本文關(guān)鍵詞：KLF1突變的人群遺傳學(xué)研究及其對(duì)β地中海貧血臨床表型嚴(yán)重性的遺傳修飾作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景與目的p地中海貧血(β-thalassemia,簡(jiǎn)稱p地貧)是一種常見的嚴(yán)重威脅人類健康的致死、致殘的遺傳性血液病,主要分布在全球的熱帶和亞熱帶地區(qū),在我國(guó)廣東和廣西是發(fā)生率最高的兩個(gè)省區(qū),其基因攜帶率分別高達(dá)2.54%和6.43%。β地貧為常染色體單基因隱性遺傳病,是由染色體11p15.3的β-globin基因突變導(dǎo)致p珠蛋白肽鏈合成減少或缺失而導(dǎo)致的一種疾病,β地貧攜帶者(輕型β地貧；β-thalassemia trait, TT)婚配的下一代有1/4的機(jī)會(huì)罹患有嚴(yán)重溶血性貧血癥狀的中、重型p地中海貧血(P-thalassemia intermedia, TI; β-thalassemia major,TM)。值得注意的是同是純合子或雙重雜合子的β地貧患者,其臨床表型從中間型(Hb 60-100 g/L)到重型(Hb60 g/L,嚴(yán)重者20-40 g/L)存在很大差異,研究表明β地貧的表型變化首先是由其致病基因的突變來決定的,即臨床表現(xiàn)與β珠蛋白基因的突變基因型直接相關(guān),β基因完全被抑制的β0突變純合子(β0/β0)一般都表現(xiàn)為重型β地貧,而β基因部分被抑制的曠突變純合子(β+/β+)則多表現(xiàn)為中間型β地貧,而雙重雜合子(β0/β+)可能表現(xiàn)為中間型β地貧,也可能是重型β地貧。目前無論是在人類還是在小鼠模型的研究中均已有報(bào)道一些β-globin基因以外的基因?qū)Ζ碌刎毰R床表型的嚴(yán)重性起著修飾作用,例如分子伴侶AHSP (Alpha Hemoglobin Stabilizing Protein), HRI基因(Heme-regulated eIF2alpha kinase)等等。但下列兩種能減輕α/β鏈比例失衡程度的遺傳修飾因素是最主要因素：(1)患者同時(shí)合并α地貧突變而減輕(反之,合并α-globin基因三聯(lián)體或多拷貝而加重)；(2)患者同時(shí)合并引起胎兒血紅蛋白(Fetal hemoglobin, Hb F; α2γ2)升高的遺傳變異緩解疾病的嚴(yán)重性。我們課題組之前的研究證實(shí)AHSP基因變異不是中國(guó)人p地貧臨床表型的主要遺傳因素,此外,我們還系統(tǒng)研究了中國(guó)人中間型p地貧的分子缺陷原因,結(jié)果提示還存在其他一些未知的遺傳修飾因素對(duì)β地貧的表型變化有貢獻(xiàn)。EKLF/KLF1是Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子家族(Kruppel-like transcription factors, KLFs)成員之一,其羧基端含三個(gè)串聯(lián)的鋅指結(jié)構(gòu)域,通過特異性的識(shí)別結(jié)合保守的DNA序列5'-CCMCRCCCN-3'啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄從而調(diào)節(jié)紅細(xì)胞一系列的生長(zhǎng)發(fā)育過程。近幾年研究證明,KLF1作為一個(gè)重要的調(diào)控因子參與調(diào)控了胎兒血紅蛋白(Hb F)向成人血紅蛋白(Adult hemoglobin A, Hb A; α2γ2)的轉(zhuǎn)化過程；2010年的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)KLF1的顯性突變(p.E325K)可以導(dǎo)致先天性紅細(xì)胞生成異常性貧血四型(Congenital dyserythropoietic anemia, CDAⅣ)；2014年報(bào)道了KLF1雙重突變可以導(dǎo)致先天性的慢性非球形紅細(xì)胞溶血性貧血(Chronic nonspherocytic hemolytic anemia, CNSHA);但是有更多的研究顯示KLFl單等位基因的突變僅僅導(dǎo)致一系列的良性表型,如In(Lu)稀有血型,Hb F和成人血紅蛋白A2 (Adult hemoglobin A2,Hb A2; α2δ2)升高(這兩點(diǎn)均為p地貧的重要特征,且Hb F升高有利于改善p地貧患者臨床表型嚴(yán)重性)等。然而,目前沒有任何研究展開基于人群遺傳學(xué)的KLFl突變研究,亦沒有關(guān)于KLF1突變與β-globin突變共遺傳的表型研究。因此,本次研究首次通過分子篩查一個(gè)大樣本中國(guó)人群來調(diào)查KLFl基因的突變率與突變譜,并通過表型研究來評(píng)估KLF1突變是否對(duì)p地貧具有遺傳修飾作用。