本文關(guān)鍵詞：先天性巨結(jié)腸腸神經(jīng)系統(tǒng)及血清中Neuroligin基因與谷氨酸的表達(dá)和意義，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：作為一種常見的消化道先天性畸形和典型的腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常性疾病,先天性巨結(jié)腸(Hischsprung's disease, HD)的大體病理改變主要為病變腸段腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的缺如,病變腸管痙攣狹窄,病變腸段近端的結(jié)腸由于蠕動加強(qiáng)而代償性肥厚擴(kuò)大,最終引起巨結(jié)腸的發(fā)生。臨床上以嘔吐、腹脹、便秘為主要表現(xiàn),可出現(xiàn)腸梗阻、腸穿孔以及小腸結(jié)腸炎等并發(fā)癥,嚴(yán)重者會危及生命。雖然關(guān)于其病因研究的學(xué)說有很多,但都不能完全解釋其發(fā)病機(jī)制。在常見的基因異常學(xué)說中,與HD密切相關(guān)的RET等許多基因(SOX10基因、ECE1基因等)的突變只在大約50%的家族性病例患兒和7%到35%的散發(fā)病例患兒中發(fā)現(xiàn),所以這種學(xué)說無法全面地解釋HD的發(fā)病機(jī)制；腸道微環(huán)境異常學(xué)說認(rèn)為細(xì)胞外基質(zhì)成分的過度增多,導(dǎo)致了腸神經(jīng)嵴細(xì)胞由于過早分化、成熟、粘附、聚集而無法正常遷移達(dá)到結(jié)腸遠(yuǎn)端導(dǎo)致了該消化道畸形的發(fā)生,然而有研究發(fā)現(xiàn)盡管在HD患兒痙攣段腸管中未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,但在其盆腔神經(jīng)叢支配的膀胱、前列腺等臟器內(nèi)卻發(fā)現(xiàn)了正常的的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,故僅用腸道微環(huán)境的異常解釋導(dǎo)致腸神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移的停止而導(dǎo)致HD發(fā)生也是不全面的；此外還有腸道Cajal間質(zhì)起搏細(xì)胞(inters titial cells of cajal, ICC)異常學(xué)說認(rèn)為ICC數(shù)量的減少和網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)的破壞與HD關(guān)系密切,由于ICC的異常導(dǎo)致腸道起搏功能的障礙,使腸道慢波活動喪失,導(dǎo)致HD的發(fā)病。但是同時也有實驗證實有些HD病例的無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段中ICC的分布及數(shù)量與正常腸管并無太大差異。所以這種單一的理論也無法完全闡釋HD的發(fā)病機(jī)理。這些學(xué)說都只是在某一方面說明一部分病人的發(fā)病機(jī)制,不能形成一套統(tǒng)一全面的基礎(chǔ)理論。而由于基礎(chǔ)理論的不確定,導(dǎo)致對該病的診斷、鑒別以及分型都存在一定的局限和困難。本研究擬從神經(jīng)系統(tǒng)突觸發(fā)育異常的角度,討論已經(jīng)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System, CNS)中研究地較為深入的突觸后跨膜吸附蛋白的編碼基因Neuroligin基因及相應(yīng)的突觸后跨膜吸附蛋白Neuroligins蛋白在HD腸神經(jīng)系統(tǒng)(Enteric Nervous System, ENS)中肌間神經(jīng)叢Cajal間質(zhì)細(xì)胞(inters titial cells of cajal within the myenefic region, ICC-MY)的表達(dá)情況,并進(jìn)一步研究Neuroligin-1蛋白亞型及其相關(guān)的谷氨酸(Glutamate, G lu)在HD病人腸管ENS中和血液中的表達(dá),從ENS突觸功能異常的角度討論Neuroligin基因及Glu的表達(dá)和變化與HD發(fā)病的關(guān)系,進(jìn)而探討其對HD發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)研究和臨床實踐的意義。方法：腸管和血液標(biāo)本取自2010年至2013年間山東大學(xué)齊魯醫(yī)院小兒外科收治的90例病理診斷為HD的患兒(短段型50例,長端型40例),另取50例腹股溝斜疝患兒(indirect inguinal hernia, IIH)的血液標(biāo)本作為對照。為減小研究誤差,我們控制入選研究的各組患兒的年齡、基礎(chǔ)代謝率以及營養(yǎng)狀況(包括身長、體重、血清總蛋白、血清白蛋白、血紅蛋白、血尿素氮等等)之間無統(tǒng)計學(xué)差異。收集HD切除腸管的狹窄段(無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段)、移行段和擴(kuò)張段近端(正常段、有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段)。部分新鮮組織置于-80℃儲存用于Vestern-blot和 qRT-PCR,進(jìn)行Neuroligin-1,2,3,4 (Neuroligins)、Neuroligin-1和Glu的定量分析和比較；部分組織制備腸肌間神經(jīng)叢鋪片(Longitudinal muscle with adherent myenteric plexus, LMMP)用于免疫化學(xué)染色研究Neuroligins、Neuroligin-1和 Glu在ENS的表達(dá)情況和ICC-MY的分離培養(yǎng)；部分組織制備石蠟切片用于免疫組化染色研究Neuroligin-1的表達(dá)情況；免疫磁珠分選(Magnetic-activated Cell Sorting, MACS)和流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)用于ICC-MY的分選和計數(shù)。收集HD和IIH患兒的血清,-80℃儲存?zhèn)溆?使用ELISA技術(shù)檢測各自的血清Glu含量并通過進(jìn)行長段型HD、短段型HD和非HD之間的比較研究其對HD診斷、鑒別以及臨床分型的重要意義。數(shù)據(jù)采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,兩組數(shù)據(jù)組間比較采用配對t檢驗進(jìn)行分析,三組數(shù)據(jù)之間兩兩比較采用單因素方差分析和Turkey's檢驗進(jìn)行分析。