本文關(guān)鍵詞：中國(guó)腦膜炎奈瑟菌MLVA方法的建立與應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis,N.m)是流行性腦脊髓膜炎(簡(jiǎn)稱流腦)的病原菌,引起人腦膜炎和敗血癥,人類是其唯一易感宿主。N.m在全球范圍內(nèi)引起流腦暴發(fā)和流行,不同地區(qū)報(bào)告的血清群存在差異,我國(guó)歷史上流腦流行以A群為主。二十世紀(jì)80年代以前,我國(guó)曾出現(xiàn)過(guò)五次A群流腦大流行,最嚴(yán)重的一次發(fā)生在1967年,發(fā)病率達(dá)403/10萬(wàn)。從二十世紀(jì)八十年代開始,隨著A群流腦疫苗的廣泛接種,流腦疫情得以控制,至九十年代,發(fā)病率下降至1/10萬(wàn),2000年以后下降至0.2/10萬(wàn)。2003年起,安徽省曾發(fā)生多起C群流腦暴發(fā),隨后多個(gè)省份也陸續(xù)報(bào)告C群流腦病例,我國(guó)流腦的血清群構(gòu)成比例發(fā)生了明顯變化。2003-2012年的十年間,我國(guó)A群流腦所占比例明顯下降,C群則顯著增加,2005年起,我國(guó)開展A+C群流腦疫苗接種,流腦發(fā)病率逐年下降,至2010年已降至0.02/10萬(wàn)。N.m流行病學(xué)研究有助于了解細(xì)菌的傳播,并確定毒力明顯增強(qiáng)的特異克隆群,目前的研究方法中,多位點(diǎn)序列分型(MLST)被認(rèn)為是全球N.m基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)流腦患者體內(nèi)分離菌株的MLST結(jié)果顯示,我國(guó)N.m存在多個(gè)克隆系,A群N.m(NmA).主要為ST-5 complex, B群N.m(NmB)主要為ST-4821complex和ST-5562 subgroup, C群N.m (NmC)主要為ST-4821 complex, W群N.m (NmW)主要為ST-11 complex。其中,A群ST-5complex中的ST-7型及W群的ST-11型在全球范圍內(nèi)存在,而其余三種克隆系目前僅存在于我國(guó),尤其是C群ST-4821 complex,為我國(guó)近十年主要流行的N.m。在我國(guó)分離的NmC中,80%以上為ST-4821 complex,這其中ST-4821占90%,可見(jiàn),使用MLST方法并不能很好地找出我國(guó)ST-4821 NmC之間的差異。血清群及ST分型結(jié)果使得這些菌株看似來(lái)自同一克隆,實(shí)際上則不然,基于大量全基因組測(cè)序資料顯示,沒(méi)有完全相同的兩株細(xì)菌。如果使用全基因組測(cè)序比較我國(guó)ST-4821NmC之間的差異,工作量大,耗時(shí)長(zhǎng),且不適用于對(duì)大量細(xì)菌的研究。因此,需要一種分辨能力強(qiáng)且簡(jiǎn)便易行的方法。多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(簡(jiǎn)稱MLVA),利用細(xì)菌中DNA串聯(lián)重復(fù)序列的自然變異,對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分子分型,既能區(qū)分不同克隆群的菌株,又能找出相同血清群相同克隆群菌株之間的差異。因其分辨能力強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì),MLVA已廣泛用于多種細(xì)菌的分子分型、流行病學(xué)調(diào)查及溯源等研究中。也有研究者將MLVA用于N.m的研究中,然而,他們?cè)谒阉骺勺償?shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)位點(diǎn)時(shí),參考的菌株局限于歐美地區(qū),并未考慮我國(guó)的N.m,不能保證這些位點(diǎn)完全適合我國(guó)菌株。因此,需要結(jié)合我國(guó)N.m自身特點(diǎn),對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行篩選,建立適合我國(guó)N.m的MLVA方法,并初步建立我國(guó)N.m的MLVA數(shù)據(jù)庫(kù)。從不同研究角度出發(fā),對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中菌株的MLVA結(jié)果進(jìn)行分析,詳細(xì)挖掘VNTR位點(diǎn)分布特征,再基于聚類分析結(jié)果,觀察我國(guó)N.m的克隆群分布,并研究我國(guó)流腦主要流行群C群的微進(jìn)化。同時(shí),用MLVA對(duì)流腦暴發(fā)調(diào)查時(shí)采集的菌株進(jìn)行分析,探討將其用于快速判斷N.m暴發(fā)相關(guān)菌株的可行性。