本文關(guān)鍵詞：人類表皮生長(zhǎng)因子受體2參與結(jié)直腸腺癌增生的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分Her2在結(jié)直腸癌細(xì)胞株的胞膜及胞漿表達(dá)并可促進(jìn)癌細(xì)胞的增生1.研究背景和目的在世界范圍內(nèi),結(jié)直腸癌在女性癌癥患者中的發(fā)病率占第二位,在男性癌癥患者中的發(fā)病率占第三位。對(duì)結(jié)直腸癌的發(fā)生和進(jìn)展與信號(hào)通路及其具體機(jī)制的研究一直是醫(yī)學(xué)界的熱點(diǎn),探討和發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)和治療方法對(duì)改善結(jié)直腸癌患者的生活質(zhì)量,提高患者的生存時(shí)間都有著重要的價(jià)值和意義。人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(Her2)是重要的乳腺癌預(yù)后判斷因子,Her2陽(yáng)性(擴(kuò)增或過(guò)表達(dá))與乳腺癌的預(yù)后顯著相關(guān)。有關(guān)Her2與大腸癌的關(guān)系的研究做了很多,但目前仍尚未達(dá)成一致的結(jié)論,臨床方面也缺乏明確的針對(duì)Her2基因在結(jié)直腸癌治療和預(yù)后判斷方面的明確的指南。進(jìn)一步的深入研究Her2基因在結(jié)直腸癌的表達(dá),并了解其對(duì)結(jié)直腸癌治療的潛在應(yīng)用價(jià)值有著重要的臨床意義。本研究通過(guò)檢測(cè)5種人結(jié)直腸癌細(xì)胞株中Her2 mRNA的表達(dá),建立穩(wěn)定表達(dá)Her2基因的人結(jié)直腸癌細(xì)胞株,siRNA敲減Her2基因表達(dá)的人結(jié)直腸癌細(xì)胞株,通過(guò)CCK8檢測(cè)法、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)等研究方法,觀察Her2對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的體外增殖、遷移和侵襲能力的影響。2.材料和方法2.1細(xì)胞人結(jié)直腸癌細(xì)胞株DLD-1、HCT8、HT29、HCT116、SW480購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù),人乳腺癌細(xì)胞株SK-BR-3購(gòu)自ACTT細(xì)胞庫(kù)。2.2 Real-time RT-PCR檢測(cè)采用SYBR(?)Premix Ex Taq real time PCR Kit(TAKARA)檢測(cè)五種人結(jié)直腸癌細(xì)胞株DLD-1、HCT8、HT29、HCT116、SW480及一種人乳腺癌細(xì)胞株SK-BR-3中的Her2表達(dá)。2.3建立穩(wěn)定的過(guò)表達(dá)Her2基因的人結(jié)直腸癌細(xì)胞株(SW480)以及siRNA沉默Her2表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞株(HT-29)通過(guò)將Her2基因的胞外區(qū)的近膜部分序列插入真核表達(dá)載體PIRES2-EGFP中,構(gòu)建質(zhì)粒PIRES2-EGFP-HER2,從而建立穩(wěn)定表達(dá)Her2基因的人結(jié)直腸癌細(xì)胞株(SW480)。用重組慢病毒Her2-RNAi-LV轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT-29,建立siRNA沉默Her2基因表達(dá)的細(xì)胞株。2.4免疫組化法檢測(cè)Her2蛋白的表達(dá)部位分別用兩種不同的Her2單克隆抗體,采用免疫組化方式檢測(cè)膜內(nèi)部分的Her2表達(dá)(Ab-3)及膜外部分的Her2表達(dá)(CB11)。細(xì)胞免疫組化胞膜染色的結(jié)果判讀使用胃癌Her2的染色判讀和評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),即1+結(jié)果是指10%腫瘤細(xì)胞微弱或隱約可見細(xì)胞膜染色。2+結(jié)果是指10%腫瘤細(xì)胞有弱至中度的基底側(cè)膜、側(cè)膜或完全性胞膜染色。3+結(jié)果是指10%腫瘤細(xì)胞基底側(cè)膜、側(cè)膜或完全性胞膜強(qiáng)染色。