本文關(guān)鍵詞：內(nèi)皮細(xì)胞源性KLF15調(diào)控TM激活蛋白C抗凝血途徑及MCP-1介導(dǎo)炎性反應(yīng)影響DVT形成的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本課題組前期已建立大鼠、兔等DVT動(dòng)物模型,并通過(guò)基因芯片檢測(cè)技術(shù)對(duì)血栓形成/不形成相關(guān)基因進(jìn)行了篩選分析,我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞活化、凝血/抗凝系統(tǒng)失衡及炎癥反應(yīng)與DVT形成之間關(guān)系密切。結(jié)合經(jīng)典文獻(xiàn)關(guān)于DVT的研究,本課題就鋅指樣轉(zhuǎn)錄因子15(KLF15)、炎性因子單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、抗凝血因子血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)、活化蛋白C (APC)在DVT形成中的作用及其調(diào)控關(guān)系從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面進(jìn)行研究。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,對(duì)KLF15、MCP-1、TM、APC在下腔靜脈狹窄法DVT小鼠靜脈壁組織及APC在小鼠血漿中的表達(dá)變化和其作用作一初步研究：細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,在凝血酶(Thrombin)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)損傷模型中,siRNA干擾KLF15表達(dá),研究其與下游TM的調(diào)控關(guān)系；入臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中沉默/過(guò)表達(dá)MCP-1,研究其調(diào)控的下游關(guān)鍵基因及信號(hào)通路變化,分析上述變化與DVT形成的關(guān)系。目的：1.建立C57小鼠下腔靜脈狹窄法DVT模型,造模后24小時(shí)獲取小鼠下腔靜脈壁組織并采集血液分離血漿,HE染色觀察造模小鼠建模后血栓形成情況并檢測(cè)靜脈壁組織中KLF15、MCP-1、TM、APC及血漿中APC在DVT形成前后的表達(dá)變化,分析其與DVT形成的關(guān)系；2.研究Thrombin對(duì)HUVECs表達(dá)KLFs家族關(guān)鍵成員及下游凝血/抗凝、炎癥、粘附因子的影響；確定Thrombin誘導(dǎo)HUVECs表達(dá)KLF15的最適濃度及時(shí)間點(diǎn)位；研究Thrombin靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型中siRNA干擾抑制KLF15表達(dá)后,其與下游基因TM的調(diào)控關(guān)系；3.構(gòu)建MCP-1過(guò)表達(dá)/干擾載體,轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,研究其下游基因及信號(hào)通路變化與DVT形成的關(guān)系。方法：1.120只C57小鼠分為正常組40只、假手術(shù)組40只、DVT組40只,DVT組采用下腔靜脈狹窄法造模,造模24小時(shí)后獲取小鼠下腔靜脈組織并采集血液分離血漿；real-time PCR法檢測(cè)KLF15、MCP-1、TM的表達(dá),ELISA法檢測(cè)靜脈組織及血漿中APC的表達(dá)；獲取的下腔靜脈組織HE染色觀察血栓形成情況。2.以0、2、4u/ml濃度的Thrombin分別處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)8小時(shí),檢測(cè)KLF2、KLF4、 KLF5、 KLF6、 KLF10、KLF11、KLF15表達(dá)；檢測(cè)Thrombin不同濃度(0.2u/ml、4u/ml、8u/ml)處理內(nèi)皮細(xì)胞8小時(shí),以及Thrombin (4u/ml)作用不同時(shí)間(0、4h、8h、12h)后KLF15的表達(dá),確定在Thrombin誘導(dǎo)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)KLF15最適濃度及時(shí)間點(diǎn)位；以4u/ml濃度的Thrombin處理HUVEC細(xì)胞8小時(shí)后檢測(cè)抗凝因子(TM)、抗纖溶因子(PAI-1)、粘附因子(VCAM)的表達(dá);siRNA干擾KLF15后,檢測(cè)下游TM、PAI-1及VCAM表達(dá),研究KLF15與下游基因的調(diào)控關(guān)系。3.培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC),行MCP-1免疫熒光及免疫共沉淀檢測(cè),構(gòu)建人MCP-1過(guò)表達(dá)/干擾載體MCP-1-pCDH-GFP/MCP-1-LMP-shRNAmirl經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染后感染HUVECs,檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率,行基因芯片檢測(cè)研究其下游的基因及信號(hào)通路變化與DVT形成的關(guān)系。結(jié)果：1.DVT組成栓率85.3%、死亡率15%、狹窄率90.8%±0.8%、殘余管腔橫截面積百分比9.2%±0.8%、血栓長(zhǎng)度5.85+0.25mm、血栓濕重0.27+0.02g、下腔靜脈直徑0.99±0.04mm; real-time PCR檢測(cè)正常組、假手術(shù)組、DVT組小鼠靜脈組織中KLF15、MCP-1、TM mRNA表達(dá)發(fā)現(xiàn),KLF15、MCP-1在DVT組與正常組、假手術(shù)組相比表達(dá)上調(diào)(P0.05),TM在DVT組與正常組相比表達(dá)上調(diào)(P0.05),3個(gè)基因在正常組、假手術(shù)組之間不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。