發(fā)布時間：2017-05-29 07:10

  本文關(guān)鍵詞：氯化兩面針堿及Wnt通路受體FZD7在CML中的作用及機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分c-Myc-microRNAs軸在氯化兩面針堿誘導(dǎo)的CML細胞紅系分化及凋亡中的作用及機制研究研究背景：慢性髓性白血病(Chronic myeloid leukemia, CML)是一種起源于多能造血干細胞的惡性克隆性疾病,具有特征性的t(9；22)(q34；q11)染色體易位(Ph染色體)并形成BCR-ABL融合基因。該融合基因編碼的蛋白具有極強的酪氨酸激酶活性,可抑制正常造血細胞分化和凋亡,最終導(dǎo)致白血病的發(fā)生。近年來,酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors, TKIs)的應(yīng)用較大的改善了CML的預(yù)后,但目前臨床上TKIs的耐藥問題日益嚴重。因此,尋找新的治療方法仍是CML研究的主要方向之一。隨著腫瘤發(fā)病學研究的深入,誘導(dǎo)分化療法成為腫瘤治療的新思路。全反式維甲酸在人急性早幼粒白血病的誘導(dǎo)分化治療中已獲得確切療效,而目前慢性髓性白血病誘導(dǎo)分化治療的研究還處于起步階段,因此,研究CML細胞分化阻滯機制并尋找新的分化誘導(dǎo)劑對于CML的治療具有重要意義。原癌基因c-Myc在細胞增殖、凋亡和分化等命運決定中起重要作用,其突變或異常表達與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。研究顯示,c-Myc在CML急變期異常高表達并與不良預(yù)后相關(guān)。BCR-ABL可通過Jak2或MAPK信號通路上調(diào)c-Myc,過表達的c-Myc可拮抗伊馬替尼(Imatinib, IM)誘導(dǎo)的CML細胞紅系分化及凋亡,降低IM的藥物敏感性。另有研究報道,c-Myc可影響多種microRNAs的表達,并通過他們發(fā)揮生物學效應(yīng)。因此,靶向c-Myc-microRNAs軸可能成為CML誘導(dǎo)分化治療的有效手段。氯化兩面針堿(nitidine chloride, NC)是從廣西特有藥用植物兩面針的根莖中分離的生物堿類。近年來研究發(fā)現(xiàn)NC可有效抑制乳腺癌和腎癌細胞的侵襲能力；在肝癌、胃癌、腎癌和鼻咽癌中,NC可以通過抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡發(fā)揮其抗腫瘤效應(yīng)。然而,NC在CML中的作用尚未見報道。研究目的：研究NC對K562細胞及原代CML細胞分化和凋亡的影響,闡明NC對c-Myc及c-Myc激活的microRNAs的影響,探討NC作為治療CML藥物的可能性。研究方法：1.NC對K562細胞紅系分化的影響：用不同濃度NC處理K562細胞后,應(yīng)用聯(lián)苯胺染色法檢測細胞的分化率；流式細胞術(shù)檢測紅系分化抗原CD71和CD235a; Real-time RT-PCR檢測紅系分化指標；Western blot方法檢測globin y蛋白水平。2.NC對K562細胞凋亡的影響：用不同濃度NC處理K562細胞24或48小時后,MTT法檢測細胞存活；Annexin V/PI雙染后流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡；Western blot檢測Caspase3和Parp-1等凋亡相關(guān)蛋白。3. C-Myc在NC誘導(dǎo)的紅系分化及凋亡中的作用：首先應(yīng)用Western blot和real-time RT-PCR檢測NC對c-Myc蛋白和mRNA水平的影響；應(yīng)用CHX chase實驗檢測NC對c-Myc蛋白降解的影響；構(gòu)建高表達或敲除c-Myc的細胞系并用NC處理48小時,Western blot檢測紅系分化指標globin γ,流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡。