本文關鍵詞：Genistein及其改構體KBU2046抑制結腸癌轉移的作用和分子機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：【目的】已有研究提示染料木黃酮Genistein可有效抑制前列腺癌的生長和轉移,但隨著劑量增加會產(chǎn)生毒性和雌激素樣副作用。為保留其抗腫瘤活性而削減其毒副作用,前期已在Genistein基礎上進行改構得到小分子化合物KBU2046。本研究旨在探討Genistein及KBU2046對結腸癌轉移的作用及相關分子機制�！痉椒ā勘菊n題應用的實驗方法具體包括,采用CCK8試劑盒檢測藥物對細胞增殖活性的影響;通過平板克隆形成實驗檢測藥物對腫瘤細胞克隆形成能力的影響;通過劃痕、transwell侵襲/遷移、高內(nèi)涵運動試驗觀察藥物對細胞侵襲、運動能力的影響;建立結腸癌原位種植模型,結合小動物活體成像技術評估藥物對體內(nèi)腫瘤生長和轉移的作用;通過免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)染色檢測原位腫瘤細胞中增殖標志物Ki67和血管內(nèi)皮標志物CD34的表達以評估腫瘤細胞增殖能力和瘤內(nèi)血管形成能力;采用q PCR array篩選藥物影響的轉移相關基因并通過western blot、q PCR以及IHC染色分別在細胞及動物原位瘤組織中進行驗證;在結腸癌患者腫瘤組織中通過IHC分析所得分子和臨床指標的相關性;采用Western blot研究藥物對細胞內(nèi)蛋白激酶磷酸化水平的影響�！窘Y果】目前已取得的主要結果小結如下:在結腸癌細胞系和正常腸粘膜上皮細胞中,10μM以上Genistein可抑制細胞增殖活性和克隆形成能力;10μM Genistein可在不產(chǎn)生細胞毒性的前提下抑制結腸癌細胞的遷移、侵襲和運動能力;KBU2046在劑量高達50μM時仍不對結腸正常細胞或癌細胞產(chǎn)生明顯毒性;10μM KBU2046可以有效抑制結腸癌細胞的遷移、侵襲和運動能力;在裸鼠原位結腸癌種植模型中,Genistein和KBU2046可有效抑制人結腸癌細胞在裸鼠體內(nèi)的肝/肺轉移,而對腫瘤生長并無明顯抑制。為探討兩種藥物抑制結腸癌轉移的分子機制,采用q PCR array對轉移相關基因進行了篩選,經(jīng)體內(nèi)、外驗證,發(fā)現(xiàn)Genistein和KBU2046均可抑制FLT4和MMP2的表達。進一步研究還提示結腸癌患者腫瘤組織中FLT4表達與臨床分期、淋巴結轉移相關,其中高表達FLT4提示預后較差。通過檢測結腸癌細胞中經(jīng)藥物處理后蛋白激酶磷酸化水平的變化,發(fā)現(xiàn)在相同濃度條件下,Genistein可抑制Akt、Erk1/2、p38 MAPK磷酸化,而KBU2046僅抑制Erk1/2、p38 MAPK磷酸化,且效果較Genistein更強,二者對JNK磷酸化均無明顯抑制作用。具體結果如下:在正常腸上皮細胞HIEC、結腸癌細胞HCT116、HT29、SW620中檢測不同劑量Genistein對細胞活性的影響,發(fā)現(xiàn)Genistein在10μM以上會對結腸細胞產(chǎn)生殺傷活性。為專注于藥物對細胞運動的影響,本研究選取10μM進行以下相關實驗。通過transwell實驗、劃痕實驗和高內(nèi)涵運動實驗,發(fā)現(xiàn)10μM Genistein能有效抑制細胞的侵襲、遷移和運動能力。在明確Genistein可以在體外抑制結腸癌細胞侵襲、遷移和運動的前提下,采用相同的實驗方法檢測其改構體KBU2046對細胞活性和侵襲、遷移能力的影響,發(fā)現(xiàn)在與Genistein相同的濃度下,KBU2046的細胞毒性遠低于Genistein,但亦能有效抑制細胞的侵襲和遷移能力。