設(shè)計(jì)與方法一、研究人群、病人和表型檢測(cè)本研究通過隨機(jī)抽樣對(duì)長(zhǎng)期居住在中國(guó)南方地區(qū)的3918例非親緣關(guān)系個(gè)體進(jìn)行了突變分析,這個(gè)大人群隊(duì)列包括：3839例連續(xù)采集的樣本和79例表型導(dǎo)向型樣本(Hb A2水平：3.3%-4.1%和/或Hb F水平大于1.5%)。KLF1人群突變頻率通過調(diào)查3839例連續(xù)采集的樣本得出,而KLF1突變譜由所有3918例篩查到的所有突變組成,所有KLF1突變的陽性樣本均用來進(jìn)行表型分析。3839例連續(xù)采集的樣本(年齡1-50歲；1987例男性,1852例女性)由三個(gè)隊(duì)列組成：隊(duì)列A,1971例非地貧人群；隊(duì)列B,946例β地貧攜帶者；隊(duì)列C,922例p地貧中重型病人(根據(jù)回顧性的臨床指標(biāo)分為568例重型,354例中間型)。隊(duì)列A從本課題組前期對(duì)廣西地區(qū)進(jìn)行地貧流行病學(xué)調(diào)查的樣本中隨機(jī)抽出,隊(duì)列B和C樣本收集于2008年11月份至2013年6月份。79例表型導(dǎo)向型樣本(隊(duì)列D)用Hb A2和Hb F這兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行篩選,為的是富集KLFl突變個(gè)體。所有南方人群均來自中國(guó)地貧高發(fā)區(qū)域：廣東省或者廣西壯族自治區(qū)。與此同時(shí),我們通過采集攜帶KLF1突變的p地貧患者進(jìn)行了家系研究,以確認(rèn)突變是自發(fā)突變還是遺傳性突變。另外,我們還召集了中國(guó)非地貧高發(fā)區(qū)域的1190例個(gè)體作為對(duì)照研究,他們來自中國(guó)北方地區(qū)山東省。所有的血液學(xué)參數(shù)均用自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定,血紅蛋白組分分析運(yùn)用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。紅細(xì)胞表面抗原CD44表達(dá)量運(yùn)用流式細(xì)胞儀分析。二、分子遺傳檢測(cè)DNA提取采用傳統(tǒng)的酚/氯仿抽提法。通過高分辨率熔解曲線技術(shù)分析(HRM assay)篩查所有參加者的KLFl變異,運(yùn)用第一代測(cè)序?qū)λY查的變異進(jìn)行驗(yàn)證。一共設(shè)計(jì)9對(duì)引物覆蓋KLFl基因的編碼區(qū)(外顯子1-3)和非編碼區(qū)(啟動(dòng)子區(qū)、剪接位點(diǎn)、5'UTR和3'UTR)。與此同時(shí),我們對(duì)最主要的4個(gè)與Hb F升高相關(guān)的SNP位點(diǎn)進(jìn)行了基因分型,其中3個(gè)位點(diǎn)運(yùn)用HRM技術(shù)進(jìn)行SNP分型(BCL11A:rs11886868 和 rs766432; HBS1L-MYB:rs9399137),1個(gè)SNP位點(diǎn)應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)(PCR-RFLP)進(jìn)行分型(HBG2:rs7482144, XmnI)。根據(jù)科室早前地中海貧血流行病學(xué)調(diào)查研究中所用的分子篩查方法來驗(yàn)證HBA和HBB基因上的缺失型和點(diǎn)突變。對(duì)于KLF1變異是否是功能性突變主要基于兩點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)：(1)根據(jù)表型的變化：攜帶者Hb F水平大于1%同時(shí)/或紅細(xì)胞表面抗原CD44表達(dá)下降；(2)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)：應(yīng)用SIFT (http://sift.jcvi.org)和PolyPhen-2 (http://genetics. bwh.harvard.edu/pph2)軟件來預(yù)測(cè)所發(fā)現(xiàn)的KLF1變異是否影響其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能。三、統(tǒng)計(jì)分析所有的統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件或R語言進(jìn)行,P0.05視為具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所有數(shù)量變量均用曼惠特尼U檢驗(yàn)(Mann-Whitney U test)或卡方檢驗(yàn)(X2 test)評(píng)價(jià)是否存在顯著性差異。