4.NC對c-Myc降解的影響極其作用機制：只有Thr58磷酸化的c-Myc才能被E3泛素連接酶SCFFbW7識別并通過泛素-蛋白酶體降解,因此我們應(yīng)用Western blot檢測NC對c-Myc Thr58磷酸化水平的影響；在K562細胞中,轉(zhuǎn)染野生型及T58A突變的c-Myc質(zhì)粒并用NC處理后,CHX chase實驗檢測NC對野生型c-Myc及T58A點突變體降解的影響。5. C-Myc激活的microRNAs在NC誘導(dǎo)的紅系分化及凋亡中的作用：應(yīng)用Real-time RT-PCR方法檢測NC處理或下調(diào)c-Myc對K562細胞中c-Myc相關(guān)microRNAs表達的影響；Western blot檢測NC對miR-17/20下游靶基因P21的影響；Western blot檢測miR-17/20對紅系分化蛋白globin γ水平的影響,明確miR-17/20在NC誘導(dǎo)的紅系分化中的作用；流式細胞術(shù)檢測miR-17/20對NC誘導(dǎo)的凋亡的影響。6.NC對K562、K562/G01的IM敏感性的影響：用NC、IM或NC+IM處理K562細胞后,軟瓊脂集落形成實驗觀察NC、IM或二者聯(lián)合作用對K562集落形成能力的影響；應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測NC、IM或二者聯(lián)合作用對K562和K562/G01凋亡的影響。7.NC對原代CML細胞的影響：收集5例CML患者骨髓,分離單個核細胞,其中病例1-3為IM敏感型,4和5為IM耐藥型。流式細胞術(shù)檢測NC對原代CML細胞的凋亡影響；Western blot檢測NC對原代CML細胞中c-Myc蛋白表達的影響；Real-time RT-PCR檢測NC對原代CML細胞中miR-17/20表達的影響。研究結(jié)果：1.NC對K562細胞紅系分化的影響：應(yīng)用聯(lián)苯胺染色實驗顯示NC可明顯增加K562細胞的分化率,且其誘導(dǎo)分化效應(yīng)具有時間、劑量反應(yīng)關(guān)系。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示NC可明顯增加K562細胞表面紅系分化抗原CD71、CD235a。Real-time RT-PCR結(jié)果顯示NC可明顯增加globin α、globin ε、globin γ、CD235a、AHSP等紅系分化指標的mRNA水平。Western blot結(jié)果顯示NC可明顯增加K56細胞中g(shù)lobin y蛋白表達水平。2.NC對K562細胞凋亡的影響：MTT結(jié)果顯示NC可抑制K562的生長。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示NC顯著增加K562細胞的凋亡率,進一步研究發(fā)現(xiàn)NC影響K562細胞中Caspase-3、Parp-1等凋亡相關(guān)蛋白。3. c-Myc在NC誘導(dǎo)的K562紅系分化及凋亡中的作用：原癌基因c-Myc通路在白血病細胞增殖、分化及凋亡等多種生物學行為中起重要作用,我們發(fā)現(xiàn)NC可下調(diào)c-Myc蛋白的表達,且具有時間、劑量反應(yīng)關(guān)系。在K562細胞中,過表達c-Myc可逆轉(zhuǎn)NC誘導(dǎo)的globin y上調(diào),下調(diào)c-Myc可增強NC誘導(dǎo)的globin y上調(diào)；過表達c-Myc可逆轉(zhuǎn)NC誘導(dǎo)的凋亡,下調(diào)c-Myc可增強NC誘導(dǎo)的凋亡。以上結(jié)果說明NC誘導(dǎo)的K562紅系分化及凋亡是通過下調(diào)c-Myc起作用的。4.NC對c-Myc降解的影響極其作用機制：NC對c-Myc mRNA的影響不具有顯著性,由此推測NC對c-Myc的調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。應(yīng)用CHX chase實驗顯示NC可加快c-Myc蛋白降解。進一步研究發(fā)現(xiàn)NC可升高Thr58磷酸化的c-Myc與總c-Myc的比值,NC可加速野生型c-Myc的降解,而對T58A的c-Myc蛋白降解的影響不顯著。