為進一步觀察Genistein和KBU2046對結腸癌體內(nèi)轉移的影響,我們首先通過移植皮下瘤到裸鼠結腸的方法建立了結腸癌原位種植轉移模型,并通過小動物成像系統(tǒng)對穩(wěn)定表達luciferase的HCT116細胞進行定量評估原位腫瘤的大小和肝肺轉移的程度。結果發(fā)現(xiàn)Genistein和KBU2046在不影響原位腫瘤生長的條件下,均能在不同程度上抑制腫瘤的遠處轉移。對原位腫瘤組織中細胞增殖標志物Ki67和血管內(nèi)皮標志物CD34的表達進行分析,發(fā)現(xiàn)藥物并沒有顯著影響細胞增殖,但可以抑制腫瘤內(nèi)部新生血管形成,并表現(xiàn)出劑量依賴的趨勢。對原位腫瘤大小與肝/肺轉移程度進行相關分析沒有發(fā)現(xiàn)二者之間存在顯著相關性。為探討藥物的作用機制,我們通過PCR array對兩種藥物處理后細胞中轉移相關基因的變化進行了檢測,并通過q PCR、western blot進行驗證,結果發(fā)現(xiàn)Genistein和KBU2046均可在不同程度上抑制細胞中MMP2和FLT4的表達水平。進一步通過IHC染色發(fā)現(xiàn)在原位腫瘤組織中,Genistein和KBU2046處理后也能引起MMP2和FLT4表達下調(diào)。MMPs家族蛋白在腫瘤轉移尤其腫瘤侵襲中的研究較為詳盡,在多種腫瘤中都有MMP2與轉移相關的報道。而FLT4與腫瘤侵襲轉移的直接關系尚不明確。目前在多種腫瘤類型中有關其表達與臨床病理資料相關性的結果不盡相同。為進一步驗證FLT4在結腸癌患者中與腫瘤轉移的相關性,我們通過組織芯片在60例結腸癌患者的腫瘤組織及來自同一患者的正常組織中檢測了FLT4表達水平,結果發(fā)現(xiàn)FLT4在腫瘤組織中表達顯著高于正常組織,且其表達水平與惡性程度相關。通過Kaplan-Meier方法進行生存分析發(fā)現(xiàn)FLT4表達水平與患者生存成負相關。Genistein作為一種酪氨酸蛋白激酶抑制劑,可以抑制多種蛋白激酶的磷酸化水平。為比較KBU2046和Genistein作用機制的差異,我們對蛋白激酶磷酸化的改變進行了初步研究。結果發(fā)現(xiàn)Genistein和KBU2046對蛋白激酶磷酸化的影響不盡相同。具體來講,KBU2046對ERK1/2和p38磷酸化的抑制程度較Genistein顯著,但對Akt磷酸化沒有明顯抑制作用,二者對JNK磷酸化均沒有顯著影響。【結論】Genistein及其改構體KBU2046在體外細胞實驗和體內(nèi)結腸癌原位種植模型中均顯示了抑制結腸癌細胞轉移的活性;這一作用可能通過抑制轉移相關基因MMP2和FLT4表達實現(xiàn)。兩種藥物在對蛋白激酶活性的抑制上存在差異,提示KBU2046雖然通過保留Genistein的骨架結構而保留了其抑制腫瘤轉移的主要活性,但具體作用機制可能與母體有所不同,這將在以后的工作中進行深入研究。
【關鍵詞】：結腸癌轉移 Genistein KBU2046 裸鼠結腸癌原位種植模型 FLT4
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.35
【目錄】：

• 縮略語表7-8
• 中文摘要8-12
• 英文摘要12-17
• 前言17-19
• 文獻回顧19-37
• 第一部分 結腸癌轉移的分子機制及治療現(xiàn)狀19-27
• 第二部分 Genistein的研究現(xiàn)狀27-37
• 第一部分Genistein對結腸癌細胞生長和侵襲運動的影響37-51
• 1 材料37-38
• 1.1 細胞37
• 1.2 主要生化試劑37-38
• 1.3 主要儀器38
• 2 方法38-40
• 2.1 CCK8細胞生存率檢測38
• 2.2 CCK8細胞增殖檢測38
• 2.3 平板克隆形成實驗38-39
• 2.4 Transwell侵襲實驗39
• 2.5 Transwell遷移實驗39-40
• 2.6 劃痕實驗40
• 2.7 高內(nèi)涵運動實驗40
• 3 結果40-47
