發(fā)布時間：2017-07-05 18:15

  本文關(guān)鍵詞：氧化應(yīng)激反應(yīng)在牙周炎發(fā)病中的意義

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【摘要】：活性氧(ROS)參與多種疾病的病理過程,并且在正常代謝反應(yīng)中起到重要作用。ROS參與包括艾滋病、癌癥、動脈粥樣硬化、慢性炎性狀態(tài)和老化過程等一系列疾病狀態(tài)。氧分子作為氧化磷酸化的終末電子受體,在需氧代謝中占有重要地位,但這種對電子需求的同時也導(dǎo)致了各種活氧的形成,如O-·2、·OH及具有氫抽提能力的H2O2、HClO等。ROS可啟動一個鏈式反應(yīng),易與細胞膜上的各種不飽和脂肪酸及膽固醇反應(yīng),這種直接作用于細胞的氧化損傷能導(dǎo)致細胞凋亡。但生物體在進化的過程中具備有效的抗ROS防御體系,如超氧化物歧化(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)及抗氧化物質(zhì)(如維生素C、維生素E)等,因此,機體代謝耗氧的同時常伴有ROS的形成,細胞的功能狀態(tài)取決于ROS與抗氧化能力的平衡。牙周病是人類發(fā)病最高的感染性疾病,以細菌為始動因子,破壞牙周支持組織,是成人失牙的最主要的原因。一些研究認為牙周病患者唾液和齦溝液的氧化/抗氧化活性的平衡被打破,這些患者的牙周膜更易受ROS的損傷作用。研究發(fā)現(xiàn)牙周病患者的唾液總抗氧化物活性水平與正常人相比沒有改變或者下降。氧化物/抗氧化物水平的失衡和鐵銅(促進高活性·OH種類的產(chǎn)生)來源的改變促進牙周組織的損傷,在ROS的作用下牙周膜細胞、牙齦上皮細胞發(fā)生潛在的細胞損傷和細胞溶解。SOD主要在局限在牙周膜發(fā)揮作用,其次是膠原纖維,成纖維細胞。隨著牙周病嚴重程度增加,SOD和過氧化氫活性在牙齦組織中有所下降。本研究通過臨床采集健康人群牙周膜組織,原代培養(yǎng)牙周膜細胞,因正畸拔牙的患者,年齡12-15歲。所選牙無齲壞、根尖周炎和牙周炎。牙離體后立即投入細胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)送,然后在超凈臺內(nèi)用加入抗生素的PBS反復(fù)沖洗根面,去凈血污。再用手術(shù)刀刮取根中三分之一的牙周膜,用細胞培養(yǎng)液洗兩次,用剪刀反復(fù)剪碎后移入離心管,采用酶消化法處理,加入0.1%膠原酶3ml,37℃振蕩消化50～60min,見組織松散,加1%胰蛋白酶調(diào)至0.125%,繼續(xù)消化25min,見大部分細胞游離,用吸管充分吹打使其充分分散,加入少量10%FBS PMI1640培養(yǎng)液終止消化。1000rpm離心10min,棄上清,加入10%FBS PMI1640培養(yǎng)液使細胞再懸,然后接種于培養(yǎng)瓶中,加入適量培養(yǎng)液,置37℃、95%空氣、5%CO2和飽和濕度的孵箱中。隔日觀察細胞生長情況,2～3天更換培養(yǎng)液。同時,采用組織塊法,用組織剪將組織塊剪成1mm×1mm×1mm左右大小的小塊,接種于細胞培養(yǎng)瓶中,均勻鋪開,每塊間距5mm左右。放置好后,將培養(yǎng)瓶輕輕翻轉(zhuǎn),加入適量的含10%FBS的DMEM,放入CO2孵箱中。4h后翻瓶。培養(yǎng)20—25天,細胞從組織塊中游出鋪滿瓶底90%左右后,0.25%胰酶消化傳代。至第3代時細胞用液氮凍存?zhèn)溆�。�?代到第8代的細胞用于后續(xù)實驗。收集對數(shù)期PDLC細胞,調(diào)整細胞懸液濃度接種于96孔板,每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調(diào)密度至1000-10000/孔,邊緣孔用無菌PBS填充。5%CO2,37℃孵育,至細胞單層鋪滿孔底,待細胞貼壁完全狀態(tài)良好時,在特定時間(0h-48h)加入不同濃度的藥物(VC)或化合物(H2O2)處理細胞,染色后的PDLCs用FACScan流式細胞儀檢測分析。將PDLC細胞接種至12孔細胞板,用不同劑量的H2O2和VC處理PDLCs3h和6h后,每孔加入約160ul NP-40細胞裂解液,冰上裂解細胞30min,反復(fù)吹打或置振蕩器上震蕩5min,吸取細胞裂解液入預(yù)冷的Ep管中,4℃ 12000rpm離心10mmin,上清轉(zhuǎn)移至另一EP管中,用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。