本文關(guān)鍵詞：自噬和線粒體輔酶Q對膿毒癥大鼠心功能的影響及機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景和目的盡管抗生素治療和危重癥監(jiān)護技術(shù)提高,膿毒癥(sepsis)仍然是ICU患者的主要死亡原因。在發(fā)達國家膿毒癥死亡率仍高達40-60%。膿毒癥患者死亡的主要原因為多器官功能障礙(multiple organ dysfunction syndrome, MODS),心功能紊亂是膿毒癥MODS的重要組成部分,有心功能紊亂的膿毒癥患者比沒有心功能紊亂的患者死亡率高50%。膿毒癥之所以有如此高的死亡率,是因為膿毒癥的病理生理改變十分復雜,目前研究認為氧化應激、線粒體損傷、過多活性氧(Reactive oxygen species, ROS)產(chǎn)生是膿毒癥發(fā)病的中心環(huán)節(jié),而心臟線粒體占總重量的30%,心臟更易受ROS影響,因此認為線粒體受損、ROS產(chǎn)生過多等是膿毒癥心功能紊亂的主要原因,但確切發(fā)病機制目前尚不為人們所知。自噬的主要功能用于細胞內(nèi)大分子物質(zhì)的循環(huán)利用、損傷細胞器的清除、胞內(nèi)病原體的清除,從而維持細胞穩(wěn)態(tài),保證細胞能量供應,發(fā)揮細胞保護性作用,但過度自噬同樣可能引起自噬細胞的死亡。有研究報道在膿毒癥動物模型和臨床患者中觀察到心臟自噬的提高,但自噬在膿毒癥心功能紊亂中起保護作用或損害作用目前尚不明確。既然氧化應激、線粒體損傷、過多ROS產(chǎn)生是膿毒癥心功能紊亂的主要因素,因此理論上抗氧化劑被認為是最有希望改善膿毒癥心功能紊亂的治療措施,但抗氧化劑在臨床實驗和動物實驗中并未取得滿意效果,認為可能與這些抗氧化劑在體內(nèi)被代謝不能到達氧化應激發(fā)生的主要部位線粒體有關(guān)。線粒體輔酶Q (mitochondrial coenzyme Q, MitoQ)是主要針對線粒體的靶向抗氧化劑,可能對ROS所致的器官組織損傷更具有保護效率。本研究通過對脂多糖(lipopolysaccharide, LP S)誘導的膿毒癥大鼠體內(nèi)及體外急性分離心肌細胞的研究,旨在了解自噬在膿毒癥大鼠心功能障礙中的作用及功能變化；自噬是否通過緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激改善LPS所致心肌細胞收縮舒張功能障礙；MitoQ是否通過清除ROS影響自噬功能,進而對LPS所致心肌細胞收縮舒張功能障礙起保護作用。方法1.自噬和MitoQ對膿毒癥大鼠生存率的影響將SD雄性大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為5組：LPS組、LPS+渥曼青霉素(Wortmannin)組、LPS + MitoQ組、Wortmannin組、MitoQ組,每組10只。LPS組、LPS+ Wortmannin組、LPS+ MitoQ組每只大鼠給LPS (10 mg/kg)腹腔注射,Wortmannin組、MitoQ組給等量生理鹽水(NS)注射。腹腔注射后1h采用尾靜脈分別給Wortmannin (2 mg/kg)、MitoQ (6.5 μmol/kg)或等量NS注射。腹腔注射后12h每隔1h觀察動物生存情況。2.自噬和MitoQ對膿毒癥大鼠心功能的影響2.1實驗動物模型及分組將SD大鼠隨機分10組：對照4h、6h組,LPS 4 h、6 h、8 h、12 h組,LPS + Wortmannin 4 h組,Wortmannin 4 h組,LPS + MitoQ 6 h組,MitoQ 6 h組,每組10只大鼠。所有含LPS組均給LPS(10 mg/kg)腹腔注射,對照組、Wortmannin4h組、MitoQ 6 h組則給等容量NS腹腔注射。大鼠腹腔注射后1h采用尾靜脈注射分別給Wortmannin (2mg/kg)、MitoQ (6.5 μmol/kg)干預,其它各組則給等量NS相同處理。