發(fā)布時間：2017-06-11 02:11

  本文關(guān)鍵詞：人類表皮生長因子受體2參與結(jié)直腸腺癌增生的機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分Her2在結(jié)直腸癌細胞株的胞膜及胞漿表達并可促進癌細胞的增生1.研究背景和目的在世界范圍內(nèi),結(jié)直腸癌在女性癌癥患者中的發(fā)病率占第二位,在男性癌癥患者中的發(fā)病率占第三位。對結(jié)直腸癌的發(fā)生和進展與信號通路及其具體機制的研究一直是醫(yī)學(xué)界的熱點,探討和發(fā)現(xiàn)新的治療靶點和治療方法對改善結(jié)直腸癌患者的生活質(zhì)量,提高患者的生存時間都有著重要的價值和意義。人類表皮生長因子受體2(Her2)是重要的乳腺癌預(yù)后判斷因子,Her2陽性(擴增或過表達)與乳腺癌的預(yù)后顯著相關(guān)。有關(guān)Her2與大腸癌的關(guān)系的研究做了很多,但目前仍尚未達成一致的結(jié)論,臨床方面也缺乏明確的針對Her2基因在結(jié)直腸癌治療和預(yù)后判斷方面的明確的指南。進一步的深入研究Her2基因在結(jié)直腸癌的表達,并了解其對結(jié)直腸癌治療的潛在應(yīng)用價值有著重要的臨床意義。本研究通過檢測5種人結(jié)直腸癌細胞株中Her2 mRNA的表達,建立穩(wěn)定表達Her2基因的人結(jié)直腸癌細胞株,siRNA敲減Her2基因表達的人結(jié)直腸癌細胞株,通過CCK8檢測法、細胞劃痕實驗和Transwell侵襲實驗等研究方法,觀察Her2對結(jié)直腸癌細胞的體外增殖、遷移和侵襲能力的影響。2.材料和方法2.1細胞人結(jié)直腸癌細胞株DLD-1、HCT8、HT29、HCT116、SW480購自中國科學(xué)院上海細胞庫,人乳腺癌細胞株SK-BR-3購自ACTT細胞庫。2.2 Real-time RT-PCR檢測采用SYBR(?)Premix Ex Taq real time PCR Kit(TAKARA)檢測五種人結(jié)直腸癌細胞株DLD-1、HCT8、HT29、HCT116、SW480及一種人乳腺癌細胞株SK-BR-3中的Her2表達。2.3建立穩(wěn)定的過表達Her2基因的人結(jié)直腸癌細胞株(SW480)以及siRNA沉默Her2表達的結(jié)直腸癌細胞株(HT-29)通過將Her2基因的胞外區(qū)的近膜部分序列插入真核表達載體PIRES2-EGFP中,構(gòu)建質(zhì)粒PIRES2-EGFP-HER2,從而建立穩(wěn)定表達Her2基因的人結(jié)直腸癌細胞株(SW480)。用重組慢病毒Her2-RNAi-LV轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌細胞株HT-29,建立siRNA沉默Her2基因表達的細胞株。2.4免疫組化法檢測Her2蛋白的表達部位分別用兩種不同的Her2單克隆抗體,采用免疫組化方式檢測膜內(nèi)部分的Her2表達(Ab-3)及膜外部分的Her2表達(CB11)。細胞免疫組化胞膜染色的結(jié)果判讀使用胃癌Her2的染色判讀和評分標準,即1+結(jié)果是指10%腫瘤細胞微弱或隱約可見細胞膜染色。2+結(jié)果是指10%腫瘤細胞有弱至中度的基底側(cè)膜、側(cè)膜或完全性胞膜染色。3+結(jié)果是指10%腫瘤細胞基底側(cè)膜、側(cè)膜或完全性胞膜強染色。2.5 CCK8法、細胞劃痕實驗和Transwell侵襲實驗通過上述方法研究Her2對人結(jié)直腸癌細胞株體外增殖、遷移和侵襲能力的影響。2.6統(tǒng)計學(xué)處理利用統(tǒng)計軟件IBM SPSS19.0對相關(guān)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。兩組間差異分析采用Student's t檢驗,多組間差異分析采用Oneway ANOVA檢驗,率的組間比較采用卡方檢驗。P0.05為有顯著差異。3.研究結(jié)果3.1結(jié)直腸癌細胞株中Her2的表達5種人結(jié)直腸癌細胞株中,HT29細胞株存在Her2基因mRNA水平高表達。其它細胞株少量表達或不表達Her2基因。免疫組化結(jié)果顯示,Her2單克隆抗體Ab-3表達于SK-BR-3的胞漿及HT29的胞漿,判讀結(jié)果結(jié)果均顯示為弱陽性至強陽性不等。