本文關(guān)鍵詞：下調(diào)TLR4預(yù)防再狹窄的作用及其與吡格列酮抑制效應(yīng)的比較，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:近些年來,經(jīng)皮穿刺腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)(percutaneous transluminal coronary angioplasty,PTCA)和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(percutaneous coronary intervention,PCI)已逐漸成為冠心病及急性冠脈綜合征血運(yùn)重建的重要治療手段。然而,術(shù)后再狹窄(restenosis,RS)卻制約著這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展。盡管藥物洗脫支架的問世在一定程度上降低了再狹窄的發(fā)生率,但是越來越多的研究發(fā)現(xiàn)藥物洗脫支架也并非十全十美,仍面臨如遠(yuǎn)期炎癥狀態(tài)、支架內(nèi)血栓形成以及RS等等問題。基于此,我們擬探究是否存在更好的再狹窄預(yù)防手段,以期與現(xiàn)有的保護(hù)措施結(jié)合起來,進(jìn)一步降低這種并發(fā)癥的發(fā)生率。Toll樣受體4(toll like receptor 4,TLR4)是哺乳動(dòng)物TLR家族里第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的膜受體,其活化后可以激活核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB),繼而誘發(fā)一系列的局部炎癥反應(yīng),最終表現(xiàn)為損傷部位內(nèi)膜增生,因此推測其在血管損傷后再狹窄過程中可能發(fā)揮重要作用。但是抑制TLR4表達(dá)后是否會(huì)減少再狹窄的發(fā)生尚不明確。本研究通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)TLR4基因,以病毒顆粒包裝將質(zhì)粒載入動(dòng)物RS模型以及被脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激增殖下的人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(Human aortic vascular smooth muscle cells,Ha VSMC)中,測定TLR4相關(guān)的炎癥、增殖分子,觀察下調(diào)TLR4對(duì)內(nèi)膜新生的抑制程度,以及離體水平細(xì)胞增殖、遷移能力產(chǎn)生的影響,探討抑制TLR4基因表達(dá)在預(yù)防RS中的作用機(jī)制。此外,我們比較了RNA干擾與不同濃度吡格列酮對(duì)細(xì)胞增殖遷移能力的抑制效力。方法:1.在體實(shí)驗(yàn):根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期工作基礎(chǔ),建立兔頸總動(dòng)脈球囊損傷后再狹窄模型:選取健康新西蘭大白兔50只,隨機(jī)分成五組,即正常組(normal control,NC),假手術(shù)組(shame,S),模型組(model,M),陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(negative,N),以及陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(positive,P),每組10只。NC組不予任何干預(yù);S組行頸總動(dòng)脈分離后動(dòng)脈夾夾閉右側(cè)頸總動(dòng)脈30分鐘;M組行右頸總動(dòng)脈球囊拉傷術(shù);N組在進(jìn)行右側(cè)頸動(dòng)脈球囊拉傷后隨即封閉拉傷段血管,排空積血,管腔內(nèi)注射空載的腺病毒顆粒(滴度1*109 plaque forming unit,pfu)30ul,溫暖潮濕環(huán)境孵育30min;P組在進(jìn)行右側(cè)頸動(dòng)脈球囊拉傷后管腔內(nèi)注射載有sh RNA-TLR4質(zhì)粒的腺病毒顆粒(滴度1*109 pfu)30ul,余操作同N組。術(shù)后正常兔料喂養(yǎng)14天后處死,進(jìn)行以下步驟:(1)處死前取血,用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測血漿中TNF-α、IL-6水平;(2)留取右頸動(dòng)脈標(biāo)本,進(jìn)行HE染色,測量內(nèi)膜和中膜厚度并計(jì)算內(nèi)膜和中膜面積;應(yīng)用免疫組化法觀察組織TLR4表達(dá)。(3)留取右頸動(dòng)脈標(biāo)本,采用Real-Time PCR測定TLR4、TNF-α、IL-6和VCAM-1m RNA表達(dá);(4)Western blotting檢測TLR4,炎癥因子NF-κB、VCAM-1、MCP-1以及增殖因子t-AKT、p-AKT、t-m TOR、p-m TOR蛋白的表達(dá)。2.