本文關(guān)鍵詞：2-甲氧基雌二醇對(duì)脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能、TAU蛋白影響及對(duì)急性腦梗死大鼠神經(jīng)功能影響的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)可由外傷、出血、腫瘤壓迫等多因素引起,是臨床工作中常見的神經(jīng)外科疾病,可嚴(yán)重影響患者及家屬的生活質(zhì)量。近年來礦難,重大交通事故,自然災(zāi)害頻發(fā),脊髓損傷可成批發(fā)生且傷情嚴(yán)重復(fù)雜,并發(fā)癥多,預(yù)后差,甚至造成患者終生殘廢或危及生命。目前治療脊髓損傷常用方法包括手術(shù)治療,細(xì)胞移植,藥物治療,基因工程等療法,其中藥物治療中激素沖擊療法廣為使用,但因其可發(fā)生較多的副作用而受到限制。早期應(yīng)用大劑量激素沖擊療法已經(jīng)在脊髓損傷中的神經(jīng)康復(fù)作用得到肯定。早期治療脊髓損傷最廣泛應(yīng)用的藥物代表是地塞米松和甲強(qiáng)龍,得到了廣大臨床工作者的推廣。激素可以減輕細(xì)胞水腫、改善血液循環(huán)、抑制炎癥、降低毒性物質(zhì)的釋放等。但是大劑量激素的應(yīng)用可能帶來較為嚴(yán)重的并發(fā)癥如血糖升高,水電解質(zhì)紊亂和應(yīng)激性潰瘍等,因此在臨床上只能短時(shí)間沖擊治療。尋找其他藥物替代地塞米松及甲強(qiáng)龍治療脊髓損傷越來越受到臨床醫(yī)生的關(guān)注。近年來有報(bào)道雌激素及黃體酮對(duì)可以改善脊髓損傷大鼠的神經(jīng)功能,但作用機(jī)制不明確。我國(guó)中醫(yī)中藥治療脊髓損傷也獲得一定療效,尤其是活血化瘀的藥物,但有些藥物缺乏循證醫(yī)學(xué)的論證,對(duì)于副作用的評(píng)價(jià)也不完善。2-甲氧基雌二醇(2ME2)是激素雌二醇的天然代謝產(chǎn)物,存在于人體的血液中。目前的研究表明其有一定的抗腫瘤及神經(jīng)保護(hù)作用。因其毒性作用小,受到越來越多專家學(xué)者的關(guān)注。近年來2ME2通過減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡、減輕神經(jīng)細(xì)胞水腫等對(duì)缺血缺氧性腦病具有治療作用已經(jīng)得到了廣泛的認(rèn)可。脊髓損傷也可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的變性、壞死；損傷后組織缺血缺氧、內(nèi)環(huán)境變化及血管內(nèi)有害物質(zhì)的聚集可造成脊髓后續(xù)的損害。目前關(guān)于2ME2是否對(duì)脊髓損傷大鼠具有一定治療作用的相關(guān)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)通過2ME2治療急性脊髓損傷大鼠,檢測(cè)脊髓損傷大鼠的運(yùn)動(dòng)功能,觀察其治療作用,并探討其可能的機(jī)制。Tau蛋白是微管相關(guān)蛋白,其主要功能是與微管蛋白結(jié)合,維持微管的穩(wěn)定同時(shí)誘導(dǎo)微管形成。Tau蛋白誘導(dǎo)與促進(jìn)微管蛋白聚合成微管,并與新聚合的微管結(jié)合在一起,保持微管相互之間的距離,影響神經(jīng)元蛋白激酶的附著點(diǎn),在神經(jīng)元可塑性方面起重要的作用。目前已證實(shí)老年癡呆癥患者的神經(jīng)元中Tau蛋白總量多于正常人,且有功能的Tau蛋白較常人減少。近年來研究發(fā)現(xiàn),腦缺血缺氧性腦病與神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的Tau蛋白含量及磷酸化水平關(guān)系密切,Tau蛋白含量增伴隨過度磷酸化可致神經(jīng)元微管結(jié)構(gòu)受破壞,正常軸突轉(zhuǎn)運(yùn)受損從而引起神經(jīng)元功能損傷。在脊髓損傷的過程中神經(jīng)細(xì)胞也存在微管的損害,但與Tau蛋白及磷酸化水平的變化關(guān)系目前研究較少,因此我們希望通過檢測(cè)脊髓損傷后組織Tau蛋白及磷酸化Tau蛋白的含量,來探討脊髓損傷與Tau蛋白的關(guān)系。Hung KS等發(fā)現(xiàn)大鼠脊髓損傷后Tau蛋白磷酸化水平增加,經(jīng)過治療后Tau蛋白磷酸化水平下降,并提出Tau蛋白磷酸化水平與脊髓損傷的程度正相關(guān)。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)2ME2對(duì)急性脊髓損傷有治療作用,能改善脊髓損傷大鼠的運(yùn)動(dòng)功能,減少神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡；因此我們希望通過檢測(cè)經(jīng)2ME2治療前后Tau蛋白磷酸化水平的變化,探討2ME2治療脊髓損傷可能存在的機(jī)制。