本文關(guān)鍵詞：氧化應(yīng)激反應(yīng)在牙周炎發(fā)病中的意義

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【摘要】：活性氧(ROS)參與多種疾病的病理過(guò)程,并且在正常代謝反應(yīng)中起到重要作用。ROS參與包括艾滋病、癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化、慢性炎性狀態(tài)和老化過(guò)程等一系列疾病狀態(tài)。氧分子作為氧化磷酸化的終末電子受體,在需氧代謝中占有重要地位,但這種對(duì)電子需求的同時(shí)也導(dǎo)致了各種活氧的形成,如O-·2、·OH及具有氫抽提能力的H2O2、HClO等。ROS可啟動(dòng)一個(gè)鏈?zhǔn)椒磻?yīng),易與細(xì)胞膜上的各種不飽和脂肪酸及膽固醇反應(yīng),這種直接作用于細(xì)胞的氧化損傷能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但生物體在進(jìn)化的過(guò)程中具備有效的抗ROS防御體系,如超氧化物歧化(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(CAT)及抗氧化物質(zhì)(如維生素C、維生素E)等,因此,機(jī)體代謝耗氧的同時(shí)常伴有ROS的形成,細(xì)胞的功能狀態(tài)取決于ROS與抗氧化能力的平衡。牙周病是人類發(fā)病最高的感染性疾病,以細(xì)菌為始動(dòng)因子,破壞牙周支持組織,是成人失牙的最主要的原因。一些研究認(rèn)為牙周病患者唾液和齦溝液的氧化/抗氧化活性的平衡被打破,這些患者的牙周膜更易受ROS的損傷作用。研究發(fā)現(xiàn)牙周病患者的唾液總抗氧化物活性水平與正常人相比沒(méi)有改變或者下降。氧化物/抗氧化物水平的失衡和鐵銅(促進(jìn)高活性·OH種類的產(chǎn)生)來(lái)源的改變促進(jìn)牙周組織的損傷,在ROS的作用下牙周膜細(xì)胞、牙齦上皮細(xì)胞發(fā)生潛在的細(xì)胞損傷和細(xì)胞溶解。SOD主要在局限在牙周膜發(fā)揮作用,其次是膠原纖維,成纖維細(xì)胞。隨著牙周病嚴(yán)重程度增加,SOD和過(guò)氧化氫活性在牙齦組織中有所下降。本研究通過(guò)臨床采集健康人群牙周膜組織,原代培養(yǎng)牙周膜細(xì)胞,因正畸拔牙的患者,年齡12-15歲。所選牙無(wú)齲壞、根尖周炎和牙周炎。牙離體后立即投入細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)送,然后在超凈臺(tái)內(nèi)用加入抗生素的PBS反復(fù)沖洗根面,去凈血污。再用手術(shù)刀刮取根中三分之一的牙周膜,用細(xì)胞培養(yǎng)液洗兩次,用剪刀反復(fù)剪碎后移入離心管,采用酶消化法處理,加入0.1%膠原酶3ml,37℃振蕩消化50～60min,見(jiàn)組織松散,加1%胰蛋白酶調(diào)至0.125%,繼續(xù)消化25min,見(jiàn)大部分細(xì)胞游離,用吸管充分吹打使其充分分散,加入少量10%FBS PMI1640培養(yǎng)液終止消化。1000rpm離心10min,棄上清,加入10%FBS PMI1640培養(yǎng)液使細(xì)胞再懸,然后接種于培養(yǎng)瓶中,加入適量培養(yǎng)液,置37℃、95%空氣、5%CO2和飽和濕度的孵箱中。隔日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,2～3天更換培養(yǎng)液。同時(shí),采用組織塊法,用組織剪將組織塊剪成1mm×1mm×1mm左右大小的小塊,接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,均勻鋪開(kāi),每塊間距5mm左右。放置好后,將培養(yǎng)瓶輕輕翻轉(zhuǎn),加入適量的含10%FBS的DMEM,放入CO2孵箱中。4h后翻瓶。培養(yǎng)20—25天,細(xì)胞從組織塊中游出鋪滿瓶底90%左右后,0.25%胰酶消化傳代。至第3代時(shí)細(xì)胞用液氮凍存?zhèn)溆�。�?代到第8代的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。收集對(duì)數(shù)期PDLC細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度接種于96孔板,每孔加入100ul,鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至1000-10000/孔,邊緣孔用無(wú)菌PBS填充。5%CO2,37℃孵育,至細(xì)胞單層鋪滿孔底,待細(xì)胞貼壁完全狀態(tài)良好時(shí),在特定時(shí)間(0h-48h)加入不同濃度的藥物(VC)或化合物(H2O2)處理細(xì)胞,染色后的PDLCs用FACScan流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。將PDLC細(xì)胞接種至12孔細(xì)胞板,用不同劑量的H2O2和VC處理PDLCs3h和6h后,每孔加入約160ul NP-40細(xì)胞裂解液,冰上裂解細(xì)胞30min,反復(fù)吹打或置振蕩器上震蕩5min,吸取細(xì)胞裂解液入預(yù)冷的Ep管中,4℃ 12000rpm離心10mmin,上清轉(zhuǎn)移至另一EP管中,用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。