2.5 CCK8法、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)通過(guò)上述方法研究Her2對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞株體外增殖、遷移和侵襲能力的影響。2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理利用統(tǒng)計(jì)軟件IBM SPSS19.0對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間差異分析采用Student's t檢驗(yàn),多組間差異分析采用Oneway ANOVA檢驗(yàn),率的組間比較采用卡方檢驗(yàn)。P0.05為有顯著差異。3.研究結(jié)果3.1結(jié)直腸癌細(xì)胞株中Her2的表達(dá)5種人結(jié)直腸癌細(xì)胞株中,HT29細(xì)胞株存在Her2基因mRNA水平高表達(dá)。其它細(xì)胞株少量表達(dá)或不表達(dá)Her2基因。免疫組化結(jié)果顯示,Her2單克隆抗體Ab-3表達(dá)于SK-BR-3的胞漿及HT29的胞漿,判讀結(jié)果結(jié)果均顯示為弱陽(yáng)性至強(qiáng)陽(yáng)性不等。DLD-1、HCT8、HCT116、SW480的Ab-3染色均為陰性。Her2單克隆抗體CB11表達(dá)于SK-BR-3的胞漿及HT29的胞膜,判讀后的結(jié)果均顯示為2+至3+不等。DLD-1、HCT8、HCT116、SW480的CB11染色均為陰性。3.2 Her2基因過(guò)表達(dá)增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力培養(yǎng)高表達(dá)Her2的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞株,用CCK-8法連續(xù)檢測(cè)5天的吸光度值,同樣的樣本做3個(gè)重復(fù),檢測(cè)轉(zhuǎn)染后SW480細(xì)胞增殖能力的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn),SW480 PIRES2-EGFP-Her2細(xì)胞的增殖能力較對(duì)照組增強(qiáng),兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。3.3 Her2基因過(guò)表達(dá)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移用Transwell小室檢測(cè)Her2的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染大腸癌細(xì)胞株SW480的侵襲能力的改變。將細(xì)胞種在8.0um孔徑的上室內(nèi),36小時(shí)后,觀察室細(xì)胞穿過(guò)聚碳酸酯膜進(jìn)入下室的多少,了解腫瘤細(xì)胞的遷移能力。結(jié)晶紫染色后,倒置顯微鏡下取5個(gè)200倍視野計(jì)數(shù),然后取平均數(shù),SW480 PIRES2-EGFP-Her2與SW480PIRES2-EGFP空載體相比穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)明顯增加,統(tǒng)計(jì)學(xué)兩組差異具有顯著意義。3.4 RNAi沉默HERG2抑制HT29腫瘤細(xì)胞體外的侵襲能力經(jīng)siRNA沉默Her2的大腸癌細(xì)胞株HT29侵入下層的細(xì)胞數(shù)較空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組明顯減少,侵襲能力明顯降低。(三次獨(dú)立試驗(yàn),t檢驗(yàn),p=0.003),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組侵入下層的細(xì)胞數(shù)差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。4.結(jié)論Her2基因在結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT-29中存在高表達(dá),而DLD-1、HCT8、 HCT116、SW480中沒(méi)有Her2基因的表達(dá)或僅有低表達(dá)。這一現(xiàn)象說(shuō)明Her2基因在某些人類結(jié)直腸癌中可存在Her2基因擴(kuò)增和過(guò)表達(dá),進(jìn)一步的結(jié)果表明,Her2基因在人類結(jié)直腸癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力,增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力。