本文關(guān)鍵詞：自噬和線粒體輔酶Q對(duì)膿毒癥大鼠心功能的影響及機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景和目的盡管抗生素治療和危重癥監(jiān)護(hù)技術(shù)提高,膿毒癥(sepsis)仍然是ICU患者的主要死亡原因。在發(fā)達(dá)國(guó)家膿毒癥死亡率仍高達(dá)40-60%。膿毒癥患者死亡的主要原因?yàn)槎嗥鞴俟δ苷系K(multiple organ dysfunction syndrome, MODS),心功能紊亂是膿毒癥MODS的重要組成部分,有心功能紊亂的膿毒癥患者比沒有心功能紊亂的患者死亡率高50%。膿毒癥之所以有如此高的死亡率,是因?yàn)槟摱景Y的病理生理改變十分復(fù)雜,目前研究認(rèn)為氧化應(yīng)激、線粒體損傷、過多活性氧(Reactive oxygen species, ROS)產(chǎn)生是膿毒癥發(fā)病的中心環(huán)節(jié),而心臟線粒體占總重量的30%,心臟更易受ROS影響,因此認(rèn)為線粒體受損、ROS產(chǎn)生過多等是膿毒癥心功能紊亂的主要原因,但確切發(fā)病機(jī)制目前尚不為人們所知。自噬的主要功能用于細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)的循環(huán)利用、損傷細(xì)胞器的清除、胞內(nèi)病原體的清除,從而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài),保證細(xì)胞能量供應(yīng),發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)性作用,但過度自噬同樣可能引起自噬細(xì)胞的死亡。有研究報(bào)道在膿毒癥動(dòng)物模型和臨床患者中觀察到心臟自噬的提高,但自噬在膿毒癥心功能紊亂中起保護(hù)作用或損害作用目前尚不明確。既然氧化應(yīng)激、線粒體損傷、過多ROS產(chǎn)生是膿毒癥心功能紊亂的主要因素,因此理論上抗氧化劑被認(rèn)為是最有希望改善膿毒癥心功能紊亂的治療措施,但抗氧化劑在臨床實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中并未取得滿意效果,認(rèn)為可能與這些抗氧化劑在體內(nèi)被代謝不能到達(dá)氧化應(yīng)激發(fā)生的主要部位線粒體有關(guān)。線粒體輔酶Q (mitochondrial coenzyme Q, MitoQ)是主要針對(duì)線粒體的靶向抗氧化劑,可能對(duì)ROS所致的器官組織損傷更具有保護(hù)效率。本研究通過對(duì)脂多糖(lipopolysaccharide, LP S)誘導(dǎo)的膿毒癥大鼠體內(nèi)及體外急性分離心肌細(xì)胞的研究,旨在了解自噬在膿毒癥大鼠心功能障礙中的作用及功能變化；自噬是否通過緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激改善LPS所致心肌細(xì)胞收縮舒張功能障礙；MitoQ是否通過清除ROS影響自噬功能,進(jìn)而對(duì)LPS所致心肌細(xì)胞收縮舒張功能障礙起保護(hù)作用。方法1.自噬和MitoQ對(duì)膿毒癥大鼠生存率的影響將SD雄性大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5組：LPS組、LPS+渥曼青霉素(Wortmannin)組、LPS + MitoQ組、Wortmannin組、MitoQ組,每組10只。LPS組、LPS+ Wortmannin組、LPS+ MitoQ組每只大鼠給LPS (10 mg/kg)腹腔注射,Wortmannin組、MitoQ組給等量生理鹽水(NS)注射。腹腔注射后1h采用尾靜脈分別給Wortmannin (2 mg/kg)、MitoQ (6.5 μmol/kg)或等量NS注射。腹腔注射后12h每隔1h觀察動(dòng)物生存情況。2.自噬和MitoQ對(duì)膿毒癥大鼠心功能的影響2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型及分組將SD大鼠隨機(jī)分10組：對(duì)照4h、6h組,LPS 4 h、6 h、8 h、12 h組,LPS + Wortmannin 4 h組,Wortmannin 4 h組,LPS + MitoQ 6 h組,MitoQ 6 h組,每組10只大鼠。所有含LPS組均給LPS(10 mg/kg)腹腔注射,對(duì)照組、Wortmannin4h組、MitoQ 6 h組則給等容量NS腹腔注射。大鼠腹腔注射后1h采用尾靜脈注射分別給Wortmannin (2mg/kg)、MitoQ (6.5 μmol/kg)干預(yù),其它各組則給等量NS相同處理。