本文關(guān)鍵詞：趨化因子CCL2對血小板功能的調(diào)控及其機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是嚴重威脅人類健康和生命的重大疾病之一,由于其高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率,AMI已成為我國重大的公共衛(wèi)生問題。血小板聚集和活化在AMI斑塊及血栓形成過程中扮演重要角色。近年來,經(jīng)皮冠狀動脈介入聯(lián)合雙聯(lián)抗血小板治療(阿司匹林+氯吡格雷)已成為AMI的主要治療措施之一,不僅能有效緩解AMI患者的臨床癥狀,還能顯著改善患者的預(yù)后。然而,4%-30%人群對氯吡格雷的反應(yīng)性低下甚至無反應(yīng),這種現(xiàn)象被稱為氯吡格雷抵抗(clopidogrel resistance,CR),這部分患者發(fā)生心血管事件的風險明顯增加。增加氯吡格雷劑量、使用三聯(lián)的抗血小板藥物(阿司匹林+氯吡格雷+西洛他唑)或使用新型抗血小板藥物替格瑞洛后能有效降低CR患者發(fā)生心血管事件的風險,但并不能完全消除上述事件的發(fā)生,提示CR患者在經(jīng)過優(yōu)化的抗血小板治療后仍然存在一定程度的血小板聚集和活化。因此,從血小板聚集和活化角度入手,尋找對抗血小板功能的關(guān)鍵調(diào)控分子及信號通路,可以為AMI等心血管疾病的防治提供新的策略和依據(jù)。CC類趨化因子配體2(C-C motif ligand 2,CCL2),又稱單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1),是目前研究最廣泛的趨化因子之一。CCL2在動脈粥樣硬化形成、血管再生、心臟損傷與修復(fù)中均發(fā)揮重要作用。CCL2在急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome,ACS)患者血漿的表達顯著高于正常對照,并且其表達水平與ACS患者發(fā)生心血管事件的風險及臨床結(jié)局密切相關(guān)。CCL2及受體CCR2在人動脈粥樣硬化斑塊組織的表達也顯著高于正常動脈組織。隨后研究也在動物水平證實了CCL2及CCR2在動脈粥樣硬化中的重要作用。上述研究結(jié)果表明,CCL2及受體CCR2在動脈粥樣硬化和ACS等心血管疾病的發(fā)病中具有重要作用。然而,CCL2是否通過影響血小板聚集和活化等功能參與AMI的發(fā)生發(fā)展,目前未見相關(guān)報道。為深入明確CCL2對血小板功能的影響,本研究首先檢測CCL2在ST段抬高型心肌梗死患者(ST-elevation myocardial infarction,STEMI)血漿及罪犯冠狀動脈內(nèi)血栓組織中的表達。接下來以20例健康志愿者為研究對象,采用RT-PCR、Western Blot、免疫組織化學、免疫熒光染色、光學比濁法、流式細胞術(shù)和ELISA等方法,檢測CCL2對血小板聚集、活化、顆粒分泌和粘附功能的影響,以及PKCα-P38MAPK信號通路在其中發(fā)揮的調(diào)控作用等方面進行研究。本研究通過闡明CCL2對血小板功能的影響及其機制,不僅可能為AMI等心血管疾病的診斷和防治提供依據(jù),還試圖為尋找新型的抗血小板藥物提供新的靶點和策略。本課題的主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1、CCL2在STEMI患者血漿及罪犯冠狀動脈內(nèi)血栓組織的表達顯著高于對照組(1)本部分以40例STEMI患者以及40例年齡與性別相匹配的健康對照為研究對象。分析STEMI組和對照組的臨床基線資料發(fā)現(xiàn),STEMI組吸煙史比例、高血壓病史比例以及空腹血糖水平均顯著高于對照組(吸煙史:p=0.014;高血壓病史:p=0.004;空腹血糖水平:p=0.003),其余指標包括BMI和血脂水平等均無明顯的統(tǒng)計學差異。采用ELISA方法檢測CCL2在STEMI患者及對照組血漿中的表達。