本文關(guān)鍵詞：Genistein及其改構(gòu)體KBU2046抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的作用和分子機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：【目的】已有研究提示染料木黃酮Genistein可有效抑制前列腺癌的生長和轉(zhuǎn)移,但隨著劑量增加會產(chǎn)生毒性和雌激素樣副作用。為保留其抗腫瘤活性而削減其毒副作用,前期已在Genistein基礎(chǔ)上進行改構(gòu)得到小分子化合物KBU2046。本研究旨在探討Genistein及KBU2046對結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的作用及相關(guān)分子機制�！痉椒ā勘菊n題應(yīng)用的實驗方法具體包括,采用CCK8試劑盒檢測藥物對細胞增殖活性的影響;通過平板克隆形成實驗檢測藥物對腫瘤細胞克隆形成能力的影響;通過劃痕、transwell侵襲/遷移、高內(nèi)涵運動試驗觀察藥物對細胞侵襲、運動能力的影響;建立結(jié)腸癌原位種植模型,結(jié)合小動物活體成像技術(shù)評估藥物對體內(nèi)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用;通過免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)染色檢測原位腫瘤細胞中增殖標志物Ki67和血管內(nèi)皮標志物CD34的表達以評估腫瘤細胞增殖能力和瘤內(nèi)血管形成能力;采用q PCR array篩選藥物影響的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因并通過western blot、q PCR以及IHC染色分別在細胞及動物原位瘤組織中進行驗證;在結(jié)腸癌患者腫瘤組織中通過IHC分析所得分子和臨床指標的相關(guān)性;采用Western blot研究藥物對細胞內(nèi)蛋白激酶磷酸化水平的影響�！窘Y(jié)果】目前已取得的主要結(jié)果小結(jié)如下:在結(jié)腸癌細胞系和正常腸粘膜上皮細胞中,10μM以上Genistein可抑制細胞增殖活性和克隆形成能力;10μM Genistein可在不產(chǎn)生細胞毒性的前提下抑制結(jié)腸癌細胞的遷移、侵襲和運動能力;KBU2046在劑量高達50μM時仍不對結(jié)腸正常細胞或癌細胞產(chǎn)生明顯毒性;10μM KBU2046可以有效抑制結(jié)腸癌細胞的遷移、侵襲和運動能力;在裸鼠原位結(jié)腸癌種植模型中,Genistein和KBU2046可有效抑制人結(jié)腸癌細胞在裸鼠體內(nèi)的肝/肺轉(zhuǎn)移,而對腫瘤生長并無明顯抑制。為探討兩種藥物抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的分子機制,采用q PCR array對轉(zhuǎn)移相關(guān)基因進行了篩選,經(jīng)體內(nèi)、外驗證,發(fā)現(xiàn)Genistein和KBU2046均可抑制FLT4和MMP2的表達。進一步研究還提示結(jié)腸癌患者腫瘤組織中FLT4表達與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),其中高表達FLT4提示預后較差。通過檢測結(jié)腸癌細胞中經(jīng)藥物處理后蛋白激酶磷酸化水平的變化,發(fā)現(xiàn)在相同濃度條件下,Genistein可抑制Akt、Erk1/2、p38 MAPK磷酸化,而KBU2046僅抑制Erk1/2、p38 MAPK磷酸化,且效果較Genistein更強,二者對JNK磷酸化均無明顯抑制作用。具體結(jié)果如下:在正常腸上皮細胞HIEC、結(jié)腸癌細胞HCT116、HT29、SW620中檢測不同劑量Genistein對細胞活性的影響,發(fā)現(xiàn)Genistein在10μM以上會對結(jié)腸細胞產(chǎn)生殺傷活性。為專注于藥物對細胞運動的影響,本研究選取10μM進行以下相關(guān)實驗。通過transwell實驗、劃痕實驗和高內(nèi)涵運動實驗,發(fā)現(xiàn)10μM Genistein能有效抑制細胞的侵襲、遷移和運動能力。在明確Genistein可以在體外抑制結(jié)腸癌細胞侵襲、遷移和運動的前提下,采用相同的實驗方法檢測其改構(gòu)體KBU2046對細胞活性和侵襲、遷移能力的影響,發(fā)現(xiàn)在與Genistein相同的濃度下,KBU2046的細胞毒性遠低于Genistein,但亦能有效抑制細胞的侵襲和遷移能力。為進一步觀察Genistein和KBU2046對結(jié)腸癌體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響,我們首先通過移植皮下瘤到裸鼠結(jié)腸的方法建立了結(jié)腸癌原位種植轉(zhuǎn)移模型,并通過小動物成像系統(tǒng)對穩(wěn)定表達luciferase的HCT116細胞進行定量評估原位腫瘤的大小和肝肺轉(zhuǎn)移的程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Genistein和KBU2046在不影響原位腫瘤生長的條件下,均能在不同程度上抑制腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移。