急性腦梗死在我國(guó)發(fā)病率高、致死率高,是嚴(yán)重威脅人體健康的疾病類型之一。急性腦梗死發(fā)作時(shí),腦動(dòng)脈梗阻,腦組織血液供應(yīng)發(fā)生障礙,導(dǎo)致局部腦組織因缺血缺氧發(fā)生壞死或軟化。但是在梗塞病灶周圍存在可逆的缺血半暗帶區(qū),該區(qū)域的組織在功能上呈現(xiàn)可逆性損害,這部分組織細(xì)胞仍呈現(xiàn)正常的組織結(jié)構(gòu),但在生理功能上存在缺陷,這部份細(xì)胞在不利的環(huán)境中可變性死亡,但如果在好的環(huán)境下可以恢復(fù)正常功能。目前臨床研究都集中在梗塞周邊的神經(jīng)保護(hù)治療。有報(bào)道2ME2對(duì)腦缺血缺氧具有保護(hù)作用,包括抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡,減輕神經(jīng)細(xì)胞水腫等,對(duì)缺血缺氧性腦病具有一定的保護(hù)作用。因此本實(shí)驗(yàn)研究2ME2對(duì)急性腦梗死大鼠腦組織神經(jīng)的影響,旨在為臨床治療急性腦梗死提供一定的理論依據(jù)。急性腦梗死發(fā)作時(shí),因?yàn)槿毖毖�、梗塞后水腫壓迫、自由基聚集、細(xì)胞代謝障礙等多種復(fù)雜因素導(dǎo)致梗塞周邊神經(jīng)細(xì)胞處于凋亡狀態(tài)。而細(xì)胞的凋亡則是由基因調(diào)控細(xì)胞程序性死亡的過程�？刂萍�(xì)胞凋亡的基因分為促凋亡基因和抗凋亡基因兩大類。兩類基因的活躍程度決定了神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。Caspase-3、bcl-2家族、Fas等屬于促凋亡基因,其中caspase-3在神經(jīng)細(xì)胞凋亡通路上扮演著重要的角色。Adam Hafeez等在研究大鼠急性腦梗死模型時(shí)發(fā)現(xiàn),缺血缺氧可以誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,導(dǎo)致神經(jīng)元的丟失。并檢測(cè)到了大鼠腦梗死周圍組織的caspase-3表達(dá)增加。因此我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中通過TUNEL染色檢測(cè)凋亡及檢測(cè)caspase-3來驗(yàn)證2ME2對(duì)急性腦梗死的凋亡的影響。第一章 2ME2對(duì)脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能及脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響目的：研究激素雌二醇的代謝產(chǎn)物2-甲氧基雌二醇(2ME2)對(duì)脊髓損傷(SCI)大鼠神經(jīng)功能及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。方法：將成年雄性SD大鼠72只隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(n=24)、脊髓損傷(n=24)和脊髓損傷2ME2治療組(n=24)。采用改良的Allen's法制作脊髓損傷模型。從脊髓損傷大鼠模型建立后第一天開始,脊髓損傷治療組大鼠按24mg/kg給予2ME2腹腔注射,連續(xù)注射7天。脊髓損傷組大鼠給予等劑量生理鹽水腹腔注射,假手術(shù)組不給予干預(yù)措施。應(yīng)用BBB評(píng)分系統(tǒng)對(duì)大鼠第1d,3d,7d,14d,21d,28d后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)估。第7d應(yīng)用免疫熒光染色檢測(cè)caspase-3表達(dá)。第7d通過TUNEL凋亡原位檢測(cè)試劑盒檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡結(jié)果：脊髓損傷組和脊髓損傷2ME2治療組BBB評(píng)分明顯低于假手術(shù)組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),脊髓損傷2ME2治療組在14d、21d、28d BBB評(píng)分明顯高于脊髓損傷組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。說明2ME2可以改善脊髓損傷大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)。脊髓損傷組及脊髓損傷2ME2治療組隨著時(shí)間的推移,功能在恢復(fù),各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的評(píng)分存在差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。