• 3.1 Genistein對結腸癌細胞活性的影響40-41
• 3.2 Genistein對結腸癌細胞增殖能力的影響41-42
• 3.3 Genistein對結腸癌細胞克隆形成能力的影響42-44
• 3.4 Genistein對結腸癌細胞侵襲能力的影響44
• 3.5 Genistein對結腸癌細胞遷移和運動能力的影響44-47
• 4 討論47-51
• 第二部分KBU2046對結腸癌細胞生長和侵襲運動的影響51-61
• 1 材料51-52
• 1.1 細胞51
• 1.2 主要生化試劑51
• 1.3 主要儀器51-52
• 2 方法52-54
• 2.1 CCK8細胞生存率檢測52
• 2.2 Transwell侵襲實驗52
• 2.3 Transwell遷移實驗52-53
• 2.4 劃痕實驗53
• 2.5 高內(nèi)涵運動實驗53-54
• 3 結果54-58
• 3.1 KBU2046對結腸癌細胞活性的影響54-55
• 3.2 KBU2046對結腸癌細胞侵襲能力的影響55
• 3.3 KBU2046對結腸癌細胞遷移和運動能力的影響55-58
• 4 討論58-61
• 第三部分Genistein和KBU2046對原位種植結腸癌體內(nèi)轉移的抑制61-87
• 1 材料61-62
• 1.1 實驗動物61
• 1.2 細胞系61-62
• 1.3 動物實驗所需手術器械及用品62
• 1.4 生化試劑62
• 1.5 儀器設備62
• 2 方法62-66
• 2.1 慢病毒感染建立HCT116-Luc細胞系62-63
• 2.2 原位移植瘤模型的建立63-64
• 2.3 Genistein及KBU2046灌胃64
• 2.4 小動物活體成像及遠處轉移程度評估64
• 2.5 原位腫瘤大小測量64-65
• 2.6 HE染色65
• 2.7 免疫組織化學染色及結果分析65-66
• 3 結果66-81
• 3.1 慢病毒感染建立HCT116-Luc細胞系66-67
• 3.2 裸鼠原位種植模型的建立67-70
• 3.3 Genistein和KBU2046對原位腫瘤大小的影響70-73
• 3.4 Genistein和KBU2046對遠處器官轉移的影響73-77
• 3.5 Genistein和KBU2046對小鼠的毒性作用77-78
• 3.6 腫瘤大小與遠處器官轉移的相關性78-79
• 3.7 Genistein和KBU2046對原位腫瘤中Ki67的表達水平的影響79-80
• 3.8 Genistein和KBU2046對原位腫瘤中CD34的表達水平的影響80-81
• 4 討論81-87
• 第四部分Genistein和KBU2046抑制結腸癌轉移的分子機制研究87-108
• 1 材料87-88
• 1.1 組織芯片和組織切片制備87
• 1.2 生化試劑87-88
• 1.3 主要儀器88
• 2 方法88-94
• 2.1 PCR array88-92
• 2.2 q PCR92-93
• 2.3 Western blot93
• 2.4 免疫組織化學染色93-94
• 2.5 免疫組織化學染色的結果評估94
• 3 結果94-105
• 3.1 PCR array對Genistein和KBU2046處理后腫瘤轉移相關基因的篩選94-98
• 3.2 PCR array篩選結果的驗證98-101
• 3.3 結腸癌患者中FLT4表達與臨床病理資料和患者預后的相關分析101-104
• 3.4 Genistein和KBU2046對蛋白激酶磷酸化的影響104-105
• 4 討論105-108
• 小結108-109
• 參考文獻109-127
• 附錄127-142
• 個人簡歷和研究成果142-144
• 致謝144-146

  本文關鍵詞：Genistein及其改構體KBU2046抑制結腸癌轉移的作用和分子機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：404603