本文關(guān)鍵詞：PI3Kγ在小鼠血管損傷中的作用及機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：(1)血管損傷所致的血管疾患目前是全球范圍內(nèi)發(fā)病率及死亡率最高的疾病之一。近來研究發(fā)現(xiàn)PI3Kγ在炎癥、氧化應(yīng)激、心血管疾病及組織損傷、修復(fù)中起重要作用。本研究旨在探討PI3Kγ在小鼠血管損傷中的作用及機(jī)制。(2)越來越多的證據(jù)表明血小板參與血管炎癥的發(fā)生發(fā)展,本研究旨在探討血小板PI3Kγ在血管損傷中的作用及機(jī)制。方法：(1)在小鼠頸動脈結(jié)扎模型基礎(chǔ)上比較野生型(WT)及PI3Kγ基因敲除小鼠血管損傷反應(yīng)。采用病理形態(tài)學(xué)分析新生內(nèi)膜形成情況,并用免疫熒光及免疫組化法檢測損傷血管炎癥細(xì)胞浸潤及NF-κB表達(dá),RT-PCR檢測炎癥介質(zhì)的表達(dá), DHE染色檢測血管壁活性氧生成。體外實(shí)驗(yàn)中采用MMT法及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell小室遷移法比較野生型PI3Kγ基因敲除血管平滑肌平滑肌細(xì)胞增殖及遷移。(2)在小鼠頸動脈部分結(jié)扎模型上反復(fù)靜脈注射活化的血小板。采用病理形態(tài)學(xué)分析頸動脈中膜-內(nèi)膜厚度,免疫熒光法檢測血管炎癥細(xì)胞浸潤,明膠酶譜法檢測受損血管局部MMP-9的活性,實(shí)時熒光定量PCR檢測損傷血管局部炎癥介質(zhì)包括炎癥因子(TNF-α、IL-6)及粘附分子(VCAM-1,ICAM-1)的表達(dá),DHE染色檢測血管壁活性氧生成。體外實(shí)驗(yàn)中采用流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板表面分子表達(dá)、活性氧生成、血小板白細(xì)胞聚集物形成,western blot檢測血小板Akt及p-38表達(dá)及活化,血小板、內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)檢測血小板-白細(xì)胞相互作用。結(jié)果：(1)血管損傷后3天、7天白細(xì)胞浸潤明顯,其中第3天以中性粒細(xì)胞為主,第七天以單核巨噬細(xì)胞為主,而PI3Kγ基因敲除小鼠損傷血管局部炎癥細(xì)胞浸潤均明顯減少；PI3Kγ基因敲除小鼠損傷血管局部的細(xì)胞因子(TNF-α和IL-6)及粘附分子(ICAM-1和VCAM-1)及NF-κB表達(dá)減少。(2)血管損傷后PI3Kγ基因敲除小鼠活性氧的生成較WT小鼠明顯降低。(3)血管損傷后PI3Ky基因敲除小鼠新生內(nèi)膜形成較WT小鼠明顯減少,血管平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜的增殖遷移減少；體外實(shí)驗(yàn)顯示PI3Kγ-/-血管平滑肌增殖及遷移能力降低。(4)頸動脈部分結(jié)扎模型顯示小鼠反復(fù)注射ADP活化的血小板后血管內(nèi)膜-中膜增厚血管重塑明顯,而注射PI3Ky-/-血小板后此作用明顯減弱。(5)WT血小板注射小鼠損傷血管的炎癥細(xì)胞浸潤、炎癥介質(zhì)表達(dá)、MMP-9活性及活性氧生成明顯增多；而PI3Kγ-/-血小板注射小鼠血管炎癥細(xì)胞浸潤、炎癥介質(zhì)表達(dá)、MMP-9活性及活性氧生成增多不明顯。(6)體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)ADP不能誘導(dǎo)PI3Ky-/-血小板Akt、p-38活化,不能誘導(dǎo)PI3Ky-/-血小板活化。(7)ADP不能誘導(dǎo)PI3Kγ-/-血小板NADPH酶活化及活性氧生成。(8)ADP誘導(dǎo)的血小板-白細(xì)胞聚集物形成及血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附中PI3Kγ-/-血小板較WT血小板明顯減弱。結(jié)論：(1)PI3Kγ介導(dǎo)血管損傷后的炎癥反應(yīng)、活性氧生成及新生內(nèi)膜的形成。(2)血小板PI3Kγ通過調(diào)節(jié)血小板活化、氧化應(yīng)激及其與白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用介導(dǎo)血管損傷后的炎癥反應(yīng)、活性氧生成及新生內(nèi)膜形成。展望：PI3Ky可能作為心腦血管疾病的一個治療靶點(diǎn),同時血小板PI3Ky可作為心腦血管疾病中抗血小板治療的一個新的研究方向。
【關(guān)鍵詞】：PI3Kγ 血小板 血管損傷 炎癥
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R743;R543
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 第一部分 PI3Kγ在血管損傷修復(fù)中的作用及機(jī)制研究13-47