ELISA檢測(cè)正常組、假手術(shù)組、DVT組小鼠血漿中APC蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn),APC在DVT組較正常組、假手術(shù)組相比表達(dá)上調(diào)(P0.05), APC在正常組、假手術(shù)組之間不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。ELISA測(cè)定正常組、假手術(shù)組、DVT組小鼠靜脈組織中APC蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn),APC在DVT組較正常組、假手術(shù)組相比表達(dá)下調(diào)(P0.05), APC在正常組、假手術(shù)組之間不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.以0、2、4u/ml濃度的Thrombin分別處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)8小時(shí)后,KLF2、KLF4、KLF5、 KLF6、 KLF10表達(dá)顯著下調(diào)(P0.05)、KLF11、KLF15表達(dá)顯著上調(diào)(P0.05)。以0、2、4、8u/ml濃度的Thrombin處理HUVEC細(xì)胞8小時(shí),KLF15在Thrombin濃度4 u/ml時(shí)KLF15表達(dá)至峰值(P0.05),以4u/ml濃度的Thrombin處理HUVEC細(xì)胞0、4、8、12小時(shí),KLF15在4小時(shí)及8小時(shí)表達(dá)上調(diào)(P0.05)。Thrombin誘導(dǎo)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)KLF15最適濃度為4u/ml,作用時(shí)間為8小時(shí)。以4u/ml濃度的Thrombin處理HUVEC細(xì)胞8小時(shí)后,TM、PAI-1表達(dá)較對(duì)照組表達(dá)上調(diào)(P0.05),VCAM較對(duì)照組表達(dá)下調(diào)但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。KLF15、TM在Thrombin+KLF15 siRNA組較Thrombin組表達(dá)下調(diào)(P0.05);PAI-1在Thrombin組與Thrombin+KLF15 siRNA組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),與KLF15調(diào)控?zé)o關(guān)。VCAM在Thrombin組、KLF15 siRNA組及Thrombin+KLF15 siRNA組表達(dá)均下調(diào),與KLF15調(diào)控?zé)o關(guān)。3.MCP-1過(guò)表達(dá)/沉默后,基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與正常細(xì)胞相比,MCP-1過(guò)表達(dá)組下調(diào)的基因有158個(gè),下調(diào)的信號(hào)通路有18條,上調(diào)的基因有71個(gè),上調(diào)的信號(hào)通路有7條；MCP-1干擾組下調(diào)的基因有1390個(gè),下調(diào)的信號(hào)通路有60條,上調(diào)的基因有250個(gè),上調(diào)的信號(hào)通路有15條。IL-6、MMP-3、MMP-19、VEGF在MCP-1過(guò)表達(dá)組、MCP-1干擾組中的表達(dá)均較正常組細(xì)胞有顯著變化,表達(dá)變化趨勢(shì)為在MCP-1過(guò)表達(dá)組中表達(dá)上調(diào),在MCP-1干擾組中表達(dá)下調(diào)。MCP-1過(guò)表達(dá)組、MCP-1干擾組、正常組細(xì)胞比較變化顯著的信號(hào)通路有MAKP signaling pathways、PI3K-AKT signaling pathways。結(jié)論：1.30G針頭建立C57小鼠下腔靜脈狹窄法DVT模型成栓率高,死亡率低,在造模后24小時(shí)可形成完全性血栓,是穩(wěn)定、可靠的小鼠下腔靜脈狹窄法DVT模型。2.DVT形成初期凝血/抗凝血系統(tǒng)失平衡,蛋白C抗凝系統(tǒng)被激活。DVT形成初期MCP-1、TM在血栓形成過(guò)程中可能起到重要作用。3.凝血酶誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞模型中,KLF15可能調(diào)控下游TM表達(dá)。4.MCP-1在DVT炎癥反應(yīng)中可能與IL-6存在調(diào)控或協(xié)同作用,在血栓溶解過(guò)程中可能與MMP-3、MMP-19存在調(diào)控或協(xié)同作用,在血管重塑方面可能與VEGF存在調(diào)控或協(xié)同作用。MCP-1可能通過(guò)MAKP和PI3K-AKT信號(hào)通路參與內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)、血管重塑及血栓消退影響DVT形成。
【關(guān)鍵詞】：鋅指樣轉(zhuǎn)錄因子15 單核細(xì)胞趨化因子-1 血栓調(diào)節(jié)蛋白 凝血酶 深靜脈血栓形成 靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 炎癥反應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R543.6
【目錄】：