使用SPSS11.5和GraphPad Prism5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,P0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果：(1)對LMMP進(jìn)行免疫組化染色證實ICC-MY表達(dá)于LMMP,細(xì)胞之間相互聯(lián)系從而構(gòu)成網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu),且該網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)在無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段和有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段之間并無明顯差異。(2)對LMMP進(jìn)行雙重免疫熒光染色證實Neuroligin-1,2,3,4蛋白表達(dá)于ICC-MY,且Neuroligins蛋白在無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段構(gòu)成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)不完整,說明Neuroligins蛋白在無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段表達(dá)減少。(3)以新鮮LMMP分離培養(yǎng)細(xì)胞后,通過MACS純化分選出ICC-MY,并使用FCM進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),證實雖然分選出的ICC-MY細(xì)胞數(shù)由擴(kuò)張段近端到移行段再到狹窄段逐漸減少,但三組細(xì)胞中含有的ICC-MY比例并無明顯差異。(4)使用細(xì)胞免疫熒光染色對分選出的細(xì)胞進(jìn)行染色,證實為梭形和紡錘形的ICC-MY。(5)以ICC-MY的特異性抗體C-kit為參考,使用Western-blot技術(shù)對來自狹窄段、移行段、擴(kuò)張段近端的細(xì)胞中的Neuroligins蛋白進(jìn)行分析,證實Neuroligins蛋白的表達(dá)量由擴(kuò)張段近端到移行段再到狹窄段逐漸降低。(6)雙重免疫熒光技術(shù)顯示Neuroligin-1蛋白和Glu在LMMP表達(dá)于同一部位且在無神經(jīng)細(xì)胞段的表達(dá)少于有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段。(7)免疫組化顯示,Neuroligin-1蛋白在石蠟切片的表達(dá)由擴(kuò)張段近端到移行段再到狹窄段逐漸減少,Glu在LMMP的表達(dá)也由擴(kuò)張段近端到移行段再到狹窄段逐漸減少。(8)Western-blot和qRT-PCR顯示Neuroligin-1和Glu的表達(dá)由擴(kuò)張段近端到移行段再到狹窄段逐漸減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,與免疫化學(xué)顯示結(jié)果相符。(9)ELISA檢測血清Glu顯示,由長段型HD到短段型HD再到非HD,血清Glu的含量逐漸增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：通過上述實驗和所得到的結(jié)果我們可以得到以下結(jié)論：(1) Neuroligins蛋白表達(dá)于HD患兒ENS中的ICC-MY,其表達(dá)量由狹窄段到移行段再到擴(kuò)張段近端的變化可能會導(dǎo)致ICC-MY突觸功能的異常,突觸功能的異常會進(jìn)而影響ENS中神經(jīng)沖動和神經(jīng)信號的傳遞,繼而導(dǎo)致由ICC-MY引發(fā)的腸道起搏功能受損,使得病變段的腸管喪失蠕動功能,最終導(dǎo)致HD的發(fā)生。(2)N euroligin-1蛋白亞型和與其密切相關(guān)的Glu在HD患兒的ENS同一部位表達(dá),這不僅可能作為ENS中神經(jīng)元,特別是興奮性神經(jīng)后突觸的新的分子標(biāo)記,其表達(dá)量由狹窄段到移行段再到擴(kuò)張段近端的變化也可能會通過引發(fā)興奮性突觸后功能的異常進(jìn)而導(dǎo)致腸道舒縮異常最終形成了HD的發(fā)生。(3)血清Glu含量的檢測以及其在不同組別表達(dá)量的不同對HD的診斷、鑒別診斷和分型有重要的臨床意義,提示我們可以在影像學(xué)檢查的基礎(chǔ)上結(jié)合血液學(xué)的實驗室檢測手段,進(jìn)一步提高HD診斷,特別是新生兒HD診斷的準(zhǔn)確率以及為HD的分型(長段型、短段型、常見型等)提供新的參考依據(jù)。通過我們的研究,從新的角度探究了HD的發(fā)病機(jī)制并初步探討了對HD的診斷、鑒別診斷等有重要意義的新的實驗室方法,這為HD的基礎(chǔ)研究和臨床實踐提供了新的方向和科研思路。
【關(guān)鍵詞】：先天性巨結(jié)腸 Neuroligin 腸神經(jīng)系統(tǒng) cajal間質(zhì)細(xì)胞 谷氨酸
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R726.5
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 符號說明14-16
• 前言16-20
• 實驗材料和方法20-34
• 實驗結(jié)果34-40
• 討論40-50
• 結(jié)論50-52
• 創(chuàng)新點及不足之處52-53
• 附表及附圖53-71
• 參考文獻(xiàn)71-79
• 致謝79-81
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文81-82
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況82-83
• 外文論文一83-104
• 外文論文二104-126

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 陳敏,羅和生;腸神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)肽對免疫系統(tǒng)的作用[J];國外醫(yī)學(xué)(內(nèi)科學(xué)分冊);2005年07期

2 汪海全;劉洪濤;吳秀卿;;腸神經(jīng)系統(tǒng)[J];長江大學(xué)學(xué)報(自科版);2006年12期

3 劉興攀,張文同,董志行,張金哲;先天性巨結(jié)腸c-kit~+腸間質(zhì)細(xì)胞分布的免疫組織化學(xué)研究[J];中華小兒外科雜志;2003年02期

  本文關(guān)鍵詞：先天性巨結(jié)腸腸神經(jīng)系統(tǒng)及血清中Neuroligin基因與谷氨酸的表達(dá)和意義，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：464057