2.2大鼠頸總動脈插管及數(shù)據(jù)記錄各組大鼠在相應時間點前30分鐘給10%水合氯醛0.3 ml/kg腹腔注射麻醉,分離右側(cè)頸總動脈,插入PE50導管,BL-420E生物機能實驗儀記錄各組大鼠左室最大收縮壓(Left ventricular systolic pressure,LVSP)、左室舒張末壓(Left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)、左室壓力上升／下降最大速率(Maximalrate of the rise/drop of left ventricular pressure, ±dp/dt max)。2.3血漿樣本收集及心肌組織形態(tài)學檢查左心室壓力測定后,腹主動脈留取血標本,分離血漿置于-70℃冰箱中保存待檢。采血后迅速取出心臟用冷PBS液充分沖洗后,一部分心肌組織用于HE染色,另一部分心肌組織用于制備電鏡標本,剩余心肌組織液氮速凍,置于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.4血漿肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)含量檢測采用美國Beckman LX-20全自動生化分析儀檢測。2.5血漿及心肌組織中IL-1β、TNF-α、ROS含量檢測采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA),操作步驟按照試劑盒說明書進行。2.6心肌組織Ca2+-Mg2+-ATP酶活性檢測采用BCA法測蛋白濃度,吸光度法檢測Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。2.7心肌組織中LC3、GRP78蛋白的表達采用Western blot法測定。3.自噬通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激緩解LPS所致心肌細胞收縮舒張功能障礙3.1心室肌細胞的分離取健康雄性SD大鼠,腹腔注射肝素2500 U/kg,30 min后,腹腔注射10%水合氯醛0.4 ml/kg麻醉,將Langendorff灌流套管插入主動脈,酶解法分離心室肌細胞,分離的心肌細胞在8h之內(nèi)使用。根據(jù)實驗目的的不同,在測定心肌細胞收縮舒張功能、鈣瞬變、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性、細胞內(nèi)ROS含量、LC3、GRP78表達等指標前,心肌細胞分別與不同濃度LPS (100ng/ml、200 ng/ml、1 μ/ml、 4 μg/ml)、牛磺脫氧膽酸(TUDCA) (500 μM)、MitoQ(1 μmol/L)、Wortmannin(200nM)37℃共同孵育2 h。3.2大鼠心肌細胞收縮和舒張功能測定采用可視化動緣探測系統(tǒng)(IonOptix)測定各組心肌細胞最大收縮幅度(Peak shortening,PS)、最大收縮速率(+dL/dt)、最大舒張速率(-dL/dt)。3.3大鼠心肌細胞舒張期鈣濃度及鈣瞬變的同步檢測將心肌細胞負載鈣離子熒光探針Fluo-4/AM后采用IonOptix系統(tǒng)同步測定心肌細胞舒張期鈣及鈣瞬變的變化。3.4心肌細胞Ca2+-Mg2+-ATP酶活性檢測采用BCA法測蛋白濃度,吸光度法檢測Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。3.5心肌細胞上清CK-MB.LDH含量檢測取各組心肌細胞上清液,用化學比色法測得CK-MB.LDH含量。3.6心肌細胞內(nèi)ROS含量檢測利用熒光探針2',7'二氯氫化熒光素乙二脂(2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)進行活性氧檢測,用熒光酶標儀檢測熒光強度反映細胞內(nèi)活性氧的含量。3.7心肌細胞中LC3、GRP78蛋白的表達采用Western blot法。結(jié)果1.自噬和MitoQ對膿毒癥大鼠生存率的影響及一般表現(xiàn)大鼠腹腔注射LPS后約1h后,出現(xiàn)精神萎靡、腹瀉、豎毛、大小便失禁、活動減少、進食、飲水減少等典型內(nèi)毒素血癥臨床癥狀,LPS + MitoQ組上述癥狀無減輕,LPS + Wortmannin組癥狀更顯著,并出現(xiàn)血尿、血便癥狀。Wortmannin組、MitoQ組大鼠與正常大鼠一般表現(xiàn)無差別,無死亡。