB ADAMTS-5
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R681.53
【目錄】：

• 致謝5-6
• 中文摘要6-12
• 英文摘要12-19
• 英文縮寫詞表19-23
• 前言23-34
• 參考文獻28-34
• 第一部分 腰椎軟骨終板退變相關實驗熒光定量PCR內參基因的選擇研究34-56
• 1 引言34-35
• 2 材料與方法35-43
• 3 結果43-51
• 4 討論51-53
• 參考文獻53-56
• 第二部分 退變軟骨終板中ADAMTS-5表達的變化及其與IL-1β的相關性56-78
• 1 引言56-57
• 2 材料與方法57-65
• 3 結果65-73
• 4 討論73-75
• 參考文獻75-78
• 第三部分 IL-1β經NF-κB通路上調終板軟骨細胞ADAMTS-5的表達78-98
• 1 引言78-79
• 2 材料與方法79-86
• 3 結果86-92
• 4 討論92-95
• 參考文獻95-98
• 文獻綜述98-112
• 參考文獻106-112
• 作者簡歷及在讀期間所取得的科研成果112

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本文編號：523910