RNAi沉默HER2抑制HT29腫瘤細(xì)胞體外的侵襲能力。本部分的結(jié)果顯示,Her2在人類結(jié)直腸癌有重要作用,Her2基因擴(kuò)增和過(guò)表達(dá)會(huì)影響結(jié)直腸癌細(xì)胞株的增殖和侵襲能力。第二部分 兔單克隆抗體SP3和4B5對(duì)Her2蛋白在大腸癌表達(dá)的免疫組化結(jié)果評(píng)估1.研究背景和目的結(jié)直腸癌占全球每年新發(fā)癌癥的8.5%。在美國(guó)結(jié)直腸癌是排名第二的與癌癥的死亡率相關(guān)的疾病。人表皮生長(zhǎng)因子受體2基因位于染色體17q12區(qū)域。它編碼屬于EGF/ERBB生長(zhǎng)因子受體家族的跨膜糖蛋白。HER2/neu蛋白已被證明在乳腺癌和胃癌的輔助治療的有效靶點(diǎn)過(guò)表達(dá)。雖然已經(jīng)有多項(xiàng)關(guān)于大腸癌的Her2/neu蛋白表達(dá)的免疫組化染色相關(guān)研究。這些研究結(jié)果有明顯不一致性,Her2/neu蛋白表達(dá)率涵蓋了從0到84%,預(yù)后和Her2/neu蛋白過(guò)表達(dá)之間的關(guān)系也有不一致性。兔抗血清通常含有很高親合力的抗體,而且與鼠抗血清相比,兔抗血清可以識(shí)別更多種類的免疫表位,有可能發(fā)展出更多、更具有特異性的新型抗體。兔單克隆抗體能夠以識(shí)別許多在小鼠中不產(chǎn)生免疫的抗原。最近研制出的Her2兔單克隆抗體具有較高的親和力和特異性。Her-2蛋白由三部分構(gòu)成,包括細(xì)胞外的配體結(jié)合區(qū)、單鏈跨膜區(qū)以及細(xì)胞內(nèi)的蛋白酪氨酸激酶區(qū)。Her2的兔單克隆抗體4B5是針對(duì)Her-2蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域,另一種Her2的兔單克隆抗體SP3則是針對(duì)其細(xì)胞內(nèi)的蛋白酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。本研究的目的是利用這兩種兔單克隆抗體對(duì)Her2蛋白在大腸癌中的表達(dá)進(jìn)行初步評(píng)估,并探討Her2蛋白過(guò)度表達(dá)及其基因擴(kuò)增與臨床病理意義之間的關(guān)系。2.材料和方法2.1組織樣本收集溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院的外科病理數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的106例大腸癌患者標(biāo)本,時(shí)間段為2003年到2007年間�！�106例患者均行結(jié)腸切除術(shù)后進(jìn)行臨床資料的收集,包括性別、年齡、腫瘤分期、分級(jí)、有無(wú)復(fù)發(fā)、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和隨訪。患者術(shù)前均未接受放療或化療,病理分級(jí)是按照世界衛(wèi)生組織(2010年)的標(biāo)準(zhǔn)定義,病理TNM分期是根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟(2002年)的TNM分期第六版的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)估。死于其他原因而非大腸癌的患者均被排除在研究之外。所有手術(shù)標(biāo)本手術(shù)切除組織后固定在10%中性福爾馬林緩沖中。過(guò)夜固定后,將組織樣本進(jìn)行處理。2.2組織微陣列組織芯片由福爾馬林固定和石蠟包埋塊的標(biāo)本構(gòu)建而成。每一例標(biāo)本選一張組織切片,隨機(jī)標(biāo)記三個(gè)有代表性的癌癥病灶和一個(gè)正常黏膜位置。將標(biāo)記好的點(diǎn)與組織蠟塊相對(duì)應(yīng),每例取4個(gè)標(biāo)記好的核心組織嵌入到打好孔的蠟塊的組織芯片陣列中。然后將組織芯片蠟塊切片用于免疫染色。2.3免疫組織化學(xué)(IHC)HER2/neu基因的兔單克隆抗體SP3檢測(cè)根據(jù)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。將4μm厚的切片(10mmol/L的檸檬酸鹽緩沖液,pH6.0)置于高壓鍋進(jìn)行加熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)后脫蠟,并用二甲苯和乙醇水化。