2.2大鼠頸總動(dòng)脈插管及數(shù)據(jù)記錄各組大鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)前30分鐘給10%水合氯醛0.3 ml/kg腹腔注射麻醉,分離右側(cè)頸總動(dòng)脈,插入PE50導(dǎo)管,BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)儀記錄各組大鼠左室最大收縮壓(Left ventricular systolic pressure,LVSP)、左室舒張末壓(Left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)、左室壓力上升／下降最大速率(Maximalrate of the rise/drop of left ventricular pressure, ±dp/dt max)。2.3血漿樣本收集及心肌組織形態(tài)學(xué)檢查左心室壓力測(cè)定后,腹主動(dòng)脈留取血標(biāo)本,分離血漿置于-70℃冰箱中保存待檢。采血后迅速取出心臟用冷PBS液充分沖洗后,一部分心肌組織用于HE染色,另一部分心肌組織用于制備電鏡標(biāo)本,剩余心肌組織液氮速凍,置于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.4血漿肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)含量檢測(cè)采用美國(guó)Beckman LX-20全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。2.5血漿及心肌組織中IL-1β、TNF-α、ROS含量檢測(cè)采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA),操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。2.6心肌組織Ca2+-Mg2+-ATP酶活性檢測(cè)采用BCA法測(cè)蛋白濃度,吸光度法檢測(cè)Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。2.7心肌組織中LC3、GRP78蛋白的表達(dá)采用Western blot法測(cè)定。3.自噬通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激緩解LPS所致心肌細(xì)胞收縮舒張功能障礙3.1心室肌細(xì)胞的分離取健康雄性SD大鼠,腹腔注射肝素2500 U/kg,30 min后,腹腔注射10%水合氯醛0.4 ml/kg麻醉,將Langendorff灌流套管插入主動(dòng)脈,酶解法分離心室肌細(xì)胞,分離的心肌細(xì)胞在8h之內(nèi)使用。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌?在測(cè)定心肌細(xì)胞收縮舒張功能、鈣瞬變、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性、細(xì)胞內(nèi)ROS含量、LC3、GRP78表達(dá)等指標(biāo)前,心肌細(xì)胞分別與不同濃度LPS (100ng/ml、200 ng/ml、1 μ/ml、 4 μg/ml)、�；敲撗跄懰�(TUDCA) (500 μM)、MitoQ(1 μmol/L)、Wortmannin(200nM)37℃共同孵育2 h。3.2大鼠心肌細(xì)胞收縮和舒張功能測(cè)定采用可視化動(dòng)緣探測(cè)系統(tǒng)(IonOptix)測(cè)定各組心肌細(xì)胞最大收縮幅度(Peak shortening,PS)、最大收縮速率(+dL/dt)、最大舒張速率(-dL/dt)。3.3大鼠心肌細(xì)胞舒張期鈣濃度及鈣瞬變的同步檢測(cè)將心肌細(xì)胞負(fù)載鈣離子熒光探針Fluo-4/AM后采用IonOptix系統(tǒng)同步測(cè)定心肌細(xì)胞舒張期鈣及鈣瞬變的變化。3.4心肌細(xì)胞Ca2+-Mg2+-ATP酶活性檢測(cè)采用BCA法測(cè)蛋白濃度,吸光度法檢測(cè)Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。3.5心肌細(xì)胞上清CK-MB.LDH含量檢測(cè)取各組心肌細(xì)胞上清液,用化學(xué)比色法測(cè)得CK-MB.LDH含量。3.6心肌細(xì)胞內(nèi)ROS含量檢測(cè)利用熒光探針2',7'二氯氫化熒光素乙二脂(2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)進(jìn)行活性氧檢測(cè),用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量。3.7心肌細(xì)胞中LC3、GRP78蛋白的表達(dá)采用Western blot法。結(jié)果1.自噬和MitoQ對(duì)膿毒癥大鼠生存率的影響及一般表現(xiàn)大鼠腹腔注射LPS后約1h后,出現(xiàn)精神萎靡、腹瀉、豎毛、大小便失禁、活動(dòng)減少、進(jìn)食、飲水減少等典型內(nèi)毒素血癥臨床癥狀,LPS + MitoQ組上述癥狀無減輕,LPS + Wortmannin組癥狀更顯著,并出現(xiàn)血尿、血便癥狀。Wortmannin組、MitoQ組大鼠與正常大鼠一般表現(xiàn)無差別,無死亡。