研究目的1、篩選適合中國(guó)N.m的VNTR位點(diǎn),建立我國(guó)N.m的MLVA方法。2、初步建立我國(guó)N.mMLVA數(shù)據(jù)庫(kù),并完善MLST數(shù)據(jù)庫(kù)。3、對(duì)我國(guó)N.m進(jìn)行MLVA分型,結(jié)合菌株現(xiàn)有的病原學(xué)及流行病學(xué)特征,建立不同MLVA分析方案,比較其優(yōu)勢(shì)及局限性,明確其應(yīng)用范圍及價(jià)值。4、分析中國(guó)C群,特別是ST-4821 complex N.m的系統(tǒng)發(fā)育特點(diǎn)及微進(jìn)化特征。5、評(píng)價(jià)MLVA在N.m暴發(fā)調(diào)查中的應(yīng)用,建立快速確定暴發(fā)相關(guān)菌株的方案。研究方法1、菌株選擇。根據(jù)我國(guó)N.m數(shù)據(jù)庫(kù)中保存的菌株數(shù)量、三間分布及微生物學(xué)特征,通過(guò)定額抽樣、按比例分層抽樣及偶遇抽樣等方法選取菌株用于MLVA實(shí)驗(yàn)。用于確定VNTR位點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)菌株選擇時(shí),盡量選擇各種特征不同的菌株。選擇方法采用定額抽樣,依次按血清群、ST型及PFGE型對(duì)N.m數(shù)據(jù)庫(kù)中的菌株進(jìn)行分層,每種細(xì)菌選擇1株。用于建立MLVA數(shù)據(jù)庫(kù)的菌株選擇時(shí),根據(jù)課題設(shè)計(jì),初步確定選擇200株N.m,采用按比例分層抽樣方法,首先按年份對(duì)菌株分層,確定每年份選擇菌株數(shù)量,其次按照血清群、ST型、來(lái)源省份及來(lái)源人群比例依次分層抽樣。上述條件均相同時(shí),采用偶遇抽樣方法,使用實(shí)驗(yàn)室正在培養(yǎng)或已保存DNA的菌株。實(shí)驗(yàn)中增加菌株時(shí),根據(jù)研究目的分別采用定額抽樣和按比例分層抽樣。2、位點(diǎn)選擇。通過(guò)查閱文獻(xiàn)獲取用于N.m的VNTR位點(diǎn),首先剔除報(bào)道中顯示為如下結(jié)果的位點(diǎn)：“多條帶”、“非所有菌株共有”、“多拷貝”、“單一條帶”及“側(cè)翼區(qū)現(xiàn)多態(tài)性”。將初步篩選后保留的位點(diǎn)用于我國(guó)N.m的MLVA預(yù)實(shí)驗(yàn),分析PCR產(chǎn)物電泳條帶,按照“所有菌株中均可檢出”,且“多態(tài)性高”、“條帶單一”和“側(cè)翼區(qū)穩(wěn)定”等原則篩選合適的VNTR位點(diǎn)。3、MLVA實(shí)驗(yàn)。提取菌株DNA,使用VNTR位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的帶有熒光標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；根據(jù)PCR產(chǎn)物確定STR內(nèi)標(biāo),使用全自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行STR檢測(cè)；電泳圖譜即fsa文件經(jīng)GeneMapper軟件處理,生成PDF圖譜及Excel文件,獲得PCR產(chǎn)物片段大��；根據(jù)相應(yīng)位點(diǎn)重復(fù)序列及其側(cè)翼片段大小,計(jì)算樣本中該位點(diǎn)的重復(fù)數(shù),將計(jì)算好的重復(fù)數(shù)以整數(shù)錄入MLVA數(shù)據(jù)庫(kù)。如果出現(xiàn)0.5個(gè)拷貝,則通過(guò)測(cè)序判定實(shí)際重復(fù)數(shù),并在以后的試驗(yàn)中遵循此標(biāo)準(zhǔn)。將每個(gè)菌株的對(duì)應(yīng)VNTR位點(diǎn)重復(fù)數(shù)提交到生物信息工具網(wǎng)站,計(jì)算各個(gè)VNTR位點(diǎn)在研究菌株中的改良Simpson差異性指數(shù),對(duì)位點(diǎn)的分辨力進(jìn)行評(píng)價(jià),根據(jù)各個(gè)VNTR位點(diǎn)的分辨力設(shè)計(jì)不同的位點(diǎn)組合方案,將MLVA數(shù)據(jù)自Excel導(dǎo)入BioNumerics軟件,采用非加權(quán)組平均數(shù)法(UPGMA)進(jìn)行分析,獲取菌株的MLVA基因型及克隆群分布聚類圖。4、MLST實(shí)驗(yàn)。通過(guò)MLST方法確定ST型及ST complex。