結(jié)果顯示CCL2在STEMI患者血漿的表達顯著高于對照組(299.17±78.73 pg/ml vs.177.00±30.92 pg/ml,n=40,p0.01),具有顯著的統(tǒng)計學意義。(2)應(yīng)用抽吸導管方法收集10例STEMI患者罪犯冠狀動脈內(nèi)的血栓組織,同時收集上述10例患者非罪犯冠狀動脈內(nèi)的動脈血,體外實驗制備STEMI患者非罪犯冠狀動脈血凝塊作為本部分的對照。采用實時熒光定量PCR、Western Blot、免疫組織化學及免疫熒光染色方法檢測CCL2及受體CCR2在STEMI患者罪犯冠狀動脈內(nèi)血栓組織的表達及定位情況。結(jié)果提示,在STEMI患者罪犯冠狀動脈的血栓組織中,CCL2及CCR2的m RNA和蛋白水平均顯著高于其自身非罪犯冠狀動脈的血凝塊,具有顯著的統(tǒng)計學意義(n=10,p0.01)。同時研究還發(fā)現(xiàn),在STEMI患者罪犯冠狀動脈的血栓組織中,CCL2及CCR2均能與血小板活化標志物CD62p存在共定位表達。上述結(jié)果表明,CCL2在STEMI患者血漿及罪犯冠狀動脈內(nèi)血栓組織的表達顯著高于對照組,提示CCL2在STEMI患者冠狀動脈血栓的發(fā)生發(fā)展中可能具有重要作用。2、CCL2促進血小板聚集、活化、顆粒分泌和粘附(1)本部分納入20例健康志愿者,應(yīng)用CD45+磁珠分離獲得純化的血小板后,采用RT-PCR、Western Blot和免疫熒光染色檢測CCL2的受體CCR2在人血小板上的表達情況。本研究首次證實CCR2在健康人血小板上有明顯表達。(2)以20例健康志愿者為研究對象,用CCL2重組因子刺激血小板后,采用光學比濁法、流式細胞術(shù)和ELISA等方法檢測CCL2對血小板聚集、活化、顆粒分泌及粘附功能的影響。與基線組比,CCL2濃度為100 ng/ml時可明顯增加血小板聚集率(15.03±2.44%vs.6.92±2.12%,n=20,p0.01),隨著CCL2濃度的增加,血小板聚集率也逐漸增加,呈劑量依賴模式。因此,選擇100 ng/ml作為CCL2的后續(xù)實驗濃度。采用流式細胞術(shù)檢測CCL2對血小板早期活化標志物PAC-1和血小板晚期活化標志物CD62p表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與基線組相比,CCL2能顯著增加血小板PAC-1(20.54±3.18%vs.10.23±2.58%,n=20,p0.01)和CD62p的表達(7.95±2.19%vs.5.12±0.69%,n=20,p0.01)。應(yīng)用ELISA方法檢測CCL2對血小板α顆粒分泌指標CD40L和致密顆粒分泌指標TXB2表達的影響。與基線組相比,CCL2可顯著增加血小板CD40L(160.09±19.66pg/ml vs.73.58±6.48 pg/ml,n=20,p0.01)和TXB2的表達(23.44±7.38 ng/ml vs.9.62±5.55 ng/ml,n=20,p0.01)。研究還發(fā)現(xiàn)CCL2能顯著增加與內(nèi)皮細胞粘附的血小板數(shù)目(54.25±8.42 vs.18±2.94,n=20,p0.01)。(3)應(yīng)用CCL2中和抗體或CCR2拮抗劑(RS102895)預(yù)處理血小板后,采用光學比濁法、流式細胞術(shù)和ELISA等方法檢測兩者對血小板功能的影響。與CCL2組相比,CCL2中和抗體能顯著抑制血小板聚集率(9.33±1.72%,n=20,p0.01)、血小板活化指標PAC-1和CD62p的表達(PAC-1:11.58±1.87%;CD62p:5.35±0.53%,n=20,p0.01)、血小板顆粒分泌指標CD40L和TXB2的表達(CD40L:87.88±12.01 pg/ml;TXB2:11.77±2.77 ng/ml,n=20,p0.01),以及血小板與內(nèi)皮細胞的粘附(27.25±8.66,n=20,p0.01)。