LPS注射后12h內(nèi)LPS組死亡2只,LPS + MitoQ組死亡4只,LPS + Wortmannin組均死亡.LPS + MitoQ組、LPS + Wortmannin組、LPS組大鼠生存率分別為60%、0、80%,5組間差異有統(tǒng)計學意義(X2=14.882,P=0.001),LPS + Wortmannin組生存率明顯低于LPS組,差異有統(tǒng)計學意義(X2=10.208,P=0.001).LPs + Wortmannin組大鼠12h平均生存時間明顯短于LPS組(h：7.5±0.64比11.9±0.13,,=19.847,P=0.001),LPS + MitoQ組大鼠12h平均生存時間與LPS組無差異(h：11.6±0.24比11.9±0.13,χ2=1.055,P=0.137)。2.自噬和MitoQ對膿毒癥大鼠心功能的影響2.1各組大鼠血漿CK-MB、LDH含量變化大鼠給LPS后6 h出現(xiàn)血漿CK-MB、LDH含量的明顯升高與同時間點對照組比較差異有顯著性(均P0.05)。給LPS后再給Wortmannin干預4 h即出現(xiàn)CK-MB、LDH含量的明顯升高,與LPS 4 h組比較差異有顯著性(均P0.05)；而給LPS后再給MitoQ干預CK-MB、LDH含量仍高于同時間點對照組(均P,0.05)。2.2各組大鼠心肌組織Ca2+-Mg2+-ATP酶活力的變化大鼠給LPS后6 h出現(xiàn)Ca2+-Mg2+-ATP活力明顯下降與同時間點對照組比較差異有顯著性(F=3.049,P=0.016)。給LPS后再給Wortmannin干預4 h即出現(xiàn)Ca2+-Mg2+-ATP酶活力明顯下降,與LPS 4 h組比較差異有顯著性(F=10.221,P=0.001)；而給LPS后再給MitoQ干預Ca2+-Mg2+-ATP酶活力仍低于同時間點對照組(F=4.438,P=0.009),且與同時間點LPS組比較無明顯差異(F=4.438,P=0.698)。2.3各組大鼠在體心功能變化LPS注射后6 h大鼠出現(xiàn)心功能異常,表現(xiàn)為LVEDP明顯升高,IVSP、±dp/dtmax明顯降低,與同時間點對照組比較均有差異(均P0.05)；給LPS后再給Wortmannin 4 h即出現(xiàn)差異(均P0.01),與LPS4h組比較也有差異(均P0.01); LPS + MitoQ 6 h組與對照組比較有差異(均P0.05),但與同時間點LPS組均無差異(均P0.05)。2.4各組大鼠心肌組織病理學改變光鏡下,LPS 6 h、8 h、12 h組、LPS + MitoQ 6 h組和LPS + Wortmannin 4 h組均出現(xiàn)明顯心肌病理改變。電鏡下,LPS 6 h后自噬體增多,MitoQ干預后與相應時間點LPS組無差異,而給予Wortmannin未見自噬體。2.5血漿及心肌組織中IL-1β、TNF-α、ROS含量變化大鼠給LPS后4h出現(xiàn)血漿、心肌組織TNF-α明顯升高與同時間點對照組比較差異均有顯著性(均P0.05)。給LPS后再給Wortmannin干預血漿、心肌組織TNF-α明顯升高,與LPS 4 h組比較差異有顯著性(均P0.05)；而給LPS后再給MitoQ干預血漿、心肌組織TNNF-α仍高于同時間點對照組(均P0.05),但與同時間點LPS組比較無明顯差異(均P0.05)。大鼠給LPS后6h出現(xiàn)血漿、心肌組織IL-1p明顯升高與同時間點對照組比較差異均有顯著性(均P0.05)。給LPS后再給Wortmannin干預血漿、心肌組織IL-1β明顯升高,與LPS 4 h組比較差異有顯著性(均P0.05)；而給LPS后再給MitoQ干預血漿、心肌組織IL-1p仍高于同時間點對照組(均P0.05),但與同時間點LPS組比較無明顯差異(均P0.05)。大鼠給LPS后6h出現(xiàn)血漿、心肌組織ROS明顯升高與同時間點對照組比較差異有顯著性(均P0.05)。給LPS后再給Wortmannin干預血漿、心肌組織ROS明顯升高,與LPS 4 h組比較差異有顯著性(均P0.05)；而給LPS后再給MitoQ干預血漿、心肌組織ROS仍高于同時間點對照組(均P0.05),但與同時間點LPS組比較無明顯差異(均P0.05)。