• 中文摘要5-9
• 英文摘要9-13
• 中英文縮略詞表13-15
• 前言15-22
• 第一部分：建立C57小鼠下腔靜脈狹窄法DVT模型,檢測(cè)靜脈組織中KLF15、MCP-1、TM、APC及血漿中APC的表達(dá)22-50
• 材料和方法22-34
• 結(jié)果34-43
• 討論43-49
• 結(jié)論49-50
• 第二部分：Thrombin靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型中KLF15與下游TM基因調(diào)控關(guān)系的研究50-82
• 材料和方法50-59
• 結(jié)果59-72
• 討論72-81
• 結(jié)論81-82
• 第三部分：MCP-1轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)表達(dá)/沉默研究82-123
• 材料和方法82-96
• 結(jié)果96-114
• 討論114-122
• 結(jié)論122-123
• 參考文獻(xiàn)123-133
• 附錄133-140
• 文獻(xiàn)綜述140-145
• 參考文獻(xiàn)142-145
• 攻讀學(xué)位期間參加科研及文章發(fā)表情況145-146
• 致謝146

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 徐榮豐;高大勝;王紅雷;;血清新蝶呤和單核細(xì)胞趨化蛋白-1在冠心病患者血清中的表達(dá)及意義[J];中國(guó)心血管病研究雜志;2007年06期

2 李海燕;鄭有光;楊曉芬;程維剛;陳麗萍;;兔急性多發(fā)微小肺血栓栓塞癥后血清血栓調(diào)節(jié)蛋白的變化[J];中國(guó)老年學(xué)雜志;2011年15期

3 宋軍鋒;陳小平;李潤(rùn)琴;黃陽(yáng)霞;;MCP-1與急性冠脈綜合征患者冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)的相關(guān)性研究[J];中國(guó)醫(yī)療前沿;2011年21期

  本文關(guān)鍵詞：內(nèi)皮細(xì)胞源性KLF15調(diào)控TM激活蛋白C抗凝血途徑及MCP-1介導(dǎo)炎性反應(yīng)影響DVT形成的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：476184