以上結(jié)果說明,NC通過上調(diào)T58磷酸化加速c-Myc的降解。5.c-Myc激活的microRNAs在NC誘導(dǎo)的紅系分化及凋亡中的作用：應(yīng)用Real-time RT-PCR檢測顯示NC處理或下調(diào)c-Myc可抑制K562細胞中miR-17、miR-20a、miR-30a、miR-221、miR-222和miR-378的表達。Western blot顯示NC可顯著上調(diào)miR-17/20下游靶基因P21。進一步發(fā)現(xiàn),miR-17和miR-20a上調(diào)可逆轉(zhuǎn)NC誘導(dǎo)的globin γ水平升高及細胞凋亡,由此可見,NC誘導(dǎo)的K562紅系分化及凋亡是通過下調(diào)miR-17、miR-20a起作用的。6.NC對K562、K562/G01對伊馬替尼的敏感性的影響：NC、IM或聯(lián)合(NC+IM)均可下調(diào)K562集落形成能力,且NC可增加IM的效力。K562/G01為伊馬替尼不敏感,但NC對仍有殺傷作用,且NC可增加伊馬替尼誘導(dǎo)的K562/G01細胞凋亡。7.NC對原代CML細胞的影響：NC可誘導(dǎo)原代CML細胞凋亡,并增加其對伊馬替尼敏感性,更重要的是,NC對伊馬替尼耐藥的細胞仍具有殺傷作。NC可下調(diào)原代CML細胞中c-Myc蛋白及miR-17和miR-20a的表達。結(jié)論：1.NC可誘導(dǎo)K562細胞紅系分化和凋亡；2.NC通過增加Thr58磷酸化水平加快c-Myc的降解,并可下調(diào)c-Myc激活的miRNAs:3.NC對伊馬替尼耐藥的K562/G01細胞及原代CML細胞仍有殺傷作用；4.NC可能成為一個新的抗白血病藥物,為CML的治療提供新的方案及實驗室基礎(chǔ)。第二部分Wnt通路分子FZD7在CML中的表達及其在骨髓基質(zhì)細胞介導(dǎo)耐藥中作用研究背景：伊馬替尼(Imatinib, IM)是一種酪氨酸激酶抑制劑,能選擇性抑制BCR-ABL的酪氨酸激酶活性,誘導(dǎo)大多數(shù)慢性期慢性髓性白血病(Chronic myeloid leukemia, CML)患者完全緩解。然而,隨著IM在臨床上的廣泛應(yīng)用和時間的推移,其耐藥現(xiàn)象日益明顯,復(fù)發(fā)率逐漸增高,因此研究CML耐藥機制對于CML的治療具有重要意義。越來越多的證據(jù)表明,血液系統(tǒng)腫瘤與其所處的骨髓微環(huán)境之間的相互作用在腫瘤耐藥中起重要的作用。骨髓微環(huán)境的諸多成分中,骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)是參與腫瘤生存及耐藥的最重要因素。Gordon等研究表明BMSCs可通過直接接觸及釋放IL-6等可溶性細胞因子,減弱c-Kit抑制劑誘導(dǎo)的白血病細胞凋亡。Moshaver等同樣發(fā)現(xiàn),BMSCs可調(diào)節(jié)慢性淋巴細胞白血病(CLL)細胞中癌基因TCL1的表達,并激活TCL1相關(guān)的miRNAs,降低CLL細胞的藥物敏感性。以上研究提示,靶向BMSCs與白血病細胞之間的相互作用可成為克服白血病細胞耐藥的有力手段。白血病細胞與BMSCs之間的相互作用涉及多重調(diào)控機制和信號通路,其中Wnt/β-catenin信號通路是發(fā)現(xiàn)較早、研究較多的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一。Hu等研究發(fā)現(xiàn),BMSCs可釋放galectin-3分子,激活A(yù)kt信號通路使GSK3β失活,抑制β-catenin的降解,從而介導(dǎo)AML細胞耐藥。另有研究顯示,BMSCs可通過直接接觸激活CML干細胞中的Wnt/β-catenin信號通路,維持CML干細胞的存活。由此可見, BMSCs可激活CML細胞中的Wnt信號通路,然而Wnt/p-catenin在CML細胞中激活的原因及調(diào)控機制目前尚不明確。FZD7屬于frizzled受體家族,FZD7在肝癌、胃癌和乳腺癌等多種實體瘤中表達異常增加,且FZD7基因的表達水平與腫瘤的惡性程度和預(yù)后密切相關(guān)。此外,有研究報道,FZD7可調(diào)節(jié)耐藥基因MDR1的表達參與腫瘤細胞耐藥。