結(jié)果：MTT檢測不同濃度H2O2處理下細胞活性,600μM H2O2處理3h后PDLCs活力顯著降低。約50%的PDLCs在600 μM H2O2處理后死亡,并且隨著H2O2濃度升高死亡數(shù)相對穩(wěn)定。MTT檢測不同濃度H2O2處理下細胞活性。結(jié)果顯示600μM H2O2處理3h后PDLCs活力顯著降低。約50%的PDLCs在600pμM H2O2處理后死亡,并且隨著H2O2濃度升高死亡數(shù)相對穩(wěn)定。同時延長相同濃度H2O2處理時間到6h,也得到類似的結(jié)果。用高濃度如800μM和1000μM H2O2處理細胞,細胞的正常形態(tài)消失,特別在1000μM濃度下,細胞變圓。在刺激6h后觀察細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)毒力作用最明顯。研究中還發(fā)現(xiàn)會隨著H2O2濃度升高,細胞的部分皺縮和完整結(jié)構(gòu)消失的現(xiàn)象增加。總的來說,H2O2可時間和劑量依賴性地引起PDLCs細胞死亡。用不同劑量VC處理PDLCs,MTT方法檢測處理后細胞活力,結(jié)果除了最低濃度10 μM的VC處理外,其它相對高劑量(從50～200μM)的VC在沒有H2O2處理時也會對細胞產(chǎn)生毒性作用。因此,本研究認為,ROS對PDLC具有毒性作用,H2O2能通過激活caspase-3和caspase-9誘導(dǎo)凋亡信號通路,改變PDLC的形態(tài)及活性,VC可拮抗H2O2的促凋亡作用,適當(dāng)?shù)腣C處理可能是一種潛在治療牙周炎的有效手段。多項研究證實ROS在許多病理變化中均發(fā)揮著作用,其中包括慢性牙周炎。蛋白羰基化是蛋白氧化損傷時的生物標志狀態(tài),反映ROS誘導(dǎo)的細胞損傷。本研究對13名牙周炎患者和13名正常對照檢測血漿中蛋白羰基(PC)水平。對所有受試對象進行詳細的口腔檢查和取樣,試劑盒檢測血漿中蛋白羰基的水平。結(jié)果：與正常人相比,慢性牙周炎患者外周血蛋白羰基水平明顯升高(P0.05)。檢測患者血漿中PC水平及PC濃度,結(jié)果顯示慢性牙周炎組PC水平為2.30(0.94-3.17)nmol/mg,牙周健康組PC水平為1.42 (0.78-2.32) nmol/mg,慢性牙周炎組PC水平明顯高于牙周健康組(P0.01)。慢性牙周炎組PC濃度為184.6(84.6-269.4) nmol/ml,牙周健康組為115.5 (49.3-165.3) nmol/ml,慢性牙周炎組PC濃度也明顯高于牙周健康組(P0.01)血漿PC水平與牙周參數(shù)PD的相關(guān)系數(shù)是0.592,血漿PC水平與CAL的相關(guān)系數(shù)是0.673,而血漿PC濃度與牙周參數(shù)PD的相關(guān)系數(shù)是0.657,與CAL的相關(guān)系數(shù)是0.55。由此可見,PD和CAL與血漿PC水平及總量之間均呈明顯正相關(guān)。結(jié)論：慢性牙周炎患者循環(huán)系統(tǒng)中蛋白羰基化水平升高,PC水平的升高可能是牙周炎氧化損傷的標志,預(yù)示牙周炎癥狀態(tài)。
【關(guān)鍵詞】：氧化應(yīng)激 活性氧(ROS) 牙周膜細胞 過氧化氫 牙周炎
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R781.42
【目錄】：

• 前言5-8
• 1. 縮略詞表8-9
• 2. 中文摘要9-12
• 3. 英文摘要12-17
• 4. 第一部分17-39
• 綜述一 性氧在牙周病中的潛在發(fā)病機制(文獻綜述)17-30
• 參考文獻24-30
• 綜述二 牙周炎的病毒感染損傷機制（文獻綜述）30-39
• 參考文獻36-39
• 5. 第二部分 人牙周膜細胞的體外原代培養(yǎng)和鑒定39-50
• 6. 第三部分 活性氧對牙周膜細胞的損傷和凋亡的影響50-70
• 7. 第四部分 慢性牙周炎患者血漿蛋白羰基化水平的意義70-84
• 8. 全文結(jié)論84-85
• 9. The Effect of Vitamin C Administration on Hydrogen Peroxide InducedCytotoxicity in Periodontal Ligament Cells85-102
• 10. 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況102-103
• 11. 致謝103-104

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本文編號：523030