采用N.m的7個(gè)管家基因進(jìn)行檢測(cè),其結(jié)果經(jīng)測(cè)序后提交到MLST數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站,獲得各個(gè)基因?qū)?yīng)結(jié)果,再將7個(gè)基因?qū)?yīng)結(jié)果提交到數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得相應(yīng)的ST型及ST complex。將結(jié)果錄入我國(guó)N.m的MLST數(shù)據(jù)庫(kù),并導(dǎo)入BioNumerics軟件,分析ST型分布特點(diǎn)。5、根據(jù)分型數(shù)量,比較MLVA與MLST方法的分辨能力；根據(jù)聚類分析結(jié)果,判斷MLVA與MLST是否存在相似趨勢(shì),分析我國(guó)NmC系統(tǒng)發(fā)育及微進(jìn)化特征。研究結(jié)果1、自我國(guó)N.m細(xì)菌庫(kù)中篩選了52株細(xì)菌用于確定VNTR位點(diǎn)的MLVA預(yù)試驗(yàn),這些菌株來(lái)自22個(gè)省(自治區(qū)或直轄市)的病人、密切接觸者及健康攜帶者。最終使用430株N.m建立MLVA數(shù)據(jù)庫(kù),包括1977-1996年期間分離的16株A群和12株B群,以及2003-2014年間分離的含有8種血清群的402株N.m,其中含有山東省2010年流腦暴發(fā)調(diào)查時(shí)采集的49株細(xì)菌及2014年流腦暴發(fā)調(diào)查時(shí)采集的43株細(xì)菌。2、共收集三篇文獻(xiàn)中報(bào)道的56個(gè)VNTR位點(diǎn)。經(jīng)過(guò)初篩,保留了19個(gè)不同的VNTR位點(diǎn)用于52株N.m的MLVA預(yù)試驗(yàn)。結(jié)果有3個(gè)位點(diǎn)被剔除,其中2個(gè)位點(diǎn)在多個(gè)菌株中未檢出,1個(gè)位點(diǎn)需要測(cè)序方能判斷PCR產(chǎn)物大小。最后保留16個(gè)VNTR位點(diǎn)(VNTR1-19,無(wú)VNTR10、16和17)用于我國(guó)N.m的MLVA研究。3、使用上述16個(gè)VNTR位點(diǎn)對(duì)430株N.m進(jìn)行MLVA實(shí)驗(yàn),共獲得6880個(gè)數(shù)據(jù),將結(jié)果錄入Excel表格,初步建立了我國(guó)N.m的MLVA數(shù)據(jù)庫(kù)。同時(shí)對(duì)缺少ST型信息的122株N.m進(jìn)行MLST實(shí)驗(yàn),增加了854個(gè)數(shù)據(jù),完善了我國(guó)N.m的MLST數(shù)據(jù)庫(kù)。4、對(duì)215株NmC的MLST和MLVA結(jié)果進(jìn)行聚類分析,共分得29個(gè)ST型。而MLVA分型結(jié)果卻由于采用不同的VNTR位點(diǎn)而表現(xiàn)不完全一致。使用16個(gè)VNTR位點(diǎn)進(jìn)行分析時(shí),215株NmC共分為201個(gè)MLVA型,182株ST-4821 complex NmC共分為176個(gè)MLVA型,118株ST-4821 NmC共分為112個(gè)MLVA型。其中6個(gè)VNTR位點(diǎn)(VNTR1、2、4、5、18和19)的Nei's指數(shù)高于0.5,被稱作高變位點(diǎn),其余10個(gè)VNTR位點(diǎn)被稱作穩(wěn)定位點(diǎn)。使用上述6個(gè)高變位點(diǎn)中的5個(gè)位點(diǎn)(無(wú)VNTR5)進(jìn)行MLVA的分型結(jié)果與使用16個(gè)位點(diǎn)的一致。采用10個(gè)穩(wěn)定位點(diǎn)(VNTR3, VNTR6-15,無(wú)VNTR10)進(jìn)行分析時(shí),215株NmC分為55個(gè)MLVA基因型,182株ST-4821 complex NmC分為32個(gè)基因型,118株ST-4821 NmC共分為11個(gè)基因型。采用這10個(gè)穩(wěn)定位點(diǎn)進(jìn)行MLVA時(shí),NmC系統(tǒng)發(fā)育特征與MLST結(jié)果存在相似趨勢(shì)。5、使用5個(gè)穩(wěn)定位點(diǎn)(VNTR7、9、12、4和15)建立的MLVA方案,對(duì)來(lái)自山東及安徽的兩起暴發(fā)調(diào)查中的56株N.m進(jìn)行分析,BioNumerics聚類分析結(jié)果顯示,同一次流腦暴發(fā)中的暴發(fā)相關(guān)菌株聚成一簇,且與不相關(guān)菌株分開。同時(shí),也有部分散發(fā)菌株也與暴發(fā)相關(guān)菌株聚成一簇。結(jié)論1、N.m的MLVA方案應(yīng)結(jié)合菌株流行病學(xué)信息確定VNTR位點(diǎn),不同國(guó)家分離的菌株使用的位點(diǎn)不盡相同。