我們發(fā)現(xiàn),將BMSCs與CML細胞共培養(yǎng)后,CML細胞中FZD7表達增高。由此推測FZD7上調(diào)可能是共培養(yǎng)后Wnt/β-catenin信號通路激活的原因,靶向FZD7可切斷BMSCs與白血病細胞之間的相互作用,或可成為克服CML耐藥的有力手段。研究目的：研究FZD7在CML患者中的表達水平；探討FZD7異常表達對白血病細胞藥物敏感性及藥物誘導(dǎo)凋亡的影響；闡明FZD7在BMSCs介導(dǎo)的IM耐藥中的作用,為逆轉(zhuǎn)IM多藥耐藥提供新的靶點。研究方法：1.收集16例初診未經(jīng)TKIs治療的CML患者及6例正常對照骨髓標本,磁珠分選CD34+細胞,Real-time RT-PCR檢測CD34+細胞中10種FZD分子的表達情況。16例CML患者根據(jù)治療后情況,分為伊馬替尼敏感(imatinib sensitive, IMS)組(9例)和伊馬替尼抵抗(imatinib resistant, IMR)組(7例),分析兩組間FZD7分子的表達差異。2.我們收集了3例CML(C1、C2和C3)及2例正常對照(N1和N2)骨髓標本,體外培養(yǎng)BMSCs細胞,并將其與CML細胞共培養(yǎng)后,Western blot方法檢測CML細胞中FZD7、β-catenin口MDR1的等Wnt通路分子的蛋白水平改變；Real-time RT-PCR檢測CML細胞中FZD7及Wnt下游基因MDR1、c-Myc、 Survivin、CD44和Trib2的mRNA水平的改變。3.包裝攜帶FZD7 shRNA的慢病毒,感染K562細胞72小時后熒光顯微鏡觀測感染效率,用Real-time RT-PCR和Western blot方法檢測病毒感染后FZD7下調(diào)情況。4.細胞增殖檢測：MTT方法檢測FZD7下調(diào)對細胞的增殖的影響；PI染色后利用流式細胞儀檢測FZD7對細胞周期的改變。5.IM的敏感性檢測：將感染后的細胞接種于細胞培養(yǎng)板中,加入不同濃度的IM,培養(yǎng)48或72小時,MTT方法檢測細胞對IM的敏感性,計算伊馬替尼的半數(shù)抑制濃度(IC50)；AnnexinV/PI雙染后利用流式細胞儀檢測細胞凋亡率的變化。6.將感染了ShFZD7-2或ShCtrl慢病毒的K562細胞與不同來源的BMSCs共培養(yǎng)48小時后,采用標準洗滌方法收集共培養(yǎng)后的K562細胞,加入伊馬替尼(0.2μM)處理48小時,應(yīng)用MTT檢測細胞存活率,流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況。7.用ShFZD7-2或ShCtrl慢病毒感染K562細胞72小時后,與不同來源的BMSCs共培養(yǎng)48小時后,采用標準洗滌方法收集共培養(yǎng)后的K562細胞,應(yīng)用Western blot和Real-time RT-PCR檢測FZD7及Wnt下游基因的表達情況。研究結(jié)果：1.CML患者中FZD7表達情況：相對于正常CD34+細胞,CML CD34+細胞中FZD7表達升高。Real-time RT-PCR結(jié)果顯示伊馬替尼抵抗組(IMR,7例)FZD7表達水平明顯高于伊馬替尼敏感組(IMS,9例)。Western blot檢測3例正常對照骨髓、3例IMS和3例IMR的CD34+細胞中FZD7表達水平,IMR CD34+細胞中FZD7蛋白水平明顯高于IMS組,與Real-time RT-PCR結(jié)果一致。2. BMSCs與CML細胞系K562及原代CML細胞直接共培養(yǎng)后,K562及原代CML細胞中FZD7、β-catenin和MDR1的蛋白表達水平較單獨培養(yǎng)組明顯升高,并且CML來源的BMSCs較正常對照來源的BMSCs對CML細胞中Wnt/β-catenin信號激活更為顯著。此外,Real-time RT-PCR結(jié)果顯示BMSCs與CML細胞系K562共培養(yǎng)后,CML細胞中FZD7及Wnt下游基因MDR1、c-Myc、Survivin、CD44和Trib2的mRNA表達水平較單獨培養(yǎng)組亦明顯增高。3.