• 1 前言13-18
• 1.1 PI3Kγ的分子生物學(xué)特性13-15
• 1.2 PI3Kγ在炎癥反應(yīng)中的作用15-16
• 1.3 PI3Kγ與炎癥性疾病16-18
• 2 材料18-19
• 2.1 儀器18-19
• 2.2 試劑及材料19
• 2.3 實(shí)驗(yàn)動物19
• 3 方法19-30
• 3.1 實(shí)驗(yàn)動物分組19-20
• 3.2 頸動脈損傷模型制作20
• 3.3 病理取材20
• 3.4 標(biāo)本處理20-21
• 3.5 Verhoeff's染色(彈力纖維染色)21-22
• 3.6 組織形態(tài)學(xué)分析22
• 3.7 免疫熒光染色22-23
• 3.8 免疫組化染色23-24
• 3.9 定量PCR檢測相關(guān)基因表達(dá)24-27
• 3.10 DHE染色27-28
• 3.11 平滑肌原代細(xì)胞培養(yǎng)28-29
• 3.12 平滑肌細(xì)胞增殖試驗(yàn)29
• 3.13 平滑肌細(xì)胞遷移趨化實(shí)驗(yàn)29-30
• 3.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析30
• 4 結(jié)果30-43
• 4.1 PI3Kγ介導(dǎo)血管損傷后炎癥反應(yīng)30-36
• 4.2 PI3Kγ缺失抑制了血管損傷引起的活性氧生成的增加36
• 4.3 PI3Kγ介導(dǎo)血管損傷后平滑肌增殖及新生內(nèi)膜形成36-43
• 5 討論43-46
• 小結(jié)46-47
• 第二部分 血小板PI3Kγ在血管損傷修復(fù)中的作用及機(jī)制研究47-80
• 1 前言47-51
• 1.1 血小板是炎癥的靶細(xì)胞47-48
• 1.2 血小板也可作為效應(yīng)細(xì)胞促進(jìn)炎癥反應(yīng)進(jìn)程48-49
• 1.3 血小板在心血管疾病中的作用49-50
• 1.4 PI3Kγ在血小板中的作用50-51
• 2 材料51-53
• 2.1 主要儀器51
• 2.2 試劑及材料51-53
• 2.3 實(shí)驗(yàn)動物53
• 3 方法53-61
• 3.1 實(shí)驗(yàn)動物分組53
• 3.2 血小板分離、計(jì)數(shù)及體外活化53-54
• 3.3 頸動脈部分結(jié)扎術(shù)模型建立54-55
• 3.4 病理取材55
• 3.5 Verhoeff's染色(彈力纖維染色)55
• 3.6 免疫組化及免疫熒光染色55
• 3.7 DHE染色55
• 3.8 明膠酶譜法檢測血管MMP-9活性55-57
• 3.9 RT-PCR57
• 3.10 流式細(xì)胞術(shù)57-58
• 3.11 Western blot58-60
• 3.12 免疫共沉淀60
• 3.13 內(nèi)皮血小板粘附試驗(yàn)60-61
• 3.14 統(tǒng)計(jì)分析61
• 4 結(jié)果61-76
• 4.1 血小板PI3Kγ在血小板介導(dǎo)的頸動脈部分結(jié)扎術(shù)后內(nèi)膜中膜增厚血管重塑中起著重要的作用61-63
• 4.2 血小板PI3Kγ在血小板介導(dǎo)的血管損傷后白細(xì)胞浸潤中起著重要的作用63-64
• 4.3 血小板PI3Kγ在血小板介導(dǎo)的損傷血管局部炎癥介質(zhì)過表達(dá)過程中起著重要的作用64-65
• 4.4 血小板PI3Kγ介導(dǎo)活化血小板導(dǎo)致的損傷血管局部MMP-9活性增強(qiáng)65-66
• 4.5 血小板PI3Kγ在血管損傷后局部ROS的產(chǎn)生中起著重要作用66-67
• 4.6 血小板PI3Kγ介導(dǎo)ADP誘導(dǎo)的血小板激活67-68
• 4.7 血小板PI3Kγ通過Akt-以及p38 MAPK途徑介導(dǎo)ADP誘導(dǎo)的血小板激活68-70
• 4.8 血小板PI3Kγ通過調(diào)節(jié)NADPH酶活性介導(dǎo)ADP誘導(dǎo)的血小板ROS的生成70-72
• 4.9 血小板PI3Kγ缺失后血小板-白細(xì)胞聚集明顯減少72-74
• 4.10 血小板PI3Kγ缺失減少了血小板-內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用74-76
• 5 討論76-79
• 小結(jié)79-80
• 結(jié)論80-81
• 展望81-82
• 綜述 血小板在動脈粥樣硬化中的炎性作用82-88
• 一、血小板是一種炎癥細(xì)胞83-85
• 二、血小板與血管內(nèi)膜的相互作用85
• 三、血小板與白細(xì)胞的相互作用85-86
• 四、血小板與內(nèi)皮祖細(xì)胞的相互作用86-88
• 參考文獻(xiàn)88-103
• 常用縮略詞對照表103-106
• 致謝106-107
• 攻讀博士學(xué)位期間的科研成果107

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