LPS注射后12h內(nèi)LPS組死亡2只,LPS + MitoQ組死亡4只,LPS + Wortmannin組均死亡.LPS + MitoQ組、LPS + Wortmannin組、LPS組大鼠生存率分別為60%、0、80%,5組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=14.882,P=0.001),LPS + Wortmannin組生存率明顯低于LPS組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=10.208,P=0.001).LPs + Wortmannin組大鼠12h平均生存時(shí)間明顯短于LPS組(h：7.5±0.64比11.9±0.13,,=19.847,P=0.001),LPS + MitoQ組大鼠12h平均生存時(shí)間與LPS組無差異(h：11.6±0.24比11.9±0.13,χ2=1.055,P=0.137)。2.自噬和MitoQ對(duì)膿毒癥大鼠心功能的影響2.1各組大鼠血漿CK-MB、LDH含量變化大鼠給LPS后6 h出現(xiàn)血漿CK-MB、LDH含量的明顯升高與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較差異有顯著性(均P0.05)。給LPS后再給Wortmannin干預(yù)4 h即出現(xiàn)CK-MB、LDH含量的明顯升高,與LPS 4 h組比較差異有顯著性(均P0.05)；而給LPS后再給MitoQ干預(yù)CK-MB、LDH含量仍高于同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組(均P,0.05)。2.2各組大鼠心肌組織Ca2+-Mg2+-ATP酶活力的變化大鼠給LPS后6 h出現(xiàn)Ca2+-Mg2+-ATP活力明顯下降與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較差異有顯著性(F=3.049,P=0.016)。給LPS后再給Wortmannin干預(yù)4 h即出現(xiàn)Ca2+-Mg2+-ATP酶活力明顯下降,與LPS 4 h組比較差異有顯著性(F=10.221,P=0.001)；而給LPS后再給MitoQ干預(yù)Ca2+-Mg2+-ATP酶活力仍低于同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組(F=4.438,P=0.009),且與同時(shí)間點(diǎn)LPS組比較無明顯差異(F=4.438,P=0.698)。2.3各組大鼠在體心功能變化LPS注射后6 h大鼠出現(xiàn)心功能異常,表現(xiàn)為L(zhǎng)VEDP明顯升高,IVSP、±dp/dtmax明顯降低,與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較均有差異(均P0.05)；給LPS后再給Wortmannin 4 h即出現(xiàn)差異(均P0.01),與LPS4h組比較也有差異(均P0.01); LPS + MitoQ 6 h組與對(duì)照組比較有差異(均P0.05),但與同時(shí)間點(diǎn)LPS組均無差異(均P0.05)。2.4各組大鼠心肌組織病理學(xué)改變光鏡下,LPS 6 h、8 h、12 h組、LPS + MitoQ 6 h組和LPS + Wortmannin 4 h組均出現(xiàn)明顯心肌病理改變。電鏡下,LPS 6 h后自噬體增多,MitoQ干預(yù)后與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)LPS組無差異,而給予Wortmannin未見自噬體。2.5血漿及心肌組織中IL-1β、TNF-α、ROS含量變化大鼠給LPS后4h出現(xiàn)血漿、心肌組織TNF-α明顯升高與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較差異均有顯著性(均P0.05)。給LPS后再給Wortmannin干預(yù)血漿、心肌組織TNF-α明顯升高,與LPS 4 h組比較差異有顯著性(均P0.05)；而給LPS后再給MitoQ干預(yù)血漿、心肌組織TNNF-α仍高于同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組(均P0.05),但與同時(shí)間點(diǎn)LPS組比較無明顯差異(均P0.05)。大鼠給LPS后6h出現(xiàn)血漿、心肌組織IL-1p明顯升高與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較差異均有顯著性(均P0.05)。給LPS后再給Wortmannin干預(yù)血漿、心肌組織IL-1β明顯升高,與LPS 4 h組比較差異有顯著性(均P0.05)；而給LPS后再給MitoQ干預(yù)血漿、心肌組織IL-1p仍高于同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組(均P0.05),但與同時(shí)間點(diǎn)LPS組比較無明顯差異(均P0.05)。大鼠給LPS后6h出現(xiàn)血漿、心肌組織ROS明顯升高與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較差異有顯著性(均P0.05)。