DLD-1、HCT8、HCT116、SW480的Ab-3染色均為陰性。Her2單克隆抗體CB11表達于SK-BR-3的胞漿及HT29的胞膜,判讀后的結(jié)果均顯示為2+至3+不等。DLD-1、HCT8、HCT116、SW480的CB11染色均為陰性。3.2 Her2基因過表達增強結(jié)直腸癌細胞增殖能力培養(yǎng)高表達Her2的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SW480細胞株,用CCK-8法連續(xù)檢測5天的吸光度值,同樣的樣本做3個重復(fù),檢測轉(zhuǎn)染后SW480細胞增殖能力的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn),SW480 PIRES2-EGFP-Her2細胞的增殖能力較對照組增強,兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。3.3 Her2基因過表達促進結(jié)直腸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移用Transwell小室檢測Her2的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染大腸癌細胞株SW480的侵襲能力的改變。將細胞種在8.0um孔徑的上室內(nèi),36小時后,觀察室細胞穿過聚碳酸酯膜進入下室的多少,了解腫瘤細胞的遷移能力。結(jié)晶紫染色后,倒置顯微鏡下取5個200倍視野計數(shù),然后取平均數(shù),SW480 PIRES2-EGFP-Her2與SW480PIRES2-EGFP空載體相比穿過基底膜的細胞數(shù)明顯增加,統(tǒng)計學(xué)兩組差異具有顯著意義。3.4 RNAi沉默HERG2抑制HT29腫瘤細胞體外的侵襲能力經(jīng)siRNA沉默Her2的大腸癌細胞株HT29侵入下層的細胞數(shù)較空白對照組及陰性對照組明顯減少,侵襲能力明顯降低。(三次獨立試驗,t檢驗,p=0.003),差異有統(tǒng)計學(xué)意義,而空白對照組與陰性對照組侵入下層的細胞數(shù)差異并無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。4.結(jié)論Her2基因在結(jié)直腸癌細胞株HT-29中存在高表達,而DLD-1、HCT8、 HCT116、SW480中沒有Her2基因的表達或僅有低表達。這一現(xiàn)象說明Her2基因在某些人類結(jié)直腸癌中可存在Her2基因擴增和過表達,進一步的結(jié)果表明,Her2基因在人類結(jié)直腸癌細胞過表達增強結(jié)直腸癌細胞增殖能力,增強結(jié)直腸癌細胞增殖能力。RNAi沉默HER2抑制HT29腫瘤細胞體外的侵襲能力。本部分的結(jié)果顯示,Her2在人類結(jié)直腸癌有重要作用,Her2基因擴增和過表達會影響結(jié)直腸癌細胞株的增殖和侵襲能力。第二部分 兔單克隆抗體SP3和4B5對Her2蛋白在大腸癌表達的免疫組化結(jié)果評估1.研究背景和目的結(jié)直腸癌占全球每年新發(fā)癌癥的8.5%。在美國結(jié)直腸癌是排名第二的與癌癥的死亡率相關(guān)的疾病。人表皮生長因子受體2基因位于染色體17q12區(qū)域。它編碼屬于EGF/ERBB生長因子受體家族的跨膜糖蛋白。HER2/neu蛋白已被證明在乳腺癌和胃癌的輔助治療的有效靶點過表達。雖然已經(jīng)有多項關(guān)于大腸癌的Her2/neu蛋白表達的免疫組化染色相關(guān)研究。這些研究結(jié)果有明顯不一致性,Her2/neu蛋白表達率涵蓋了從0到84%,預(yù)后和Her2/neu蛋白過表達之間的關(guān)系也有不一致性。兔抗血清通常含有很高親合力的抗體,而且與鼠抗血清相比,兔抗血清可以識別更多種類的免疫表位,有可能發(fā)展出更多、更具有特異性的新型抗體。兔單克隆抗體能夠以識別許多在小鼠中不產(chǎn)生免疫的抗原。最近研制出的Her2兔單克隆抗體具有較高的親和力和特異性。Her-2蛋白由三部分構(gòu)成,包括細胞外的配體結(jié)合區(qū)、單鏈跨膜區(qū)以及細胞內(nèi)的蛋白酪氨酸激酶區(qū)。