多因素分析應(yīng)用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型(Cox proportional hazards model)評(píng)估8個(gè)潛在修飾因素(協(xié)變量),包括性別因素,HBA基因型,HBB基因型,KLF1基因型,XmnI, rs 11886868,rs766432和rs9399137與922例地貧患者表型輕重的關(guān)系(以患者首次輸血時(shí)間為因變量),計(jì)算各個(gè)潛在修飾因素的比值比(Hazard ratios, HR),并以95%的置信區(qū)間(Confidence intervals, CI)呈現(xiàn)。當(dāng)協(xié)變量的P大于0.1將會(huì)被排除出Cox回歸的模型,模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性以Harrell's一致性系數(shù)(Harrell's concordance index)評(píng)價(jià),模型擬合度用R2來評(píng)價(jià)(R version 3.0.1 rms語言包)。單因素分析應(yīng)用Mann-Whitney U test或X2 test來比較攜帶KLF1突變組和未攜帶KLF1突變組p地貧的臨床表型差異,根據(jù)Kaplan-Meier繪制無輸血生存曲線,并用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)(log-rank test)比較兩組曲線間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。應(yīng)用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)(Goodness-of-it Chi-square test)分析各SNP位點(diǎn)基因型分布在本研究的患者人群中的分布是否符合哈迪-溫伯格平衡定率(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)。結(jié)果一、中國(guó)南方地區(qū)人群具有相對(duì)高的KLF1突變率中國(guó)南方人群KLFl突變率在隊(duì)列A,隊(duì)列B,隊(duì)列C的突變率分別是：1.27%(25/1971),1.16%(11/946),1.30%(12/922),且這三組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P=0.959,但南方人群KLF1總突變率顯著高于北方人群(1.25%vs.0.08%,P0.001),說明KLFl突變?cè)谥袊?guó)南方人群有相對(duì)高的突變頻率,且在地中海貧血流行區(qū)域更為常見。二、廣泛的KLFl突變譜3839例連續(xù)采集的南方人群樣本(隊(duì)列A,B,C)中共鑒定出48個(gè)突變的KLF1等位基因,79例表型導(dǎo)向型樣本共發(fā)現(xiàn)16個(gè),檢出率為20.25%。這64個(gè)突變的KLFl等位基因共有7種不同的KLF1突變,組成了中國(guó)南方人群的KLF1突變譜。41例個(gè)體僅僅有KLFl雜合突變(來自隊(duì)列A的25例與來自隊(duì)列D的16例)；11例為KLF1雜合突變合并β雜合突變(來自隊(duì)列B)；12例為KLF1雜合突變合并β雙重雜合突變(來自隊(duì)列C)。這些突變中有4種KLF1突變?cè)谥暗难芯恐幸呀?jīng)報(bào)道(p.Gly176AlafsX179, p.Ala298Pro, p.Thr334Arg和c.913+1GA),另外3種突變?yōu)槭澜缡讏?bào)的新突變(p.His299Asp, p.Cys341Tyr和p.Glu5Lys);從突變類型來看,有5種錯(cuò)義突變(p.Glu5Lysp, Ala298Pro, p.His299Asp, p.Thr334Arg和p.Cys341Tyr),1種移碼突變(p.Gly176AlafsX179)和1種剪切突變(c.913+1GA)；從突變位于基因的功能區(qū)域來看,有6種突變會(huì)破壞KLF1的鋅指結(jié)構(gòu)域(p.Gly176AlafsX179, Ala298Pro, p.His299Asp, p.Thr334Arg, p.Cys341Tyr和c.913+1GA);從突變譜看,p.Gly176AlafsX179和p.His299Asp為最主要的兩種突變,占所有突變的90.6%。另外本研究還報(bào)道了13種新的中性KLFl變異,包括4種錯(cuò)義突變、4種同義突變和5種3'UTR突變。