給LPS后再給Wortmannin干預(yù)血漿、心肌組織ROS明顯升高,與LPS 4 h組比較差異有顯著性(均P0.05)；而給LPS后再給MitoQ干預(yù)血漿、心肌組織ROS仍高于同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組(均P0.05),但與同時(shí)間點(diǎn)LPS組比較無明顯差異(均P0.05)。2.6心肌組織中LC3、GRP78表達(dá)量的變化大鼠給LPS后6h出現(xiàn)LC3-II表達(dá)量的明顯增加,與對(duì)照組比較有差異(F=10.408,P=0.001),LPS 12 h表達(dá)的量有下降趨勢(shì),但與LPS 8 h比較無差異(F=10.408,P=0.810).LPS + MitoQ 6 h組與LPS 6 h組比較有差異(F=10.787,P=0.002).GRP78表達(dá)的量給LPS后6h明顯增加,與對(duì)照組比較有有差異(F=7.214,P=0.002),LPS + Wortmannin 4 h組與LPS 4 h組比較有差異(F=10.289,P=0.001).3.自噬通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激緩解LPS所致心肌細(xì)胞收縮舒張功能障礙3.1不同濃度LPS對(duì)心肌細(xì)胞自噬功能影響隨著LPS濃度的增高,自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-II蛋白表達(dá)逐步增加,但隨著LPS濃度的進(jìn)一步增高,LC3-II蛋白表達(dá)有下降趨勢(shì)。3.2 Wortmannin對(duì)心肌細(xì)胞CK-MB.LDH.Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響LPS+Wortmannin組CK-MB、LDH活性顯著高于LPS組,而Ca2+-Mg2+-ATP酶活性顯著低于LPS組,差異均有顯著性(均P0.05)。給內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性抑制劑TUDCA,CK-MB、LDH活性有下降,而Ca2+-Mg2+-ATP酶活性有升高,與LPS + Wortmannin組比較差異均有顯著性(均P0.05)。3.3 Wortmannin對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響LPS + Wortmannin組顯著高于LPS組,差異有顯著性(F=63.278,P=0.000),給內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性抑制劑TUDCA,ROS含量有下降,與LPS + Wortmannin組比較差異有顯著性(F=63.278,P=0.000)。3.4 Wortmannin對(duì)心肌細(xì)胞收縮舒張功能的影響LPS + Wortmannin組PS、±dL/dt顯著低于對(duì)照組,差異均有顯著性(均P0.05),給內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性抑制劑TUDCA,PS、±dL/dt有升高,與LPS+Wortmannin組比較差異均有顯著性(均P0.05)。3.5 Wortmannin對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的影響LPS + Wortmannin組舒張期鈣顯著高于LPS組,差異有顯著性(F=22.869,P=0.000),而鈣瞬變顯著低于LPS組,差異有顯著性(F=92.834,P=0.000)。給內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性抑制劑TUDCA,舒張期鈣有降低,鈣瞬變有升高,與LPS+ Wortmannin組比較差異均有顯著性(均P0.05)。3.6 Wortmannin對(duì)心肌細(xì)胞GRP78表達(dá)的影響LPS + Wortmannin組GRP78表達(dá)水平顯著高于LPS組,差異有顯著性(F=5.886,P=0.001)。給內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性抑制劑TUDCA,GRP78表達(dá)水平顯著低于LPS + Wortmannin組,差異有顯著性(F=5.886,P=0.043)。3.7 MitoQ對(duì)心肌細(xì)胞CK-MB、LDH、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響LPS組CK-MB、LDH活性顯著高于對(duì)照組,而Ca2+-Mg2+-ATP酶活性顯著低于對(duì)照組,差異均有顯著性(均P0.05)。給MitoQ干預(yù)LPS + MitoQ組CK-MB、LDH活性無明顯下降,Ca2+-Mg2+-ATP酶活性無明顯升高,與LPS組比較差異均無顯著性(均P0.05),但與對(duì)照組比較均有差異(均P0.05)。3.8 MitoQ對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響LPS組顯著高于對(duì)照組,差異有顯著性(F=22.753,P=0.000),給MitoQ干預(yù)LPS + MitoQ組ROS含量明顯下降,與LPS組比較差異有顯著性(F=22.753,P=0.003),但仍高于對(duì)照組,差異有顯著性(F=22.753,P=0.003)。