2、MLVA方法適合我國(guó)N.m的基因多態(tài)性及系統(tǒng)發(fā)育特征分析,進(jìn)行MLVA實(shí)驗(yàn)時(shí),需要根據(jù)不同研究目的選擇合適的VNTR位點(diǎn)組合。研究菌株中VNTR位點(diǎn)多態(tài)性及菌株差異時(shí),使用5個(gè)高變位點(diǎn)組合的方案；研究菌株系統(tǒng)發(fā)育特點(diǎn)及菌株之間相似性時(shí),使用10個(gè)穩(wěn)定位點(diǎn)組合的方案。3、MLVA方法分辨能力強(qiáng)于MLST方法,可以采用5個(gè)高變位點(diǎn)(VNTR1、2、4、18和19)分析我國(guó)NmC的基因多態(tài)性。本研究檢測(cè)的215株N.m,存在29個(gè)ST型和201個(gè)MLVA型。4、MLST結(jié)果顯示,我國(guó)NmC存在多種克隆群,其中最主要的為ST-4821complex,該克隆群經(jīng)過(guò)近十年傳播,微進(jìn)化特征顯示細(xì)菌的VNTR位點(diǎn)存在基因多態(tài)性,但MLST7個(gè)管家基因的聚類結(jié)果和MLVA中使用的10個(gè)穩(wěn)定VNTR位點(diǎn)的聚類結(jié)果,在這些菌株之間存在相似性。5、采用5個(gè)穩(wěn)定VNTR位點(diǎn)組合進(jìn)行MLVA,可以用于ST-4821 NmC引起的同一次流腦暴發(fā)調(diào)查中,快速初篩暴發(fā)相關(guān)菌株。創(chuàng)新和意義1、建立了我國(guó)N.m的MLVA實(shí)驗(yàn)方法,初步建立了MLVA數(shù)據(jù)庫(kù)。數(shù)據(jù)庫(kù)中菌株覆蓋年代、地區(qū)及人群廣泛,包含了1977-2014年間23個(gè)年份、來(lái)自我國(guó)27個(gè)省(自治區(qū)或直轄市)的病人、密切接觸者和健康人群的N.m；菌株類別詳盡,包括8個(gè)血清群、111個(gè)ST型和114個(gè)PFGE型。流學(xué)病學(xué)調(diào)查中,如果分離到了N.m,或是僅僅采集到患者的咽拭子等標(biāo)本時(shí),可以提取DNA進(jìn)行MLVA實(shí)驗(yàn),不會(huì)因?yàn)闆](méi)有獲得菌株而缺少病原學(xué)信息。將新獲得標(biāo)本的MLVA結(jié)果提交到數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì),判斷其是否為新出現(xiàn)的類型。如果為數(shù)據(jù)庫(kù)已有的MLVA型,可以比較新分離菌株與數(shù)據(jù)庫(kù)中菌株的流行病學(xué)背景信息,進(jìn)一步分析其可能的傳播途徑；如果為新的MLVA型,可以完善數(shù)據(jù)庫(kù),同時(shí)根據(jù)菌株各個(gè)VNTR位點(diǎn)的重復(fù)數(shù),觀察相同血清群或克隆群菌株之間的相同位點(diǎn)及差異位點(diǎn),分析特定血清群或克隆群菌株VNTR位點(diǎn)多態(tài)性,尋找其微進(jìn)化規(guī)律。2、首次使用MLVA方法分析我國(guó)流NmC微進(jìn)化特征,證明了我國(guó)特有的ST-4821 NmC并非同一克隆,菌株之間VNTR位點(diǎn)多態(tài)性明顯。提出可根據(jù)研究目的,選擇不同VNTR位點(diǎn)組合方案用于N.m的MLVA研究。ST-4821 NmC自出現(xiàn)之日起,幾乎每年都從病人或健康攜帶者體內(nèi)分離到該菌,雖然血清群、ST型等實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同,但是這些菌株的VNTR位點(diǎn)重復(fù)數(shù)并不是完全一致,對(duì)這些菌株的微進(jìn)化特征進(jìn)行研究,能夠發(fā)現(xiàn)與表型相關(guān)的關(guān)鍵遺傳改變,為尋找N.m在致病能力、耐藥性等方面的變異源頭以及其適應(yīng)環(huán)境的基礎(chǔ)提供依據(jù)。本研究中采用16個(gè)VNTR位點(diǎn)進(jìn)行MLVA實(shí)驗(yàn),基于不同研究目的選擇不同位點(diǎn)組合進(jìn)行分析,既能夠了解ST-4821 NmC之間的共性,又能夠發(fā)現(xiàn)它們之間存在的差異,尤其適合為了解決不同問(wèn)題而進(jìn)行的流行病學(xué)調(diào)查研究,可以同時(shí)分析這類菌株在傳播、流行及致病過(guò)程中發(fā)生的有利遺傳和不利變異。3、首次將MLVA方法用于我國(guó)流腦暴發(fā)中暴發(fā)相關(guān)菌株的快速初篩,并分析了使用5個(gè)穩(wěn)定VNTR位點(diǎn)進(jìn)行MLVA實(shí)驗(yàn)在判斷暴發(fā)相關(guān)菌株中應(yīng)用的可行性及局限性。