結(jié)果：MTT檢測(cè)不同濃度H2O2處理下細(xì)胞活性,600μM H2O2處理3h后PDLCs活力顯著降低。約50%的PDLCs在600 μM H2O2處理后死亡,并且隨著H2O2濃度升高死亡數(shù)相對(duì)穩(wěn)定。MTT檢測(cè)不同濃度H2O2處理下細(xì)胞活性。結(jié)果顯示600μM H2O2處理3h后PDLCs活力顯著降低。約50%的PDLCs在600pμM H2O2處理后死亡,并且隨著H2O2濃度升高死亡數(shù)相對(duì)穩(wěn)定。同時(shí)延長(zhǎng)相同濃度H2O2處理時(shí)間到6h,也得到類似的結(jié)果。用高濃度如800μM和1000μM H2O2處理細(xì)胞,細(xì)胞的正常形態(tài)消失,特別在1000μM濃度下,細(xì)胞變圓。在刺激6h后觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)毒力作用最明顯。研究中還發(fā)現(xiàn)會(huì)隨著H2O2濃度升高,細(xì)胞的部分皺縮和完整結(jié)構(gòu)消失的現(xiàn)象增加�？偟膩�(lái)說(shuō),H2O2可時(shí)間和劑量依賴性地引起PDLCs細(xì)胞死亡。用不同劑量VC處理PDLCs,MTT方法檢測(cè)處理后細(xì)胞活力,結(jié)果除了最低濃度10 μM的VC處理外,其它相對(duì)高劑量(從50～200μM)的VC在沒(méi)有H2O2處理時(shí)也會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。因此,本研究認(rèn)為,ROS對(duì)PDLC具有毒性作用,H2O2能通過(guò)激活caspase-3和caspase-9誘導(dǎo)凋亡信號(hào)通路,改變PDLC的形態(tài)及活性,VC可拮抗H2O2的促凋亡作用,適當(dāng)?shù)腣C處理可能是一種潛在治療牙周炎的有效手段。多項(xiàng)研究證實(shí)ROS在許多病理變化中均發(fā)揮著作用,其中包括慢性牙周炎。蛋白羰基化是蛋白氧化損傷時(shí)的生物標(biāo)志狀態(tài),反映ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。本研究對(duì)13名牙周炎患者和13名正常對(duì)照檢測(cè)血漿中蛋白羰基(PC)水平。對(duì)所有受試對(duì)象進(jìn)行詳細(xì)的口腔檢查和取樣,試劑盒檢測(cè)血漿中蛋白羰基的水平。結(jié)果：與正常人相比,慢性牙周炎患者外周血蛋白羰基水平明顯升高(P0.05)。檢測(cè)患者血漿中PC水平及PC濃度,結(jié)果顯示慢性牙周炎組PC水平為2.30(0.94-3.17)nmol/mg,牙周健康組PC水平為1.42 (0.78-2.32) nmol/mg,慢性牙周炎組PC水平明顯高于牙周健康組(P0.01)。慢性牙周炎組PC濃度為184.6(84.6-269.4) nmol/ml,牙周健康組為115.5 (49.3-165.3) nmol/ml,慢性牙周炎組PC濃度也明顯高于牙周健康組(P0.01)血漿PC水平與牙周參數(shù)PD的相關(guān)系數(shù)是0.592,血漿PC水平與CAL的相關(guān)系數(shù)是0.673,而血漿PC濃度與牙周參數(shù)PD的相關(guān)系數(shù)是0.657,與CAL的相關(guān)系數(shù)是0.55。由此可見(jiàn),PD和CAL與血漿PC水平及總量之間均呈明顯正相關(guān)。結(jié)論：慢性牙周炎患者循環(huán)系統(tǒng)中蛋白羰基化水平升高,PC水平的升高可能是牙周炎氧化損傷的標(biāo)志,預(yù)示牙周炎癥狀態(tài)。
【關(guān)鍵詞】：氧化應(yīng)激 活性氧(ROS) 牙周膜細(xì)胞 過(guò)氧化氫 牙周炎
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R781.42
【目錄】：

• 前言5-8
• 1. 縮略詞表8-9
• 2. 中文摘要9-12
• 3. 英文摘要12-17
• 4. 第一部分17-39
• 綜述一 性氧在牙周病中的潛在發(fā)病機(jī)制(文獻(xiàn)綜述)17-30
• 參考文獻(xiàn)24-30
• 綜述二 牙周炎的病毒感染損傷機(jī)制（文獻(xiàn)綜述）30-39
• 參考文獻(xiàn)36-39
• 5. 第二部分 人牙周膜細(xì)胞的體外原代培養(yǎng)和鑒定39-50
• 6. 第三部分 活性氧對(duì)牙周膜細(xì)胞的損傷和凋亡的影響50-70
• 7. 第四部分 慢性牙周炎患者血漿蛋白羰基化水平的意義70-84
• 8. 全文結(jié)論84-85
• 9. The Effect of Vitamin C Administration on Hydrogen Peroxide InducedCytotoxicity in Periodontal Ligament Cells85-102
• 10. 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況102-103
• 11. 致謝103-104

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