2.6心肌組織中LC3、GRP78表達量的變化大鼠給LPS后6h出現(xiàn)LC3-II表達量的明顯增加,與對照組比較有差異(F=10.408,P=0.001),LPS 12 h表達的量有下降趨勢,但與LPS 8 h比較無差異(F=10.408,P=0.810).LPS + MitoQ 6 h組與LPS 6 h組比較有差異(F=10.787,P=0.002).GRP78表達的量給LPS后6h明顯增加,與對照組比較有有差異(F=7.214,P=0.002),LPS + Wortmannin 4 h組與LPS 4 h組比較有差異(F=10.289,P=0.001).3.自噬通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激緩解LPS所致心肌細胞收縮舒張功能障礙3.1不同濃度LPS對心肌細胞自噬功能影響隨著LPS濃度的增高,自噬標志物LC3-II蛋白表達逐步增加,但隨著LPS濃度的進一步增高,LC3-II蛋白表達有下降趨勢。3.2 Wortmannin對心肌細胞CK-MB.LDH.Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響LPS+Wortmannin組CK-MB、LDH活性顯著高于LPS組,而Ca2+-Mg2+-ATP酶活性顯著低于LPS組,差異均有顯著性(均P0.05)。給內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激特異性抑制劑TUDCA,CK-MB、LDH活性有下降,而Ca2+-Mg2+-ATP酶活性有升高,與LPS + Wortmannin組比較差異均有顯著性(均P0.05)。3.3 Wortmannin對心肌細胞內(nèi)ROS含量的影響LPS + Wortmannin組顯著高于LPS組,差異有顯著性(F=63.278,P=0.000),給內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激特異性抑制劑TUDCA,ROS含量有下降,與LPS + Wortmannin組比較差異有顯著性(F=63.278,P=0.000)。3.4 Wortmannin對心肌細胞收縮舒張功能的影響LPS + Wortmannin組PS、±dL/dt顯著低于對照組,差異均有顯著性(均P0.05),給內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激特異性抑制劑TUDCA,PS、±dL/dt有升高,與LPS+Wortmannin組比較差異均有顯著性(均P0.05)。3.5 Wortmannin對心肌細胞內(nèi)鈣濃度的影響LPS + Wortmannin組舒張期鈣顯著高于LPS組,差異有顯著性(F=22.869,P=0.000),而鈣瞬變顯著低于LPS組,差異有顯著性(F=92.834,P=0.000)。給內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激特異性抑制劑TUDCA,舒張期鈣有降低,鈣瞬變有升高,與LPS+ Wortmannin組比較差異均有顯著性(均P0.05)。3.6 Wortmannin對心肌細胞GRP78表達的影響LPS + Wortmannin組GRP78表達水平顯著高于LPS組,差異有顯著性(F=5.886,P=0.001)。給內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激特異性抑制劑TUDCA,GRP78表達水平顯著低于LPS + Wortmannin組,差異有顯著性(F=5.886,P=0.043)。3.7 MitoQ對心肌細胞CK-MB、LDH、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響LPS組CK-MB、LDH活性顯著高于對照組,而Ca2+-Mg2+-ATP酶活性顯著低于對照組,差異均有顯著性(均P0.05)。給MitoQ干預LPS + MitoQ組CK-MB、LDH活性無明顯下降,Ca2+-Mg2+-ATP酶活性無明顯升高,與LPS組比較差異均無顯著性(均P0.05),但與對照組比較均有差異(均P0.05)。3.8 MitoQ對心肌細胞內(nèi)ROS含量的影響LPS組顯著高于對照組,差異有顯著性(F=22.753,P=0.000),給MitoQ干預LPS + MitoQ組ROS含量明顯下降,與LPS組比較差異有顯著性(F=22.753,P=0.003),但仍高于對照組,差異有顯著性(F=22.753,P=0.003)。