本文關(guān)鍵詞：缺氧肝癌細胞中HIF-1和NF-κB的相互作用及其分子機制的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一。肝細胞癌主要由慢性肝臟損傷引起的肝硬化發(fā)展而來,肝臟纖維化對血管具有破壞作用,腫瘤細胞迅速增殖消耗大量氧氣,形成了肝癌局部的缺氧微環(huán)境。缺氧是肝細胞癌的主要特征之一,對于肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展起著重要的調(diào)控作用。HIF-1是細胞缺氧應答的主要反應因子,由氧分壓依賴的HIF-1α和非氧分壓依賴的HIF-1β組成。缺氧條件下,穩(wěn)定化的HIF-1α轉(zhuǎn)運到核內(nèi)并與HIF-1β結(jié)合形成異二聚體,該異二聚體通過結(jié)合到缺氧反應基因的啟動子,促進缺氧反應基因的轉(zhuǎn)錄,參與調(diào)控肝癌的血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移和化放療抵抗等行為。缺氧也會激活細胞內(nèi)的NF-κB信號通路。NF-κB是由不同的亞基p65(RelA)、RelB、c-Rel、NF-κB1(p105/p50)、NF-κB2(p100/p52)組成的一系列的二聚體轉(zhuǎn)錄因子,在調(diào)節(jié)細胞生存和免疫反應中發(fā)揮重要的作用。已有研究發(fā)現(xiàn)肝癌細胞中活化的NF-κB促進了炎性細胞因子(如IL-6、IL-1β)的表達,從而形成促癌的炎癥微環(huán)境,參與肝癌的發(fā)生和發(fā)展。HIF-1和NF-κB的相互作用可能在維持細胞的缺氧應答中起著重要作用。以往的文獻報道,NF-κB亞基p50和p65可以促進HIF-1α的轉(zhuǎn)錄;而HIF-1α也參與調(diào)節(jié)NF-κB的活化。但是,上述報道并沒有全面地、動態(tài)地研究缺氧過程中HIF-1和NF-κB的相互作用。更好地了解缺氧肝癌細胞中HIF-1和NF-κB的相互作用及其分子機制,可能為肝癌的防治提供新的思路和策略。目的:研究缺氧條件下肝癌細胞中HIF-1和NF-κB的相互作用,并且闡明其中的分子機制。材料與方法:1、人肝癌細胞株Hep G2和Huh7經(jīng)體外缺氧(1%O2)處理0-24h,qPCR和Western Blot檢測HIF-1亞基HIF-1α、HIF-1β和NF-κB亞基p50、p65、c-Rel的表達2、vista軟件預測hif-1α啟動子是否存在p50、p65、c-rel亞基的結(jié)合位點,并且經(jīng)染色質(zhì)免疫共沉淀實驗(chip)在hepg2和huh7細胞中驗證。分別使用shnc、shp65、shc-rel慢病毒和mock、p65、c-rel過表達慢病毒轉(zhuǎn)染hepg2細胞,轉(zhuǎn)染的細胞經(jīng)缺氧處理4h和24h,qpcr和westernblot檢測hif-1α的表達。3、targetscan6.2預測hif1a3’-utr上游的mirna,mirgen2.0預測c-rel下游mirna,重疊預測結(jié)果得到候選mirna。qpcr檢測缺氧肝癌細胞中候選mirna的時序表達。轉(zhuǎn)染shnc、shc-rel的hepg2細胞經(jīng)缺氧處理0h、4h、24h,qpcr檢測候選mirna的表達。過表達候選mirna的細胞株經(jīng)缺氧處理4h,qpcr、westernblot檢測hif-1α的表達。熒光素酶實驗驗證候選mirna與hif1a3’utr結(jié)合能力。4、westernblot檢測缺氧肝癌細胞中mirna合成酶dicer1的表達,使用shnc、shdicer1慢病毒轉(zhuǎn)染hepg2細胞,轉(zhuǎn)染的細胞經(jīng)缺氧處理0h、4h、24h,qpcr檢測mir-93和mir-199a-5p的表達。5、轉(zhuǎn)染shnc和shdicer1的hepg2細胞經(jīng)缺氧處理0h、4h、24h,qpcr和westernblot檢測hif-1α的表達。6、vista軟件預測dicer1的啟動子是否存在hif-1、p50、p65和c-rel的結(jié)合位點,并且經(jīng)染色質(zhì)免疫共沉淀實驗(chip)在hepg2和huh7細胞中驗證;vista軟件預測p50、p65、c-rel啟動子是否存在hif-1的結(jié)合位點。