離體實(shí)驗(yàn):選取Ha VSMC細(xì)胞系,分別予1μg/ml LPS刺激0h、6h、12h、24h以及48h,確定TLR4表達(dá)的峰值時(shí)間點(diǎn)。設(shè)計(jì)、構(gòu)建2對(duì)針對(duì)TLR4特異性的sh RNA表達(dá)質(zhì)粒,進(jìn)行慢病毒包裝,使用帶有綠色熒光蛋白的慢病毒載體介導(dǎo)的sh RNA-TLR4-1,sh RNA-TLR4-2和陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人血管平滑肌細(xì)胞系,在熒光倒置顯微鏡下檢測以確認(rèn)轉(zhuǎn)染效果,并選擇TLR4抑制效率更高的一組作為sh RNA陽性轉(zhuǎn)染組(positive,P),另外保留陰性轉(zhuǎn)染組(negtive,N),不加LPS刺激組(NL)以及單加LPS刺激組(L),再設(shè)三組分別給予10μmol/L(Pio10),50μmol/L(Pio50),以及100μmol/L(Pio100)吡格列酮進(jìn)行預(yù)處理,除NL外各組分別予1μg/ml LPS刺激使TLR4表達(dá)達(dá)到峰值,收細(xì)胞,RT-PCR測定TLR4 m RNA表達(dá);Western blotting檢測TLR4、NF-κB、VCAM-1、MCP-1,再測接受LPS刺激1h后上述各組t-AKT、p-AKT的蛋白表達(dá);MTT比色法分別測定細(xì)胞增殖生長狀況;劃痕實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞24h及48h劃痕修復(fù)率;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布情況。結(jié)果:1.在體部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)有創(chuàng)操作成功且存活占83.3%(40/48);(2)ELISA結(jié)果顯示:與NC組相比,S、M、N和P組血漿IL-6、TNF-α表達(dá)水平顯著升高(p0.05);與M及N組比較,P組血漿IL-6、TNF-α表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);(3)HE染色結(jié)果顯示,與NC組和S組相比,M、N和P組內(nèi)膜和中膜均增厚,內(nèi)中膜厚度比及內(nèi)中膜面積比均明顯增大(p0.05);與M和N組相比,P組內(nèi)中膜厚度、內(nèi)中膜厚度比及內(nèi)中膜面積比均明顯減少(p0.05)。免疫組化結(jié)果表明:NC組及S組血管三層結(jié)構(gòu)中均未見到TLR4陽性表達(dá)細(xì)胞;M、N及P組均有TLR4陽性表達(dá)細(xì)胞,主要分布在新生內(nèi)膜層;(4)q RT PCR結(jié)果顯示:與NC組和S組相比,M、N和P組TLR4、IL-6、TNF-α和VCAM-1 m RNA表達(dá)量升高(P0.05),與M組及N組相比,P組上述因子表達(dá)量降低(P0.05);(5)Western-blot結(jié)果顯示:與NC組和S組相比,M、N和P組TLR4、NF-κB、MCP-1、VCAM-1、p-AKT和p-m TOR蛋白表達(dá)量升高(P0.05);與M和N組相比,P組TLR4、NF-κB、MCP-1和VCAM-1蛋白表達(dá)量下降(P0.05),p-AKT和p-m TOR蛋白表達(dá)量無明顯變化(p0.05)。2.離體部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)1μg/m L LPS刺激Ha VSMC可激活TLR4,并呈現(xiàn)時(shí)間依賴性,24h達(dá)到其表達(dá)峰值;(2)兩條sh RNA-TLR4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞對(duì)TLR4抑制效率可達(dá)61%及55%;(3)q RT-PCR示P組及吡格列酮預(yù)處理各組均可下調(diào)TLR4 m RNA表達(dá)量;(4)WB示各組TLR4、NF-κB、MCP-1及VCAM-1表達(dá)及關(guān)系與q RT-PCR結(jié)果類似,LPS刺激后1h即可上調(diào)p-AKT表達(dá)量,而sh RNA-TLR4質(zhì)粒及吡格列酮均可明顯抑制其表達(dá);(5)LPS可以提高細(xì)胞增殖能力,sh RNA-TLR4質(zhì)粒及吡格列酮能夠抑制增殖;(6)流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn),LPS可以提高細(xì)胞在G2及S期的分布,sh RNA-TLR4質(zhì)粒及吡格列酮可減弱此效應(yīng);(7)LPS促進(jìn)細(xì)胞遷移,sh RNA-TLR4質(zhì)粒及吡格列酮可抑制遷移;(8)以上吡格列酮對(duì)于細(xì)胞增殖、遷移能力的抑制以及對(duì)細(xì)胞周期分布的影響呈濃度依賴性,對(duì)上述各炎癥因子表達(dá)的下調(diào)作用也存在濃度依賴性。(9)sh RNA-TLR4穩(wěn)轉(zhuǎn)Ha VSMC細(xì)胞系對(duì)細(xì)胞增殖及遷移能力的抑制程度介于50μM-100μM吡格列酮之間。結(jié)論:下調(diào)TLR4可以抑制家兔頸動(dòng)脈球囊損傷后再狹窄的發(fā)生,可能與其抑制局部組織TLR4及其介導(dǎo)的NF-κB、TNF-α、IL-6、MCP-1、VCAM-1等炎癥因子的表達(dá)有關(guān)。下調(diào)TLR4可以抑制由LPS激活的Ha VSMC增殖遷移,其作用類同于50μM-100μM吡格列酮所達(dá)到的效果,提示TLR4可以作為基因水平預(yù)防支架內(nèi)再狹窄的新靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：TLR4 再狹窄 RNA干擾 血管平滑肌細(xì)胞 炎癥 增殖 遷移