3.9 MitoQ對心肌細胞LC3表達的影響LPS組顯著高于對照組,差異有顯著性(F=15.019,P=0.000)。LPS + MitoQ組顯著低于LPS組,差異有顯著性(F=15.019,P=0.011),但仍高于對照組,差異有顯著性(F=15.019,P=0.011)。3.10 MitoQ對心肌細胞收縮舒張功能的影響LPS組PS、±dL/dt顯著低于對照組,差異均有顯著性(均P0.05),LPS+MitoQ組PS、±dL/dt有升高,但仍低于對照組,差異均有顯著性(均P0.05)3.11 MitoQ對心肌細胞內(nèi)鈣濃度的影響LPS組舒張期鈣濃度明顯增加,而鈣瞬變幅度明顯降低,與對照組比較差異均有顯著性(均P0.01)；與LPS組比較LPS + MitoQ組心肌細胞內(nèi)舒張期鈣濃度有降低,鈣瞬變幅度有增加,但差異均無顯著性(均P0.05),與對照組比較差異均有顯著性(均P0.05)。結(jié)論1.抑制自噬降低膿毒癥大鼠生存率和生存時間,線粒體靶向抗氧化劑MitoQ對膿毒癥大鼠生存率和生存時間沒有影響。2.膿毒癥大鼠心肌組織自噬功能是有限的；抑制自噬可導致膿毒癥大鼠出現(xiàn)心功能障礙；自噬可能通過限制促炎細胞因子IL-1β、TNF-α、炎癥介質(zhì)ROS產(chǎn)生以及降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和阻止Ca2+-Mg2+-ATP酶失活,從而改善膿毒癥大鼠心功能障礙；線粒體靶向抗氧化劑MitoQ可降低膿毒癥心肌組織自噬功能,對膿毒癥大鼠心功能障礙無保護作用。3.自噬對LPS刺激的心肌細胞增強能力是有限的；抑制自噬可造成LPS刺激的心肌細胞結(jié)構(gòu)和功能損傷,影響心肌細胞內(nèi)鈣平衡,導致心肌細胞收縮舒張功能障礙,因而自噬可能對LPS刺激的心肌細胞收縮舒張功能障礙有保護作用；自噬可緩解LPS刺激的心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和ROS產(chǎn)生,提示自噬可能通過改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和減少ROS產(chǎn)生而對心肌細胞收縮舒張功能障礙起保護作用；線粒體靶向抗氧化劑MitoQ可降低LPS刺激的心肌細胞LC3-II的表達和ROS的產(chǎn)生,提示ROS可能是自噬的激活劑之一,MitoQ可能因為降低自噬功能而對LPS所致的心肌細胞收縮舒張功能障礙無保護作用。
【關(guān)鍵詞】：自噬 線粒體輔酶Q 心功能 膿毒癥 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激 大鼠
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R459.7
【目錄】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-26
• 前言26-34
• 參考文獻29-34
• 第一章 自噬抑制劑Wortmannin和線粒體靶向抗氧化劑MitoQ對膿毒癥大鼠生存率的影響34-45
• 1.1 材料與方法34-35
• 1.2 結(jié)果35-36
• 1.3 討論36-40
• 1.4 參考文獻40-45
• 第二章 自噬和MitoQ對膿毒癥大鼠心功能的影響45-94
• 2.1 材料與方法45-56
• 2.2 結(jié)果56-82
• 2.3 討論82-87
• 2.4 參考文獻87-94
• 第三章 自噬通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激緩解脂多糖所致心肌細胞收縮舒張功能障礙94-130
• 3.1 材料與方法94-100
• 3.2 結(jié)果100-123
• 3.3 討論123-126
• 3.4 參考文獻126-130
• 全文小結(jié)130-132
• 綜述132-159
• 參考文獻145-159
• 中英文縮略詞表159-161
• 攻讀博士學位期間研究成果161-162
• 致謝162-165
• 統(tǒng)計學證明165

  本文關(guān)鍵詞：自噬和線粒體輔酶Q對膿毒癥大鼠心功能的影響及機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：432221