此外,RS102895也能顯著降低血小板聚集率(10.58±2.07%,n=20,p0.01)、活化指標PAC-1和CD62p的表達(PAC-1:12.55±1.62%;CD62p:5.48±0.83%,n=20,p0.01)、血小板顆粒分泌CD40L和TXB2的表達(CD40L:85.69±14.68 pg/ml;TXB2:12.02±3.11 ng/ml,n=20,p0.01),以及血小板與內(nèi)皮細胞的粘附(30±6.27,n=20,p0.01)。(4)在經(jīng)典的血小板誘導劑ADP或Collagen存在時,觀察CCL2與ADP或Collagen對血小板功能的影響是否存在協(xié)同作用。與ADP組相比,CCL2與ADP聯(lián)合作用能更顯著的促進血小板聚集率(60.2±6.06%vs.43.15±8.58%,n=20,p0.01)、血小板活化標志物PAC-1和CD62p的表達(PAC-1:53.85±7.64%vs.39.34±5.31%;CD62p:34.77±2.79%vs.27.56±1.73%,n=20,p0.05)、血小板顆粒分泌指標CD40L(425.37±64.58 pg/ml vs.201.61±34.48 pg/ml;n=20,p0.01)和TXB2的表達(41.88±5.09ng/ml vs.31.24±6.74 ng/ml,n=20,p0.05)。與Collagen組相比,CCL2與Collagen聯(lián)合作用也能更顯著增加血小板聚集率(69.53±4.65%vs.53.28±9.69%,n=20,p0.01)、血小板活化指標PAC-1的表達(57.14±10.72%vs.41.34±8.00%,n=20,p0.05)、以及血小板CD40L(449.03±47.88 pg/ml vs.218.57±46.52 pg/ml,n=20,p0.01)和TXB2的表達(51.53±8.72 ng/ml vs.34.43±9.08 ng/ml,n=20,p0.05)。上述結(jié)果提示,CCL2能顯著促進血小板聚集、活化、顆粒分泌以及粘附,這些作用可以被CCL2中和抗體或CCR2拮抗劑RS102895所抑制。在對血小板功能的影響過程中,CCL2與ADP或Collagen存在一定的協(xié)同效應(yīng)。3、PKCα-P38MAPK信號通路介導CCL2對血小板功能的調(diào)控(1)鑒于PKCs、MAPKs和PI3K/AKT信號通路在調(diào)控血小板活化和顆粒分泌等方面的重要作用,采用Western Blot方法檢測CCL2對血小板PKCs、MAPKs和PI3K/AKT信號分子磷酸化水平的影響。結(jié)果顯示CCL2顯著增加血小板磷酸化PKCα和P38MAPK的表達(n=5,p0.05),而磷酸化PKCβII、ERK1/2、JNK1/2、PI3K和AKT的表達無明顯改變,總PKCα、PKCβII、P38MAPK、ERK1/2、JNK1/2、PI3K和AKT的表達也無明顯變化。應(yīng)用CCL2中和抗體和CCR2拮抗劑RS102895預(yù)處理血小板后,采用Western Blot方法檢測血小板磷酸化PKCα和P38MAPK的表達水平。發(fā)現(xiàn)CCL2中和抗體和RS102895均能顯著降低血小板磷酸化PKCα和P38MAPK的表達(n=5,p0.01)。上述結(jié)果表明CCL2可誘導血小板PKCα-P38MAPK通路的活化。(2)應(yīng)用PKCα抑制劑(RO318220)或P38MAPK選擇性抑制劑(SB203580)預(yù)處理血小板后,采用Western Blot方法檢測血小板磷酸化PKCα和P38MAPK的表達。實驗表明RO318220能顯著降低CCL2對血小板磷酸化PKCα和P38MAPK表達的影響;SB203580僅能降低血小板磷酸化P38MAPK的表達,對磷酸化PKCα的表達無影響。應(yīng)用光學比濁法、流式細胞術(shù)和ELISA等方法檢測RO318220或SB203580對血小板聚集、活化、顆粒分泌及粘附的影響。