使用shnc和shhif1a慢病毒轉(zhuǎn)染hepg2細胞,轉(zhuǎn)染的細胞經(jīng)缺氧處理0h、4h、24h,qpcr檢測p50、p65、c-rel和dicer1、mir-93、mir-199a-5p的mrna表達,westernblot檢測p50、p65、c-rel和dicer1的蛋白表達。結(jié)果:1、肝癌細胞中nf-κb亞基p50、p65、c-rel的mrna和蛋白水平隨著缺氧時間延長而升高(0-24h);hif-1α的mrna水平隨著缺氧時間延長而升高,蛋白水平在短期缺氧時(0-4h)升高而持續(xù)缺氧時(4-24h)降低。(1)hepg2和huh7細胞中hif-1亞基hif-1α和nf-κb亞基p50、p65、c-rel的mrna水平隨缺氧時間(0-24h)的延長而增加,而hif-1亞基hif-1β的mrna水平則基本不變。(2)hepg2和huh7細胞中p50、p65、c-rel的蛋白水平隨缺氧時間的延長而增加(0-24h),hif-1β的蛋白水平基本保持不變,而hif-1α的蛋白水平在短期缺氧時(0-4h)增加,在持續(xù)缺氧時(4-24h)降低。2、nf-κb亞基p50和p65與hif-1α的啟動子直接結(jié)合并促進hif-1α的表達;而持續(xù)缺氧時(4-24h)c-rel間接地抑制hif-1α的表達。(1)hif1a啟動子上沒有c-rel的結(jié)合位點,但是有p50和p65的結(jié)合位點,其中s1(chr14:62162387-62162397,序列:aggggtttccc)是p50和p65共有的結(jié)合位點,而s2(chr14:62162718-62162728,序列:ccgggctcccc)是p65獨有的結(jié)合位點。(2)缺氧4h的hepg2細胞中,p65下調(diào)引起hif-1α的mrna和蛋白水平下降,而c-rel下調(diào)對hif-1α的mrna和蛋白水平無影響;缺氧24h的hepg2細胞中,p65下調(diào)導致hif-1α的mrna和蛋白水平下降,而c-rel下調(diào)對hif-1α的mrna水平無影響,卻引起hif-1α的蛋白水平增加。(3)缺氧4h和24h的hepg2細胞中,p65過表達引起hif-1α的mrna和蛋白水平升高,而c-rel過表達引起hif-1α的mrna和蛋白水平降低。3、nf-κb亞基c-rel下游的mir-199a-5p和mir-93直接結(jié)合3’utr抑制hif-1α的表達。(1)hif1a3’-utr上游和c-rel下游的重疊的6個候選mirna為:mir-199a-5p,mir-18a,mir-20a,mir-93,mir-17和mir-106b。hepg2細胞中mir-17的表達水平隨著缺氧時間延長而穩(wěn)定升高,mir-199a-5p、mir-93和mir-106b的表達在短期缺氧時(0-4h)減少,而在持續(xù)缺氧時(4-24h)增加。mir-20a的表達在缺氧0-2h減少,在缺氧3-24h增加。mir-18a的表達在缺氧2-8h和24h減少,但是在缺氧12h增加。(2)常氧、缺氧4h、缺氧24h的hepg2細胞中,下調(diào)c-rel引起mir-199a-5p、mir-18a、mir-20a、mir-93、mir-17的表達下降,對mir-106b的表達無影響。(3)缺氧4h的hepg2細胞中,mir-93、mir-199a-5p過表達顯著減少了hif-1α的mrna和蛋白表達,mir-18a過表達減少了hif-1α的蛋白表達但不影響hif-1α的mrna表達,過表達mir-17對hif-1α的mrna和蛋白水平無影響。(4)mir-93、mir-199a-5p可顯著減少hif1a3’utr的熒光素酶活性,而mir-18a、mir-17對hif1a3’utr的熒光素酶活性沒有影響。4、肝癌細胞中mirna合成酶dicer1的表達在短期缺氧時(0-4h)下降,而在持續(xù)缺氧時(4-24h)上升;dicer1正向調(diào)節(jié)mir-93和mir-199a-5p的表達。(1)hepg2細胞中dicer1的蛋白水平在短期缺氧時(0-4h)下降,而在持續(xù)缺氧時(4-24h)顯著升高。(2)常氧和缺氧24h的hepg2細胞中,dicer1下調(diào)引起mir-93和mir-199a-5p的表達顯著下降。