當(dāng)暴發(fā)流腦疫情時(shí),臨床醫(yī)生及流行病學(xué)工作者會(huì)第一時(shí)間采集病人及其密切接觸者的標(biāo)本,但樣本的分離培養(yǎng)成功率并不高。因此,可以在細(xì)菌培養(yǎng)的同時(shí),將采集到的標(biāo)本快速提取DNA,采用5個(gè)VNTR位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)MLVA實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行聚類分析,判斷暴發(fā)相關(guān)菌株。當(dāng)相同MLVA型N.m大量出現(xiàn)時(shí),應(yīng)引起高度重視,結(jié)合流行病學(xué)背景信息進(jìn)一步分析,預(yù)測(cè)其傳播及引起流行的趨勢(shì),并積極采取防控措施：當(dāng)衛(wèi)生資源有限時(shí),可以優(yōu)先對(duì)攜帶暴發(fā)相關(guān)菌株者進(jìn)行防治。
【關(guān)鍵詞】：腦膜炎奈瑟菌 分子分型 ST-4821 多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析 多位點(diǎn)序列分型 微進(jìn)化
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R515.2
【目錄】：

• 中文摘要6-12
• 英文摘要12-19
• 符號(hào)說(shuō)明19-20
• 前言20-24
• 第一部分：中國(guó)腦膜炎奈瑟菌MLVA方法的建立24-46
• 一、前言24-25
• 二、材料與方法25-35
• 三、結(jié)果35-42
• 四、討論42-46
• 第二部分：MLVA方法在中國(guó)腦膜炎奈瑟菌研究中的應(yīng)用46-99
• 第一章：中國(guó)C群腦膜炎奈瑟菌微進(jìn)化研究46-88
• 一、前言46-47
• 二、材料與方法47-50
• 三、結(jié)果50-82
• 四、討論82-88
• 第二章：MLVA在中國(guó)C群流腦暴發(fā)調(diào)查中的應(yīng)用88-99
• 一、前言88-89
• 二、材料與方法89-92
• 三、結(jié)果92-97
• 四、討論97-99
• 結(jié)論99-100
• 創(chuàng)新與意義100-102
• 研究中存在的不足與改進(jìn)措施102-103
• 綜述103-114
• 附表114-120
• 參考文獻(xiàn)120-129
• 致謝129-131
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄131-132
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表132-133
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的SCI論文133-171
• 論文1133-145
• REFERENCES142-145
• 論文2145-157
• References154-157
• 論文3157-171
• References169-171

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

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3 李君蓮;劉潔;魚栓民;綦迎成;趙秀芹;王泉;劉志廣;呂冰;劉中華;張洋;萬(wàn)康林;;新疆結(jié)核分枝桿菌臨床分離株VNTR基因型的初步研究[J];中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào);2010年12期

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中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 倪進(jìn)東;安徽省流行性腦脊髓膜炎流行病學(xué)特征研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2008年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 何曙春;安徽省六安市2003-2012年流行性腦脊髓膜炎流行特征研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2013年

  本文關(guān)鍵詞：中國(guó)腦膜炎奈瑟菌MLVA方法的建立與應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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