免疫熒光染色結(jié)果顯示,脊髓損傷組(25.13±3.64)及脊髓損傷治療組(15.89±4.68)caspase-3蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組(3.32±2.11)顯著增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),脊髓損傷2ME2治療組caspase-3蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較脊髓損傷組顯著減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(個(gè)/高倍視野,×400)。TUNEL染色觀察脊髓神經(jīng)組織細(xì)胞凋亡顯示：與假手術(shù)組(2.05±1.54)相比,脊髓損傷組(40.62±5.02)及脊髓損傷2ME2治療組(18.79.62±3.28)凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),脊髓損傷2ME2治療組凋亡細(xì)胞指數(shù)較脊髓損傷組顯著減低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。證明2ME2可以改善神經(jīng)功能,抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。結(jié)論：2ME2改善脊髓損傷大鼠模型脊髓損后的運(yùn)動(dòng)功能,具有神經(jīng)保護(hù)作用；2ME2降低脊髓損傷大鼠模型脊髓損后caspase-3蛋白表達(dá),抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。第二章脊髓損傷大鼠TAU蛋白的變化及2ME2對(duì)TAU蛋白磷酸化的影響目的：通過檢測(cè)脊髓損傷(SCI)后脊髓組織Tau蛋白的變化,并檢測(cè)SCI2ME2治療脊髓損傷大鼠前后脊髓組織Tau蛋白磷酸化水平的變化；探討脊髓損傷與Tau蛋白的關(guān)系及2ME2治療脊髓損與Tau蛋白磷酸化的關(guān)系。方法：將成年雄性SD大鼠72只隨機(jī)分為假手術(shù)組(Il=24)、脊髓損傷組(n=24)和脊髓損傷2ME2治療組(n=24)3組,采用改良的Allen's法制作脊髓損傷模型。從脊髓損傷大鼠模型建立后第一天開始,脊髓損傷治療組大鼠按24mg/kg給予2ME2腹腔注射,連續(xù)注射7天。脊髓損傷組大鼠給予等劑量生理鹽水腹腔注射,假手術(shù)組不給予干預(yù)措施。在第7d將提取大鼠脊髓標(biāo)本,應(yīng)用免疫熒光檢測(cè)p-Tau(Ser 262)蛋白,應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)p-Tau(Ser 262)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果： 免疫熒光檢測(cè)p-Tau(Ser 262)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量(個(gè)/高倍視野,x400)顯示：脊髓損傷組(19.05±1.34)和脊髓損傷2ME2治療組(10.36±1.28)脊髓損傷后p-Tau(Ser 262)蛋白表達(dá)與假手術(shù)組(5.21±1.03)相比增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。說明脊髓損傷后,脊髓組織中的Tau蛋白表達(dá)增加。脊髓損傷治療組p-Tau(Ser 262)蛋白表達(dá)與脊髓損傷組相比明顯減少,差異具有顯著意義(p0.05)。2ME2對(duì)脊髓的作用可能通過降低Tau蛋白磷酸化水平來實(shí)現(xiàn)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的可靠性,我們應(yīng)用Western blot檢測(cè)p-Tau(Ser262)蛋白光密度。Western blot結(jié)果顯示,脊髓損傷組(0.607±0.105)和脊髓損傷治療組(0.283±0.094)p-Tau(Ser 262)蛋白表達(dá)較假手術(shù)組(0.099±0.016)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),脊髓損傷治療組p-Tau(Ser 262)蛋白表達(dá)與脊髓損傷組相比明顯減少,差異具有顯著意義(p0.05)。結(jié)論：脊髓損傷后脊髓組織Tau蛋白表達(dá)增加；經(jīng)2ME2治療后脊髓組織磷酸化的Tau蛋白水平降低。第三章 2ME2對(duì)急性腦梗死大鼠神經(jīng)功能的影響目的：探討2ME2對(duì)急性腦梗死大鼠腦組織神經(jīng)功能及細(xì)胞凋亡的影響。方法：72只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦梗死組和2ME2治療組3組。