所發(fā)現(xiàn)的這些突變首次展現(xiàn)了KLF1基因人群廣泛的突變譜。三、KLFl突變可改變正常個(gè)體血液學(xué)參數(shù)通過對(duì)41例攜帶KLFl突變的非地貧人群(25例來自隊(duì)列A,16例來自隊(duì)列D)進(jìn)行血液學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)無論是平均紅細(xì)胞體積(Mean corpuscular volume,MCV)還是平均紅細(xì)胞血紅蛋白量(Mean corpuscular hemoglobin,MCH)與1946例未攜帶KLF1突變的非地貧人群相比都輕微的降低了(MCV:82.45±5.39 vs. 89.29±4.77 fL,P0.001；MCH:26.95±2.11 vs.29.46±1.44 pg,P0.001)。另外,這41例個(gè)體的Hb A2和Hb F水平也有一定程度的升高,分別為3.28±0.45%和3.44±1.75%。因此,本研究首次通過人群研究發(fā)現(xiàn)輕微升高或者處于臨界值的MCV和MCH是KLF1基因突變的重要表型,與升高的Hb A2和Hb F這兩個(gè)已發(fā)現(xiàn)的指標(biāo)一樣,可以提高篩查KLF1基因突變的陽性率。四、KLF1突變可改變?chǔ)碌刎殧y帶者的血液學(xué)表型本研究對(duì)14例KLF1雜合突變與β0雜合突變共遺傳的個(gè)體進(jìn)行了血液學(xué)分析,其中7例β0/βN來自隊(duì)列B(隊(duì)列B中1例β+/βN,1例βE/βN,2例β0/βN合并α地貧被排除分析),另外7例β0/βN來自家系樣本。意外的是,這14例個(gè)體MCV或MCH與217例β0雜合突變攜帶者相比,并未顯得更低,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(MCV:63.53±3.94 vs.65.11±4.34 fL,P=0.112；MCH:20.26±1.42 vs. 20.34±1.37pg,P=0.567).另外一方面,這14例個(gè)體顯示出了相當(dāng)高的Hb A2((α282)水平(6.47±0.81%,最低5.10%,最高8.00%),顯示出KLF1突變和β-globin基因突變對(duì)δ-globin基因表達(dá)升高的疊加作用；與此同時(shí),我們注意到這些樣本具有升高的且變異的Hb F水平(7.67±4.11%,最低3.60%,最高18.20%),但其變異性有待進(jìn)一步研究。五、KLF1突變可減輕β地貧患者臨床表型嚴(yán)重性為了評(píng)價(jià)KLF1突變對(duì)β地貧患者臨床表型的修飾作用,我們?nèi)嫜芯苛?22例β地貧患者的臨床表型和目前已知的潛在的減輕p地貧患者臨床表型的遺傳因素。我們意外的發(fā)現(xiàn)2種KLFl突變選擇性的出現(xiàn)在12例中間型β地貧患者(TI)中(其中10例攜帶p.Gly176AlafsXl 79,2例攜帶p.His299Asp).通過Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型(Cox proportional hazards model)對(duì)8個(gè)潛在修飾因素進(jìn)行評(píng)估結(jié)果顯示,KLF1基因突變對(duì)p地貧患者臨床表型修飾作用最大(HR=0.213,P0.001),其次是HBB基因型(β+,HR:0.353,P0.001),XmnI(+, HR=0.512,P0.001),HBA突變(HR=0.671,P0.001),rs9399137(HR= 0.724,P0.001)rs766432(HR=0.761,P0.001),但性別因素(HR=0.893.P=0.107)和rs11886868(HR:0.871,P=0.415)這2個(gè)因素被模型排除。12例TI的基因型中7例是β0/β0+αα/αα,3例β0/β++αα/αα,2例β0/β0+—SEA/αα,我們通過單因素分析[β0/β0+αα/αα,XmnI(-/-),rs766432 )(AAor AC),rs9399137 (TT or CT)]比較7例攜帶KLFl突變和362例無KLFl突變的β地貧患者臨床表型,結(jié)果顯示這7例β地貧患者表現(xiàn)出相對(duì)輕的臨床表型：較高的Hb水平(82.57±7.81 vs.66.33±17.53g/L,P=0.006),較高的Hb F水平(39.58±21.80 vs.9.17±11.05 g/L,P0.001),相對(duì)少的輸血次數(shù)(OR:0.082,P=0.007)和較低的TM風(fēng)險(xiǎn)率(OR=0.009,P0.001).Kaplan-Meier無輸血生存曲線顯示出顯著的差異存在這兩組中(P0.001),其第一次輸血的中位時(shí)間分別是36個(gè)月和6個(gè)月。