本文關(guān)鍵詞：HPV-16感染對(duì)非小細(xì)胞肺癌和A549細(xì)胞的影響及miRNAs表達(dá)改變的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[背景與目的]人乳頭狀瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)是一種嗜上皮性病毒,有高度的特異性,有些型別HPV與惡性腫瘤發(fā)生的密切相關(guān),稱(chēng)為高危型HPV。1995年世界衛(wèi)生組織(WHO)、國(guó)際癌癥研究學(xué)會(huì)(IARC)就將HPV16和18型歸為致癌性的一類(lèi)型中,同時(shí)宣布HPV感染是引起宮頸癌最主要的病因。近20年來(lái)的研究表明,高危型HPV感染除了與宮頸癌關(guān)系密切外,還可能與肺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤之一,吸煙、大氣污染等是肺癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素已得到大家的普遍認(rèn)可,但其確切病因仍尚不十分明確。近20年來(lái)HPV感染與肺癌的病因?qū)W關(guān)系已逐漸引起研究者們的注意。云南省尤其是宣威、個(gè)舊地區(qū)肺癌的發(fā)生率和死亡率高居全國(guó)首位,近30年來(lái),相關(guān)部門(mén)針對(duì)相關(guān)的防護(hù)措施采取了積極行動(dòng),但肺癌的發(fā)病率和死亡率仍居高不下,成為嚴(yán)重威脅我省人民生命健康的主要因素之一。HPV感染在云南地區(qū)肺癌的感染情況如何?二者是否具有相關(guān)性?闡明二者的關(guān)系將對(duì)云南地區(qū)肺癌的防治具有十分重大的意義。本課題我們擬對(duì)收集的云南地區(qū)的94例肺癌,48例肺良性病變的新鮮冰凍組織標(biāo)本進(jìn)行HPV DNA檢測(cè)并分型,了解云南地區(qū)肺癌HPV感染情況及常見(jiàn)HPV型別。E6和E7是HPV基因組早期區(qū)基因編碼的主要的致癌蛋白。將HPV-16E6-E7基因整合入A549細(xì)胞中的關(guān)鍵在于載體的選擇。慢病毒載體(Lentivirus vector)具有感染譜廣泛,能有效感染各期細(xì)胞,轉(zhuǎn)移基因片段容量大,長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)外源基因等顯著優(yōu)點(diǎn),且不產(chǎn)生任何有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答,是將基因整合入細(xì)胞的良好運(yùn)載工具。本研究設(shè)計(jì)通過(guò)將重組HPV-16E6-E7基因的慢病毒感染人肺腺癌A549細(xì)胞,分析觀察HPV-16E6-E7基因轉(zhuǎn)染對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞生物學(xué)行為所發(fā)生的變化。miRNA (microRNA)在生物體生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程中起著非常關(guān)鍵的作用。許多腫瘤中有的miRNAs表達(dá)上調(diào),有的miRNAs表達(dá)下調(diào),可能發(fā)揮著癌基因或抑癌基因的作用。目前對(duì)HPV相關(guān)非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC) 的 miRNAs表達(dá)改變的研究較少。本研究采用miRNA表達(dá)譜芯片技術(shù)結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)檢測(cè)人肺腺癌A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染HPV-16 E6-E7前后miRNAs表達(dá)水平的變化,以期探索HPV-16感染對(duì)肺癌niRNAs表達(dá)的影響,為高危HPV致癌機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。[方法]1、收集94例非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和48例肺良性病變組織,應(yīng)用基因組DNA小量試劑盒提取組織標(biāo)本基因組DNA；通過(guò)基因測(cè)序法對(duì)HPV-DNA陽(yáng)性標(biāo)本的型別進(jìn)行檢測(cè)。2、結(jié)合病人的臨床資料,對(duì)HPV感染與肺癌的相關(guān)性進(jìn)行分析。3、采用基因重組技術(shù)獲得HPV-16 E6-E7基因的慢病毒,通過(guò)基因測(cè)序等方法鑒定其準(zhǔn)確性。4、重組HPV-16 E6-E7'漫病毒進(jìn)行包裝后感染人腺癌A549細(xì)胞,通過(guò)RT-PCR和Western-blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染得到A549細(xì)胞能表達(dá)目的基因E6-E7及E6、E7蛋白。5、用CCK-8試劑盒、流式細(xì)胞儀、酶聯(lián)免疫吸附法、Transwell、室等檢測(cè)重組HPV-16 E6-E7慢病毒感染A549細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、體外侵襲能力等方面的變化。6、應(yīng)用基因芯片和qPT-PCR的方法對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染HPV-16 E6-E7前后miRNAs表達(dá)譜進(jìn)行分析。[結(jié)果]1、94例非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本HPV陽(yáng)性者28例,總陽(yáng)性率為29.8%(28/94)；48例肺良性病變組織HPV陽(yáng)性者5例,陽(yáng)性率7.8%(5/48)。經(jīng)測(cè)序分型均為單純HPV-16型感染。2、HPV陽(yáng)性與HPV陰性肺癌組進(jìn)行比較分析,二者在年齡、性別、吸煙史、病理類(lèi)型、分化程度及TNM分期之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3、重組獲得的HPV-16 E6-E7基因的慢病毒載體經(jīng)基因測(cè)序表明連接正確。4、經(jīng)重組IPV-16E6-E7慢病毒感染、RT-PCR和Western-blot驗(yàn)證,獲得了穩(wěn)定表達(dá)E6-E7基因的A549細(xì)胞。5、HPV-16 E6-E7基因轉(zhuǎn)染人肺腺癌A549細(xì)胞后,G0/G1期細(xì)胞比例減少,S期和G2/M期細(xì)胞比例增加,凋亡減少,細(xì)胞增殖活躍,侵襲力增強(qiáng)。6、基因芯片檢測(cè)結(jié)果顯示：在轉(zhuǎn)染HPV-16 E6-E7基因的肺腺癌A549細(xì)胞中,9個(gè)miRNA是下調(diào)的,12個(gè)miRNA是上調(diào)的,其中hsa-miR-7d-5p的上調(diào)最顯著。[結(jié)論J1、HPV感染與云南地區(qū)NSCLC的發(fā)生相關(guān),云南地區(qū)肺癌感染的HPV型別主要是HPV-16型。2、HPV-16感染與非小細(xì)胞肺癌患者的年齡、性別、吸煙、病理類(lèi)型、分化程度及TNM分期均無(wú)關(guān)。3、HPV-16 E6-E7基因轉(zhuǎn)染人肺腺癌A549細(xì)胞后,凋亡減少,細(xì)胞增殖力和侵襲力增強(qiáng)。4、HPV-16 E6-E7基因轉(zhuǎn)染肺腺癌A549細(xì)胞后,hsa-miR-7d-5p的上調(diào)最顯著。hsa-let-7d-5p可能是與HPV致癌過(guò)程關(guān)系最為密切的miRNA;
【關(guān)鍵詞】：HPV 非小細(xì)胞肺癌 A549細(xì)胞 microRNA
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R734.2
【目錄】：