Her2的兔單克隆抗體4B5是針對Her-2蛋白的細胞外結(jié)構(gòu)域,另一種Her2的兔單克隆抗體SP3則是針對其細胞內(nèi)的蛋白酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。本研究的目的是利用這兩種兔單克隆抗體對Her2蛋白在大腸癌中的表達進行初步評估,并探討Her2蛋白過度表達及其基因擴增與臨床病理意義之間的關(guān)系。2.材料和方法2.1組織樣本收集溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院的外科病理數(shù)據(jù)庫中獲得的106例大腸癌患者標本,時間段為2003年到2007年間�！�106例患者均行結(jié)腸切除術(shù)后進行臨床資料的收集,包括性別、年齡、腫瘤分期、分級、有無復(fù)發(fā)、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和隨訪。患者術(shù)前均未接受放療或化療,病理分級是按照世界衛(wèi)生組織(2010年)的標準定義,病理TNM分期是根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(2002年)的TNM分期第六版的標準進行評估。死于其他原因而非大腸癌的患者均被排除在研究之外。所有手術(shù)標本手術(shù)切除組織后固定在10%中性福爾馬林緩沖中。過夜固定后,將組織樣本進行處理。2.2組織微陣列組織芯片由福爾馬林固定和石蠟包埋塊的標本構(gòu)建而成。每一例標本選一張組織切片,隨機標記三個有代表性的癌癥病灶和一個正常黏膜位置。將標記好的點與組織蠟塊相對應(yīng),每例取4個標記好的核心組織嵌入到打好孔的蠟塊的組織芯片陣列中。然后將組織芯片蠟塊切片用于免疫染色。2.3免疫組織化學(xué)(IHC)HER2/neu基因的兔單克隆抗體SP3檢測根據(jù)試劑盒說明進行操作。將4μm厚的切片(10mmol/L的檸檬酸鹽緩沖液,pH6.0)置于高壓鍋進行加熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)后脫蠟,并用二甲苯和乙醇水化。用3%的過氧化氫10分鐘對內(nèi)源性過氧化物酶的活性進行阻斷。Ⅰ抗體(稀釋為1：100)室溫下孵育40分鐘后,用EnVision Plus系統(tǒng)(DAKO)在室溫下孵育30分鐘進行檢測。用3,3-二氨基聯(lián)苯胺色原體檢測反應(yīng)產(chǎn)物。用蘇木素進行襯染。HER2/neu蛋白的另一種兔單克隆抗體4B5于37℃溫度下,染色缸內(nèi)標準自動化流程16分鐘進行抗原修復(fù)。預(yù)稀釋到終濃度為6微克／毫升的特異性抗體。按說明進行操作。2.4熒光原位雜交(FISH)按試劑盒程序說明進行FISH法檢測。簡單來說,4mm切片進行脫蠟,然后用二甲苯和乙醇水化,并在80℃加熱預(yù)處理10分鐘。0.2%胃蛋白酶/0.01當(dāng)量鹽酸37℃處理30分鐘,將載玻片于75℃孵育在ThermoBrite雜交液5分鐘,之后于37℃孵育18小時。雜交后,載玻片2x SSC/0.3 NP-40在72℃進行2分鐘漂洗,最后用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)進行復(fù)染。2.5評價IHC和FISH染色結(jié)果2.5.1免疫組化染色法的評價：對細胞膜和細胞質(zhì)的免疫染色進行評分。細胞膜染色評分為0到3級：0,無反應(yīng)或FISH分析顯示在CRC中擴增的HER-2的同質(zhì)的(a)和異質(zhì)性(b)(紅色信號簇),綠色信號代表第17號染色體的著絲粒,占到總細胞數(shù)的不足10%：1+,10%的腫瘤細胞出現(xiàn)細胞膜微弱／輕微可察覺的染色或在細胞膜中有部分染色；2+,10%的腫瘤細胞出現(xiàn)弱至中度程度完整/基底外側(cè)細胞膜染色；3+,10%的腫瘤細胞出現(xiàn)高強度完整/基底外側(cè)細胞膜染色。細胞質(zhì)的評分進行分級為陰性,弱(評分為1),強(評分為2)。2.5.2 FISH法的染色評價：根據(jù)ASCO/CAP指南進行評分。FISH結(jié)果報告以HER2/neu的平均計數(shù)除以平均17號CEP(染色體計數(shù)探針)計數(shù)。在20個非重疊的細胞內(nèi)進行計數(shù),包括每個核內(nèi)HER2信號的平均數(shù)量和每個核CEP17染色體探針的平均數(shù)目。