本文關(guān)鍵詞：RNA干擾CPNE1基因表達(dá)對(duì)人骨肉瘤Saos-2細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:本課題通過RNA干擾技術(shù)靶向沉默CPNE1基因,在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中觀察沉默CPNE1基因?qū)θ斯侨饬鯯aos-2細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響并探討其分子機(jī)制,從而為基因治療研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)CPNE1在骨肉瘤組織中的表達(dá)情況,再針對(duì)CPNE1基因構(gòu)建慢病毒干擾載體轉(zhuǎn)染Saos-2細(xì)胞,以轉(zhuǎn)染陰性載體的Saos-2細(xì)胞作為對(duì)照。通過在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)來確定轉(zhuǎn)染效率,通過RT-PCR和熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)得到CPNE1基因在m RNA水平表達(dá)的變化。通過Western blotting技術(shù)檢測(cè)觀察CPNE1基因在蛋白水平表達(dá)的變化,以明確RNAi的抑制率。應(yīng)用Western blotting技術(shù)檢測(cè)BIRC3、CPNE1、IRAK2和TNFSF10在蛋白水平表達(dá)的變化,采用Cellomics分析儀和流式細(xì)胞儀檢測(cè)Saos-2細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡在CPNE1基因沉默前后的變化。由所得數(shù)據(jù)分析CPNE1基因沉默對(duì)這些蛋白表達(dá)水平以及細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡的影響。應(yīng)用Affymetrix Gene Chip primeview human基因芯片檢測(cè)全基因表達(dá)譜在下調(diào)人骨肉瘤Saos-2細(xì)胞CPNE1基因表達(dá)后的變化,并應(yīng)用軟件分析篩查數(shù)據(jù),綜合分析相關(guān)基因。結(jié)果:成功構(gòu)建針對(duì)CPNE1基因的RNAi慢病毒表達(dá)載體,DNA測(cè)序鑒定和RT-PCR表明干擾片段的堿基序列與插入位點(diǎn)完全正確;在293T細(xì)胞中進(jìn)行慢病毒包裝從而獲得高滴度上清液;通過重組慢病毒載體在Saos-2細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)入CPNE1sh RNA,轉(zhuǎn)染效率超過90%;構(gòu)建的重組慢病毒LV-CPNE1在m RNA水平和蛋白水平均能抑制CPNE1基因的表達(dá),抑制率超過80%;RNAi技術(shù)沉默CPNE1基因表達(dá)可抑制Saos-2細(xì)胞增殖,影響Saos-2細(xì)胞周期進(jìn)程,發(fā)生G2/M期阻滯,促進(jìn)細(xì)胞凋亡芯片研究篩選出差異表達(dá)基因400個(gè),其中上調(diào)基因133個(gè),下調(diào)基因267個(gè)。利用RNAi技術(shù)沉默CPNE1基因表達(dá)可下調(diào)BIRC3、IRAK2和TNFSF10的表達(dá)。結(jié)論:成功構(gòu)建了CPNE1基因穩(wěn)定干擾的慢病毒載體;CPNE1基因穩(wěn)定干擾能促進(jìn)Saos-2細(xì)胞的凋亡并抑制細(xì)胞生長(zhǎng);CPNE1基因沉默后,Saos-2細(xì)胞基因表達(dá)譜發(fā)生明顯變化,表明CPNE1基因表達(dá)與相關(guān)基因及信號(hào)通路的調(diào)控有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：慢病毒 RNA干擾 人骨肉瘤細(xì)胞Saos-2 CPNE1
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R738.1
【目錄】：

• 摘要5-7
• 英文摘要7-10
• 引言10-17
• 參考文獻(xiàn)14-17
• 第一部分 靶向CPNE1 基因shRNA慢病毒載體的 構(gòu)建與鑒定17-48
• 1 材料和方法17-31
• 2 結(jié)果31-46
• 3 討論46-48
• 第二部分 慢病毒介導(dǎo)的CPNE1-siRNA對(duì)骨肉瘤細(xì)胞Saos-2 抑制作用的體外研究3948-72
• 1 材料與方法48-53
• 2 結(jié)果53-66
• 3 討論66-72
• 小結(jié)72-73
• 參考文獻(xiàn)73-77
• 綜述 骨肉瘤治療的最新進(jìn)展77-99
• 參考文獻(xiàn)90-99
• 縮略詞表99-101
• 攻讀學(xué)位期間公開發(fā)表的論文101-102
• 致謝102-103

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 崔樹波;;骨肉瘤中西醫(yī)結(jié)合治療的進(jìn)展[J];中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志;2005年06期

  本文關(guān)鍵詞：RNA干擾CPNE1基因表達(dá)對(duì)人骨肉瘤Saos-2細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：504700