另外,所有攜帶12例KLFl突變的TI第一次輸血的中位時(shí)間是48個(gè)月,而922例β地貧患者人群中的342例非攜帶KLF1突變的TI第一次輸血的中位時(shí)間是24個(gè)月,但統(tǒng)計(jì)學(xué)并未顯示出兩者間具有差異(P=0.093),顯示出兩組TI具有一定的同質(zhì)性。結(jié)論一、本研究首次設(shè)計(jì)人群遺傳學(xué)大樣本的研究調(diào)查出KLF1基因突變?cè)谥袊?guó)南方和中國(guó)北方地區(qū)的人群突變率,證明KLF1基因突變?cè)诘刂泻Ｘ氀餍袇^(qū)域更常見(1.25% vs.0.08%)。與此同時(shí),鑒定出的64個(gè)KLF1突變?nèi)娴恼宫F(xiàn)出中國(guó)人群廣泛的KLF1突變譜。二、首次通過對(duì)攜帶KLF1突變的非地貧樣本和β雜合子樣本的基因型與表型樣的分析,系統(tǒng)闡明了KLF1突變可以引起MCV和MCH輕微降低或處于臨界值,Hb A2水平和Hb F水平升高；功能性突變可以使紅細(xì)胞表面抗原CD44表達(dá)降低。這些變異的表型有助于KLF1突變的人群篩查。三、應(yīng)用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型全面系統(tǒng)的評(píng)估了包括KLF1突變?cè)趦?nèi)的8個(gè)因素對(duì)922例β地貧患者的臨床表型修飾作用,發(fā)現(xiàn)KLF1突變可以減輕β地貧患者的臨床表型且影響作用最強(qiáng),對(duì)精確診斷β地貧、產(chǎn)前診斷、遺傳咨詢和基因診斷方面提供了重要依據(jù)和線索。
【關(guān)鍵詞】：β地中海貧血 KLF1突變 群體遺傳 基因型-表型 修飾基因
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R556.61
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-27
• 第1章 引言27-39
• 1.1 β地中海貧血及臨床表型多樣性27-32
• 1.2 數(shù)量性狀位點(diǎn)控制的Hb F水平調(diào)節(jié)32-36
• 1.3 紅系轉(zhuǎn)錄因子KLF136-39
• 第2章 實(shí)驗(yàn)材料39-46
• 2.1 主要儀器39-40
• 2.2 分析軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)40-41
• 2.3 相關(guān)試劑41-46
• 第3章 實(shí)驗(yàn)方法46-68
• 3.1 人群設(shè)計(jì)46
• 3.2 樣本收集46-47
• 3.3 p地貧病例臨床表型分類標(biāo)準(zhǔn)47
• 3.4 本研究技術(shù)路線圖47-48
• 3.5 表型分析48-50
• 3.6 外周血基因組DNA提取50-52
• 3.7 HBA和HBB突變分析52-57
• 3.8 KLF1突變分析57-62
• 3.9 Hb F表達(dá)相關(guān)SNPs分型62-65
• 3.10 雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)ζ-珠蛋白表達(dá)檢測(cè)65-66
• 3.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析66-68
• 第4章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果68-99
• 4.1 南方人群具有相對(duì)高的KLF1突變率68-70
• 4.2 KLF1廣泛的突變譜70-77
• 4.3 KLF1突變可改變正常個(gè)體血液學(xué)參數(shù)77-81
• 4.4 KLF1突變可改變?chǔ)碌刎殧y帶者的血液學(xué)參數(shù)81-84
• 4.5 KLF1突變可減輕β地貧患者臨床表型嚴(yán)重性84-99
• 第5章 討論99-104
• 結(jié)論104-105
• 參考文獻(xiàn)105-113
• 附錄113-118
• 附錄一 KLF1基因DNA序列、結(jié)構(gòu)及HRM引物位置113-116
• 附錄二 英文縮略詞表總結(jié)116-118
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)審稿證明118-119
• 碩博攻讀期間發(fā)表論文119-120
• 致謝120-122

  本文關(guān)鍵詞：KLF1突變的人群遺傳學(xué)研究及其對(duì)β地中海貧血臨床表型嚴(yán)重性的遺傳修飾作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：411667