包裝FZD7 shRNA慢病毒并感染K562細胞72小時后,熒光顯微鏡觀察感染效率達95%以上,Real-time RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示攜帶FZD7 shRNA的慢病毒可有效下調(diào)FZD7表達。4.FZD7下調(diào)抑制CML增殖：MTT結(jié)果顯示,FZD7干擾組的增殖速率顯著低于對照組。流式細胞術(shù)檢測細胞周期結(jié)果顯示,干擾組G0/G1期細胞比例明顯高于陰性對照組。利用Western blot檢測細胞周期蛋白表達發(fā)現(xiàn),阻斷FZD7可升高CML細胞中P21、P27并降低Cyclin D1和CDK4的表達水平。5.FZD7下調(diào)增加CML細胞對伊馬替尼的敏感性：MTT檢測發(fā)現(xiàn),干擾FZD7表達后K562細胞對IM的敏感性的增加。流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率結(jié)果顯示,下調(diào)FZD7后IM的誘導(dǎo)凋亡率顯著升高。Western blot結(jié)果表明FZD7干擾組caspase 3及PARP-1的活性片段表達上調(diào)。6.FZD7下調(diào)能減少BMSCs誘導(dǎo)的伊馬替尼耐藥：MTT結(jié)果顯示,FZD7下調(diào)顯著抑制BMSCs誘導(dǎo)的IM耐藥。流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡發(fā)現(xiàn),在共培養(yǎng)的K562細胞中下調(diào)FZD7后IM的誘導(dǎo)凋亡率顯著升高。7.FZD7下調(diào)能減少BMSCs誘導(dǎo)的Wnt/β-catenin信號通路激活：Western blot結(jié)果顯示,FZD7下調(diào)能有效逆轉(zhuǎn)BMSCs誘導(dǎo)的FZD7和MDR1蛋白上調(diào)；Real-time RT-PCR檢測結(jié)果顯示,FZD7下調(diào)能抑制BMSCs介導(dǎo)的MDR1和CD44 mRNA水平升高。由此可見,FZD7高表達可能是共培養(yǎng)后Wnt/p-catenin信號通路激活的原因。結(jié)論：1.相對于正常CD34+細胞,CML CD34+細胞中FZD7表達上升；IM抵抗型CML患者FZD7表達水平顯著高于IM敏感型。2.CML細胞與BMSCs共培養(yǎng)能上調(diào)CML細胞中FZD7的表達,激活Wnt/p-catenin信號通路。3.FZD7下調(diào)抑制CML細胞增殖和集落形成能力,增強對IM的敏感性。4.靶向FZD7可有效阻斷BMSCs與CML細胞之間的聯(lián)系,逆轉(zhuǎn)BMSCs介導(dǎo)CML耐藥。
【關(guān)鍵詞】：氯化兩面針堿 慢性髓性白血病 紅系分化 c-Myc microRNAs FZD7 Wnt信號通路 CML BMSCs 藥物敏感性
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R733.72
【目錄】：

• 中文摘要6-14
• ABSTRACT14-23
• 符號說明23-25
• 第一部分 c-Myc-microRNAs軸在氯化兩面針堿誘導(dǎo)的CML細胞紅系分化及凋亡中的作用及機制研究25-68
• 前言25-27
• 材料與方法27-42
• 結(jié)果42-47
• 討論47-49
• 結(jié)論49-50
• 參考文獻50-59
• 附圖59-66
• 附表66-68
• 第二部分 Wnt通路分子FZD7在CML中的表達及其在骨髓基質(zhì)細胞介導(dǎo)耐藥中作用68-97
• 前言68-69
• 材料與方法69-72
• 結(jié)果72-76
• 討論76-80
• 結(jié)論80
• 參考文獻80-89
• 附圖89-95
• 附表95-97
• 致謝97-98
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文98-99
• 學位論文評閱及答辯情況表99-100
• 英文論文1100-128
• 英文論文2128-154

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本文編號：404406