HER2/CEP17比率超過2.2被作為擴增,如HER2/CEP17比率小于1.8被認為沒有擴增。如果該比例在模棱兩可的范圍(1.8-2.2),則另外計數(shù)20個細胞。2.6統(tǒng)計學(xué)處理使用Pearsonχ2法統(tǒng)計HER-2蛋白的高低與臨床病理參數(shù)和5年癌癥相關(guān)生存率的相關(guān)性。患者隨訪中位數(shù)為48.5個月(范圍在10到81個月)。用Kaplan-Meier方法獲得生存曲線。統(tǒng)計結(jié)果以P0.05為有統(tǒng)計學(xué)顯著差異。3.研究結(jié)果3.1兔單克隆抗體SP3和4B5免疫組化結(jié)果：在4B5抗體陽性表達的病例中,89%(16/18)顯示細胞漿染色與膜細胞染色共存,所有的細胞免疫反應(yīng)呈現(xiàn)弱陽性。7例SP3陽性表達病例中,有2例呈強染色。在本實驗標本中有3例印戒細胞癌和4例粘液腺癌,在這些樣本的細胞膜或細胞漿上并未檢測到4B5和SP3的過度表達。有三例周圍正常腺體4B5檢測呈細胞膜弱染色(1+)。3.2 FISH法檢測結(jié)果：全部TMA切片進行FISH法檢測,并對所有Her2蛋白2+和3+染色切片進行分析。在全部3例Her2蛋白3+的切片中也表現(xiàn)出Her2基因擴增。對于評分2+,僅1例4B5免疫反應(yīng)顯示擴增。2例細胞漿強染色并未出現(xiàn)FISH擴增。Her2蛋白在細胞膜和細胞漿的過度表達與性別、年齡、腫瘤大小、TNM分期之間并沒有相關(guān)性(P 0.05)。Her2蛋白(4B5染色)過度表達與整體存活率之間沒有相關(guān)性(p=0.33)。4.結(jié)論Her2兔單克隆抗體4B5在檢測大腸癌Her2/neu的表達中比SP3更為敏感。Nunes等人比較了在乳腺癌中Her2的單克隆抗體SP3、2個兔多克隆抗體(HercepTest,a0485),3個小鼠單克隆抗體(ncl-cb11, cm-cb11和4D5)的過表達,發(fā)現(xiàn)SP3比其他抗體而言表達更敏感,但特異性略差。我們的研究表明,隨著敏感性的增高和染色強度增加,在檢測HER2/neu過表達中,4b5可以用來減少假陰性。目前并無證據(jù)支持HER2/neu的過表達與腫瘤分級、PT, PN或生存率相關(guān)。一些研究表明細胞質(zhì)Her2/neu染色與生存率有相關(guān)性,但在本研究中研究者并未觀察到此現(xiàn)象。雖然用抗Her2/neu方法進行結(jié)直腸癌的治療研究很少,基于其在胃癌治療中的成功先例,我們也觀察到有少數(shù)大腸癌患者(本實驗中占2.8%)對于抗HER2/neu治療有著良好療效。盡管Her2基因擴增和蛋白過表達只發(fā)生在約3%的結(jié)直腸癌患者中,但這少量的患者仍有可能成為HER2靶向治療的受益者。
【關(guān)鍵詞】：單克隆抗體SP3 單克隆抗體4B5 Her2蛋白 大腸癌 Her2 結(jié)直腸癌細胞 蛋白過表達 擴增
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.34
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-21
• 前言21-25
• 第一部分 Her2在結(jié)直腸癌細胞株的胞膜及胞漿的表達并促進癌細胞的增生25-60
• 引言25-27
• 材料與儀器27-31
• 實驗方法與步驟31-46
• 實驗結(jié)果46-54
• 討論54-59
• 第一部分 小結(jié)59-60
• 第二部分 兔單克隆抗體SP3和4B5對Her2蛋白在大腸癌表達的免疫組化結(jié)果評估60-81
• 引言60-61
• 材料與儀器61-64
• 實驗方法與步驟64-69
• 實驗結(jié)果69-74
• 討論74-80
• 第二部分 小結(jié)80-81
• 全文總結(jié)81-83
• 參考文獻83-97
• 綜述97-112
• 參考文獻104-112
• 致謝112-113
• 攻讀期間成果113-115
• 統(tǒng)計學(xué)審稿證明115

  本文關(guān)鍵詞：人類表皮生長因子受體2參與結(jié)直腸腺癌增生的機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：440552