5、Dicer1負向調(diào)節(jié)HIF-1α的表達,且該調(diào)節(jié)機制主要在持續(xù)缺氧時(4-24h)起作用。缺氧0h和4h的Hep G2細胞中,Dicer1下調(diào)對HIF-1α的mRNA和蛋白水平無影響;缺氧24h的Hep G2細胞中,Dicer1下調(diào)引起HIF-1α的mRNA和蛋白水平顯著升高。6、缺氧肝癌細胞中HIF-1結(jié)合到p50、p65、c-Rel和Dicer1的啟動子促進其表達,進而引起miR-93和miR-199a-5p表達上調(diào)。(1)Dicer1的啟動子上不存在p50、p65、c-Rel結(jié)合位點,但是存在HIF-1的結(jié)合位點,該結(jié)合位點位于Dicer1啟動子的chr14:95623615-95623634(序列:CGGCGCGCGCGTCACAGCCC)位點。(2)p50、p65、c-Rel啟動子上存在HIF-1結(jié)合位點,p50啟動子存在的HIF-1α結(jié)合位點為Chr4:103423385-103423404(序列:GCAGAAGTGCTTGTCAGTCC),p65啟動子存在的HIF-1α結(jié)合位點為Chr11:65430400-65430419(序列:CCGCCGTCGCGTCACTGCCC),c-Rel啟動子上存在的HIF-1α結(jié)合位點為Chr2:61109146-61109165(序列:CAGGGTTTGCGTGCAGAATC).(3)缺氧4h和24h的HepG2細胞中,HIF-1α下調(diào)引起p50、p65、c-Rel和Dicer1、miR-93、miR-199a-5p的mRNA水平降低,同樣引起p50、p65、c-Rel和Dicer1的蛋白水平顯著下降。結(jié)論:1、短期缺氧時(0-4h)HIF-1的急劇增加促進了NF-κB亞基p50、p65、c-Rel和mi RNA合成酶Dicer1的表達,p50和p65進一步促進HIF-1α的轉(zhuǎn)錄。2、短期缺氧時(0-4h)上調(diào)的c-Rel和Dicer1促進下游mi R-199a-5p和mi R-93表達,mi R-199a-5p和mi R-93在持續(xù)缺氧時(4-24h)靶向結(jié)合到HIF1A的3’UTR從而在轉(zhuǎn)錄后水平抑制HIF-1α的表達。
【關(guān)鍵詞】：缺氧 肝細胞肝癌 HIF-1 NF-κB Dicer1 mi RNA
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• Abstract7-12
• 摘要12-16
• 第一章 前言16-18
• 第二章 短期缺氧和持續(xù)缺氧的肝癌細胞中HIF-1 和NF-κB的不同表達模式18-30
• 2.1 材料與方法18-25
• 2.2 結(jié)果25-28
• 2.3 討論28-30
• 第三章 肝癌細胞中NF-κB在短期和持續(xù)缺氧時對HIF-1α 的雙向調(diào)控作用30-47
• 3.1 材料與方法30-39
• 3.2 結(jié)果39-45
• 3.3 討論45-47
• 第四章 缺氧肝癌細胞中NF-κB亞基c-Rel下游的miRNA抑制HIF-1α 的表達47-64
• 4.1 材料與方法47-58
• 4.2 結(jié)果58-63
• 4.3 討論63-64
• 第五章 缺氧通過下調(diào)Dicer1抑制miR-93和miR-199a-5p的表達64-74
• 5.1 材料與方法64-70
• 5.2 結(jié)果70-73
• 5.3 討論73-74
• 第六章 Dicer1在持續(xù)缺氧過程中促進HIF-1α 降解74-82
• 6.1 材料與方法74-79
• 6.2 結(jié)果79-81
• 6.3 討論81-82
• 第七章 缺氧條件下HIF-1 上調(diào)Dicer1和miR-93/199a-5p表達82-95
• 7.1 材料與方法82-91
• 7.2 結(jié)果91-94
• 7.3 討論94-95
• 全文討論95-97
• 全文結(jié)論97-98
• 參考文獻98-101
• 文獻綜述 缺氧誘導因子-1（HIF-1）對腫瘤的調(diào)控作用及其靶向治療101-119
• 參考文獻110-119
• 研究生期間發(fā)表的文章119-120
• 致謝120

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