用3%的過(guò)氧化氫10分鐘對(duì)內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性進(jìn)行阻斷。Ⅰ抗體(稀釋為1：100)室溫下孵育40分鐘后,用EnVision Plus系統(tǒng)(DAKO)在室溫下孵育30分鐘進(jìn)行檢測(cè)。用3,3-二氨基聯(lián)苯胺色原體檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物。用蘇木素進(jìn)行襯染。HER2/neu蛋白的另一種兔單克隆抗體4B5于37℃溫度下,染色缸內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)化流程16分鐘進(jìn)行抗原修復(fù)。預(yù)稀釋到終濃度為6微克／毫升的特異性抗體。按說(shuō)明進(jìn)行操作。2.4熒光原位雜交(FISH)按試劑盒程序說(shuō)明進(jìn)行FISH法檢測(cè)。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō),4mm切片進(jìn)行脫蠟,然后用二甲苯和乙醇水化,并在80℃加熱預(yù)處理10分鐘。0.2%胃蛋白酶/0.01當(dāng)量鹽酸37℃處理30分鐘,將載玻片于75℃孵育在ThermoBrite雜交液5分鐘,之后于37℃孵育18小時(shí)。雜交后,載玻片2x SSC/0.3 NP-40在72℃進(jìn)行2分鐘漂洗,最后用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)進(jìn)行復(fù)染。2.5評(píng)價(jià)IHC和FISH染色結(jié)果2.5.1免疫組化染色法的評(píng)價(jià)：對(duì)細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)的免疫染色進(jìn)行評(píng)分。細(xì)胞膜染色評(píng)分為0到3級(jí)：0,無(wú)反應(yīng)或FISH分析顯示在CRC中擴(kuò)增的HER-2的同質(zhì)的(a)和異質(zhì)性(b)(紅色信號(hào)簇),綠色信號(hào)代表第17號(hào)染色體的著絲粒,占到總細(xì)胞數(shù)的不足10%：1+,10%的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞膜微弱／輕微可察覺(jué)的染色或在細(xì)胞膜中有部分染色；2+,10%的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)弱至中度程度完整/基底外側(cè)細(xì)胞膜染色；3+,10%的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)高強(qiáng)度完整/基底外側(cè)細(xì)胞膜染色。細(xì)胞質(zhì)的評(píng)分進(jìn)行分級(jí)為陰性,弱(評(píng)分為1),強(qiáng)(評(píng)分為2)。2.5.2 FISH法的染色評(píng)價(jià)：根據(jù)ASCO/CAP指南進(jìn)行評(píng)分。FISH結(jié)果報(bào)告以HER2/neu的平均計(jì)數(shù)除以平均17號(hào)CEP(染色體計(jì)數(shù)探針)計(jì)數(shù)。在20個(gè)非重疊的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行計(jì)數(shù),包括每個(gè)核內(nèi)HER2信號(hào)的平均數(shù)量和每個(gè)核CEP17染色體探針的平均數(shù)目。HER2/CEP17比率超過(guò)2.2被作為擴(kuò)增,如HER2/CEP17比率小于1.8被認(rèn)為沒(méi)有擴(kuò)增。如果該比例在模棱兩可的范圍(1.8-2.2),則另外計(jì)數(shù)20個(gè)細(xì)胞。2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用Pearsonχ2法統(tǒng)計(jì)HER-2蛋白的高低與臨床病理參數(shù)和5年癌癥相關(guān)生存率的相關(guān)性。患者隨訪中位數(shù)為48.5個(gè)月(范圍在10到81個(gè)月)。用Kaplan-Meier方法獲得生存曲線。統(tǒng)計(jì)結(jié)果以P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。3.研究結(jié)果3.1兔單克隆抗體SP3和4B5免疫組化結(jié)果：在4B5抗體陽(yáng)性表達(dá)的病例中,89%(16/18)顯示細(xì)胞漿染色與膜細(xì)胞染色共存,所有的細(xì)胞免疫反應(yīng)呈現(xiàn)弱陽(yáng)性。