3.9 MitoQ對(duì)心肌細(xì)胞LC3表達(dá)的影響LPS組顯著高于對(duì)照組,差異有顯著性(F=15.019,P=0.000)。LPS + MitoQ組顯著低于LPS組,差異有顯著性(F=15.019,P=0.011),但仍高于對(duì)照組,差異有顯著性(F=15.019,P=0.011)。3.10 MitoQ對(duì)心肌細(xì)胞收縮舒張功能的影響LPS組PS、±dL/dt顯著低于對(duì)照組,差異均有顯著性(均P0.05),LPS+MitoQ組PS、±dL/dt有升高,但仍低于對(duì)照組,差異均有顯著性(均P0.05)3.11 MitoQ對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的影響LPS組舒張期鈣濃度明顯增加,而鈣瞬變幅度明顯降低,與對(duì)照組比較差異均有顯著性(均P0.01)；與LPS組比較LPS + MitoQ組心肌細(xì)胞內(nèi)舒張期鈣濃度有降低,鈣瞬變幅度有增加,但差異均無顯著性(均P0.05),與對(duì)照組比較差異均有顯著性(均P0.05)。結(jié)論1.抑制自噬降低膿毒癥大鼠生存率和生存時(shí)間,線粒體靶向抗氧化劑MitoQ對(duì)膿毒癥大鼠生存率和生存時(shí)間沒有影響。2.膿毒癥大鼠心肌組織自噬功能是有限的；抑制自噬可導(dǎo)致膿毒癥大鼠出現(xiàn)心功能障礙；自噬可能通過限制促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、炎癥介質(zhì)ROS產(chǎn)生以及降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和阻止Ca2+-Mg2+-ATP酶失活,從而改善膿毒癥大鼠心功能障礙；線粒體靶向抗氧化劑MitoQ可降低膿毒癥心肌組織自噬功能,對(duì)膿毒癥大鼠心功能障礙無保護(hù)作用。3.自噬對(duì)LPS刺激的心肌細(xì)胞增強(qiáng)能力是有限的；抑制自噬可造成LPS刺激的心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能損傷,影響心肌細(xì)胞內(nèi)鈣平衡,導(dǎo)致心肌細(xì)胞收縮舒張功能障礙,因而自噬可能對(duì)LPS刺激的心肌細(xì)胞收縮舒張功能障礙有保護(hù)作用；自噬可緩解LPS刺激的心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和ROS產(chǎn)生,提示自噬可能通過改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和減少ROS產(chǎn)生而對(duì)心肌細(xì)胞收縮舒張功能障礙起保護(hù)作用；線粒體靶向抗氧化劑MitoQ可降低LPS刺激的心肌細(xì)胞LC3-II的表達(dá)和ROS的產(chǎn)生,提示ROS可能是自噬的激活劑之一,MitoQ可能因?yàn)榻档妥允晒δ芏鴮?duì)LPS所致的心肌細(xì)胞收縮舒張功能障礙無保護(hù)作用。
【關(guān)鍵詞】：自噬 線粒體輔酶Q 心功能 膿毒癥 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 大鼠
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R459.7
【目錄】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-26
• 前言26-34
• 參考文獻(xiàn)29-34
• 第一章 自噬抑制劑Wortmannin和線粒體靶向抗氧化劑MitoQ對(duì)膿毒癥大鼠生存率的影響34-45
• 1.1 材料與方法34-35
• 1.2 結(jié)果35-36
• 1.3 討論36-40
• 1.4 參考文獻(xiàn)40-45
• 第二章 自噬和MitoQ對(duì)膿毒癥大鼠心功能的影響45-94
• 2.1 材料與方法45-56
• 2.2 結(jié)果56-82
• 2.3 討論82-87
• 2.4 參考文獻(xiàn)87-94
• 第三章 自噬通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激緩解脂多糖所致心肌細(xì)胞收縮舒張功能障礙94-130
• 3.1 材料與方法94-100
• 3.2 結(jié)果100-123
• 3.3 討論123-126
• 3.4 參考文獻(xiàn)126-130
• 全文小結(jié)130-132
• 綜述132-159
• 參考文獻(xiàn)145-159
• 中英文縮略詞表159-161
• 攻讀博士學(xué)位期間研究成果161-162
• 致謝162-165
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)證明165

  本文關(guān)鍵詞：自噬和線粒體輔酶Q對(duì)膿毒癥大鼠心功能的影響及機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：432221