• 英文縮寫(xiě)詞一覽表(按字母順序)8-10
• 中文摘要10-13
• Abstract13-17
• 前言17-19
• 第一部分 HPV感染與非小細(xì)胞肺癌的相關(guān)性研究19-44
• 前言19-21
• 1. 材料與方法21-26
• 2. 結(jié)果26-35
• 3. 討論35-39
• 4. 結(jié)論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-44
• 第二部分 HPV-16 E6-E7基因轉(zhuǎn)染對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的影響44-88
• 前言44-45
• 1. 材料和方法45-67
• 2. 結(jié)果67-82
• 3. 討論82-85
• 4. 結(jié)論85-86
• 參考文獻(xiàn)86-88
• 第三部分 HPV-16感染對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞中miRNAs表達(dá)改變的研究88-113
• 前言88-90
• 1. 材料與方法90-100
• 2. 結(jié)果100-107
• 3. 討論107-109
• 4. 結(jié)論109-110
• 參考文獻(xiàn)110-113
• 全文小結(jié)113-114
• 研究的創(chuàng)新和特色114-115
• 文獻(xiàn)綜述115-124
• 參考文獻(xiàn)119-124
• 博士研究生在讀期間發(fā)表的論文124-125
• 致謝125

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

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  本文關(guān)鍵詞：HPV-16感染對(duì)非小細(xì)胞肺癌和A549細(xì)胞的影響及miRNAs表達(dá)改變的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：465537