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R541.4
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 縮略語/符號(hào)說明13-15
• 前言15-17
• 研究現(xiàn)狀、成果15
• 研究目的，方法15-17
• 一、RNA干擾下調(diào)TLR4基因在預(yù)防頸動(dòng)脈球囊損傷所致血管狹窄中的作用17-53
• 1.1 對(duì)象和方法17-33
• 1.1.1 對(duì)象17-24
• 1.1.2 方法24-33
• 1.2 結(jié)果33-43
• 1.2.1 模型建立情況33-34
• 1.2.2 病理分析結(jié)果34-39
• 1.2.3 免疫組化情況39
• 1.2.4 提取RNA的定性及各目的基因mRNA的定量39-41
• 1.2.5 各目的基因蛋白表達(dá)的定量41-42
• 1.2.6 各組血清中IL-6 及TNF-α 的表達(dá)水平42-43
• 1.3 討論43-51
• 1.3.1 再狹窄概況及研究背景43-44
• 1.3.2 TLR4信號(hào)通路44-46
• 1.3.3 再狹窄動(dòng)物模型46-49
• 1.3.4 TLR4信號(hào)通路在再狹窄模型病理生理過程中的作用49-51
• 1.4 小結(jié)51-53
• 二、shRNA-TLR4質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞系對(duì)細(xì)胞增殖、遷移能力的抑制效應(yīng)及其與吡格列酮預(yù)處理的比較53-79
• 2.1 對(duì)象和方法53-60
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料53-54
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法54-60
• 2.2 結(jié)果60-69
• 2.2.1 正常培養(yǎng)的HaVSMC60
• 2.2.2 最佳刺激時(shí)間的確定60-61
• 2.2.3 質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞系的驗(yàn)證61
• 2.2.4 抑制效率的確定61-62
• 2.2.5 各組細(xì)胞中TLR4 mRNA表達(dá)量62
• 2.2.6 各組細(xì)胞中目的基因蛋白表達(dá)量62-63
• 2.2.7 各組細(xì)胞增殖能力63-65
• 2.2.8 各組細(xì)胞所處細(xì)胞周期分布65-66
• 2.2.9 各組細(xì)胞遷移能力66-69
• 2.3 討論69-78
• 2.3.1 血管平滑肌細(xì)胞炎癥增殖模型69
• 2.3.2 shRNA-TLR4對(duì)細(xì)胞增殖、遷移的影響69
• 2.3.3 噻唑二烷酮69-71
• 2.3.4 RNA干擾71-78
• 2.4 小結(jié)78-79
• 全文結(jié)論79-80
• 論文創(chuàng)新點(diǎn)80
• 局限性80-81
• 參考文獻(xiàn)81-90
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明90-91
• 綜述91-110
• 綜述一.TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路與介入治療后再狹窄的形成91-102
• 綜述一參考文獻(xiàn)98-102
• 綜述二.吡格列酮在心血管系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用及研究102-110
• 綜述二參考文獻(xiàn)106-110
• 致謝110

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 羅廷福;李家富;何濤;馮健;龔武田;;阿托伐他汀對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的人腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶-活性氧通路的影響[J];中國心血管雜志;2010年03期

  本文關(guān)鍵詞：下調(diào)TLR4預(yù)防再狹窄的作用及其與吡格列酮抑制效應(yīng)的比較，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：437660