每組大鼠24只。在采用線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈腦梗死模型24h后治療組按24mg/kg給予2ME2腹腔注射,連續(xù)注射7天。腦梗死組大鼠給予等劑量生理鹽水腹腔注射,假手術(shù)組不給予干預(yù)措施。第7天對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能分析。第7天處死大鼠,免疫熒光檢測(cè)大鼠腦組織中凋亡相關(guān)基因Caspase-3的表達(dá)情況,通過TUNEL凋亡原位檢測(cè)試劑盒檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。通過TTC染色觀察腦組織梗死范圍變化。結(jié)果：Bederson標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分結(jié)果顯示：與假手術(shù)組(0.333+0.492)比較,腦梗塞組(2.000±0.8543)和2ME2治療組(1.250±0.866)大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著升高(P0.05)。而在2ME2治療的大鼠中,其評(píng)分較模型組明顯下降(P0.05)。不同處理組大鼠腦組織中Caspase-3水平比較結(jié)果顯示：與假手術(shù)組(0.252±0.079)比較,模型組(1.065±0.134)和治療組(0.691±0.136)大鼠腦組織中Caspase-3的表達(dá)水平顯著升高(P0.05)。而在2ME2治療的大鼠中,其腦組織中Caspase-3表達(dá)水平較模型組明顯下降(P0.05)。大鼠建模后7天腦組織細(xì)胞凋亡數(shù)量較多,而經(jīng)過2ME2治療的大鼠腦組織中細(xì)胞凋亡數(shù)量較少,對(duì)凋亡水平和進(jìn)行定量分析顯示,與假手術(shù)組(42.750±8.572)比較,模型組(161.917±10.850)大鼠腦組織中凋亡細(xì)胞數(shù)顯著性增加(P0.05)。而治療組(82.417±8.702)大鼠腦組織中凋亡細(xì)胞數(shù)較模型組則顯著性下降(P0.05),但是其水平仍然顯著高于假手術(shù)組(P0.05)結(jié)論：2ME2可以改善急性腦梗死大鼠的神經(jīng)功能,降低大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平,對(duì)神經(jīng)具有一定保護(hù)作用,為臨床急性腦梗死治療提供了一定的參考依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：2-甲氧基雌二醇 脊髓損傷 凋亡 Tau蛋白 腦梗死
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R651.2;R743.3
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 研究背景18-30
• 參考文獻(xiàn)22-30
• 第一章 2ME2有效改善脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能并減少細(xì)胞凋亡30-57
• 一、前言30-31
• 二、材料和方法31-38
• 三、結(jié)果38-42
• 四、討論42-47
• 五、結(jié)論47
• 參考文獻(xiàn)47-57
• 第二章 大鼠脊髓損傷(SCI)后TAU蛋白磷酸化的變化及2ME2對(duì)TAU蛋白磷酸化的影響57-81
• 一、前言57-58
• 二、材料和方法58-67
• 三、結(jié)果67-70
• 四、討論70-72
• 五、結(jié)論72
• 參考文獻(xiàn)72-81
• 第三章 2ME2對(duì)急性腦梗死大鼠神經(jīng)功能及細(xì)胞凋亡的影響81-100
• 一、前言81-82
• 二、材料和方法82-91
• 三、結(jié)果91-94
• 四、討論94-96
• 五、結(jié)論96-97
• 參考文獻(xiàn)97-100
• 全文總結(jié)100-102
• 綜述102-116
• 參考文獻(xiàn)108-116
• 在學(xué)所發(fā)表論文116-117
• 致謝117-119
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)證明119

  本文關(guān)鍵詞：2-甲氧基雌二醇對(duì)脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能、TAU蛋白影響及對(duì)急性腦梗死大鼠神經(jīng)功能影響的實(shí)驗(yàn)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：498164