7例SP3陽(yáng)性表達(dá)病例中,有2例呈強(qiáng)染色。在本實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中有3例印戒細(xì)胞癌和4例粘液腺癌,在這些樣本的細(xì)胞膜或細(xì)胞漿上并未檢測(cè)到4B5和SP3的過(guò)度表達(dá)。有三例周圍正常腺體4B5檢測(cè)呈細(xì)胞膜弱染色(1+)。3.2 FISH法檢測(cè)結(jié)果：全部TMA切片進(jìn)行FISH法檢測(cè),并對(duì)所有Her2蛋白2+和3+染色切片進(jìn)行分析。在全部3例Her2蛋白3+的切片中也表現(xiàn)出Her2基因擴(kuò)增。對(duì)于評(píng)分2+,僅1例4B5免疫反應(yīng)顯示擴(kuò)增。2例細(xì)胞漿強(qiáng)染色并未出現(xiàn)FISH擴(kuò)增。Her2蛋白在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿的過(guò)度表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小、TNM分期之間并沒(méi)有相關(guān)性(P 0.05)。Her2蛋白(4B5染色)過(guò)度表達(dá)與整體存活率之間沒(méi)有相關(guān)性(p=0.33)。4.結(jié)論Her2兔單克隆抗體4B5在檢測(cè)大腸癌Her2/neu的表達(dá)中比SP3更為敏感。Nunes等人比較了在乳腺癌中Her2的單克隆抗體SP3、2個(gè)兔多克隆抗體(HercepTest,a0485),3個(gè)小鼠單克隆抗體(ncl-cb11, cm-cb11和4D5)的過(guò)表達(dá),發(fā)現(xiàn)SP3比其他抗體而言表達(dá)更敏感,但特異性略差。我們的研究表明,隨著敏感性的增高和染色強(qiáng)度增加,在檢測(cè)HER2/neu過(guò)表達(dá)中,4b5可以用來(lái)減少假陰性。目前并無(wú)證據(jù)支持HER2/neu的過(guò)表達(dá)與腫瘤分級(jí)、PT, PN或生存率相關(guān)。一些研究表明細(xì)胞質(zhì)Her2/neu染色與生存率有相關(guān)性,但在本研究中研究者并未觀察到此現(xiàn)象。雖然用抗Her2/neu方法進(jìn)行結(jié)直腸癌的治療研究很少,基于其在胃癌治療中的成功先例,我們也觀察到有少數(shù)大腸癌患者(本實(shí)驗(yàn)中占2.8%)對(duì)于抗HER2/neu治療有著良好療效。盡管Her2基因擴(kuò)增和蛋白過(guò)表達(dá)只發(fā)生在約3%的結(jié)直腸癌患者中,但這少量的患者仍有可能成為HER2靶向治療的受益者。
【關(guān)鍵詞】：單克隆抗體SP3 單克隆抗體4B5 Her2蛋白 大腸癌 Her2 結(jié)直腸癌細(xì)胞 蛋白過(guò)表達(dá) 擴(kuò)增
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.34
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-21
• 前言21-25
• 第一部分 Her2在結(jié)直腸癌細(xì)胞株的胞膜及胞漿的表達(dá)并促進(jìn)癌細(xì)胞的增生25-60
• 引言25-27
• 材料與儀器27-31
• 實(shí)驗(yàn)方法與步驟31-46
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果46-54
• 討論54-59
• 第一部分 小結(jié)59-60
• 第二部分 兔單克隆抗體SP3和4B5對(duì)Her2蛋白在大腸癌表達(dá)的免疫組化結(jié)果評(píng)估60-81
• 引言60-61
• 材料與儀器61-64
• 實(shí)驗(yàn)方法與步驟64-69
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果69-74
• 討論74-80
• 第二部分 小結(jié)80-81
• 全文總結(jié)81-83
• 參考文獻(xiàn)83-97
• 綜述97-112
• 參考文獻(xiàn)104-112
• 致謝112-113
• 攻讀期間成果113-115
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)審稿證明115

  本文關(guān)鍵詞：人類表皮生長(zhǎng)因子受體2參與結(jié)直腸腺癌增生的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：440552