與CCL2組相比,RO318220顯著降低CCL2對血小板聚集率(8.67±1.06%,n=20,p0.01)、血小板活化指標PAC-1和CD62p表達的影響(PAC-1:11.08±2.36%;CD62p:4.93±1.92%,n=20,p0.01);RO318220也能明顯降低血小板顆粒分泌指標CD40L和TXB2表達(CD40L:85.61±7.91 pg/ml;TXB2:11.82±2.69 ng/ml,n=20,p0.01),以及血小板與內(nèi)皮細胞的粘附(24.5±8.39%,n=20,p0.01)。同樣,SB203580也可顯著降低血小板聚集率(7.1±1.51%,n=20,p0.01)、血小板活化指標PAC-1和CD62p(PAC-1:10.77±1.95%;CD62p:4.5±1.05%,n=20,p0.01)、血小板顆粒分泌指標CD40L和TXB2表達(CD40L:87.03±5.51 pg/ml;9.49±1.92 ng/ml,n=20,p0.01)、以及血小板與內(nèi)皮細胞的粘附(23.75±9.64%,n=20,p0.01)。上述結(jié)果提示,CCL2通過活化PKCα-P38MAPK信號通路來參與對血小板聚集、活化、顆粒分泌及粘附功能的調(diào)控。綜上所述,本課題發(fā)現(xiàn)CCL2在STEMI患者血漿及罪犯冠狀動脈內(nèi)血栓組織的表達均顯著高于對照組。體外實驗首先證實CCL2可顯著增加血小板聚集、活化、顆粒分泌以及血小板與內(nèi)皮細胞的粘附,并且PKCα-P38MAPK信號通路在該過程中發(fā)生明顯活化。選擇性阻斷PKCα和P38MAPK信號通路后顯著抑制CCL2對血小板聚集、活化、顆粒分泌和粘附功能的影響,提示CCL2通過活化PKCα-P38MAPK信號通路參與對血小板功能的調(diào)控。本研究初步揭示了CCL2通過PKCα-P38MAPK信號通路調(diào)控血小板的功能,不僅有助于深入認識CCL2在AMI發(fā)病中的作用,還可能為尋找新型的抗血小板藥物提供靶點和依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：CCL2 血小板聚集 血小板活化 急性心肌梗死 蛋白激酶C P38MAPK
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R542.22
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 英文摘要6-11
• 中文摘要11-16
• 第一章 前言16-20
• 第二章 CCL2在STEMI患者血漿及罪犯冠狀動脈內(nèi)血栓組織的表達檢測20-38
• 2.1 材料與方法21-31
• 2.2 結(jié)果31-36
• 2.3 討論36-37
• 2.4 小結(jié)37-38
• 第三章 CCL2對血小板聚集、活化、顆粒分泌及粘附功能的調(diào)控研究38-61
• 3.1 材料與方法39-49
• 3.2 結(jié)果49-59
• 3.3 討論59-60
• 3.4 小結(jié)60-61
• 第四章 CCL2對血小板功能調(diào)控的分子機制研究61-75
• 4.1 材料與方法62-65
• 4.2 結(jié)果65-72
• 4.3 討論72-74
• 4.4 小結(jié)74-75
• 全文總結(jié)75-77
• 參考文獻77-88
• 文獻綜述 趨化因子CCL2及受體CCR2在心血管疾病中的研究進展88-101
• 參考文獻95-101
• 攻讀博士學位期間發(fā)表及撰寫的論文101-102
• 致謝102

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王執(zhí)兵;劉俊;陳少源;蘇又蘇;謝培益;方紅城;;冠脈支架術(shù)后再狹窄血管重塑與脂聯(lián)素、單核細胞趨化因子-1和內(nèi)皮功能的相關(guān)性[J];南方醫(yī)科大學學報;2010年04期

  本文關(guān)鍵詞：趨化因子CCL2對血小板功能的調(diào)控及其機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：482437