對原位腫瘤組織中細胞增殖標志物Ki67和血管內(nèi)皮標志物CD34的表達進行分析,發(fā)現(xiàn)藥物并沒有顯著影響細胞增殖,但可以抑制腫瘤內(nèi)部新生血管形成,并表現(xiàn)出劑量依賴的趨勢。對原位腫瘤大小與肝/肺轉(zhuǎn)移程度進行相關(guān)分析沒有發(fā)現(xiàn)二者之間存在顯著相關(guān)性。為探討藥物的作用機制,我們通過PCR array對兩種藥物處理后細胞中轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的變化進行了檢測,并通過q PCR、western blot進行驗證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Genistein和KBU2046均可在不同程度上抑制細胞中MMP2和FLT4的表達水平。進一步通過IHC染色發(fā)現(xiàn)在原位腫瘤組織中,Genistein和KBU2046處理后也能引起MMP2和FLT4表達下調(diào)。MMPs家族蛋白在腫瘤轉(zhuǎn)移尤其腫瘤侵襲中的研究較為詳盡,在多種腫瘤中都有MMP2與轉(zhuǎn)移相關(guān)的報道。而FLT4與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的直接關(guān)系尚不明確。目前在多種腫瘤類型中有關(guān)其表達與臨床病理資料相關(guān)性的結(jié)果不盡相同。為進一步驗證FLT4在結(jié)腸癌患者中與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性,我們通過組織芯片在60例結(jié)腸癌患者的腫瘤組織及來自同一患者的正常組織中檢測了FLT4表達水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)FLT4在腫瘤組織中表達顯著高于正常組織,且其表達水平與惡性程度相關(guān)。通過Kaplan-Meier方法進行生存分析發(fā)現(xiàn)FLT4表達水平與患者生存成負相關(guān)。Genistein作為一種酪氨酸蛋白激酶抑制劑,可以抑制多種蛋白激酶的磷酸化水平。為比較KBU2046和Genistein作用機制的差異,我們對蛋白激酶磷酸化的改變進行了初步研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Genistein和KBU2046對蛋白激酶磷酸化的影響不盡相同。具體來講,KBU2046對ERK1/2和p38磷酸化的抑制程度較Genistein顯著,但對Akt磷酸化沒有明顯抑制作用,二者對JNK磷酸化均沒有顯著影響�！窘Y(jié)論】Genistein及其改構(gòu)體KBU2046在體外細胞實驗和體內(nèi)結(jié)腸癌原位種植模型中均顯示了抑制結(jié)腸癌細胞轉(zhuǎn)移的活性;這一作用可能通過抑制轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MMP2和FLT4表達實現(xiàn)。兩種藥物在對蛋白激酶活性的抑制上存在差異,提示KBU2046雖然通過保留Genistein的骨架結(jié)構(gòu)而保留了其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的主要活性,但具體作用機制可能與母體有所不同,這將在以后的工作中進行深入研究。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移 Genistein KBU2046 裸鼠結(jié)腸癌原位種植模型 FLT4
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.35
【目錄】：

• 縮略語表7-8
• 中文摘要8-12
• 英文摘要12-17
• 前言17-19
• 文獻回顧19-37
• 第一部分 結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的分子機制及治療現(xiàn)狀19-27
• 第二部分 Genistein的研究現(xiàn)狀27-37
• 第一部分Genistein對結(jié)腸癌細胞生長和侵襲運動的影響37-51
• 1 材料37-38
• 1.1 細胞37
• 1.2 主要生化試劑37-38
• 1.3 主要儀器38
• 2 方法38-40
• 2.1 CCK8細胞生存率檢測38
• 2.2 CCK8細胞增殖檢測38
• 2.3 平板克隆形成實驗38-39
• 2.4 Transwell侵襲實驗39
• 2.5 Transwell遷移實驗39-40
• 2.6 劃痕實驗40
• 2.7 高內(nèi)涵運動實驗40
• 3 結(jié)果40-47
• 3.1 Genistein對結(jié)腸癌細胞活性的影響40-41
• 3.2 Genistein對結(jié)腸癌細胞增殖能力的影響41-42
• 3.3 Genistein對結(jié)腸癌細胞克隆形成能力的影響42-44
• 3.4 Genistein對結(jié)腸癌細胞侵襲能力的影響44
• 3.5 Genistein對結(jié)腸癌細胞遷移和運動能力的影響44-47
• 4 討論47-51
• 第二部分KBU2046對結(jié)腸癌細胞生長和侵襲運動的影響51-61
• 1 材料51-52
• 1.1 細胞51
• 1.2 主要生化試劑51
• 1.3 主要儀器51-52
• 2 方法52-54
• 2.1 CCK8細胞生存率檢測52
• 2.2 Transwell侵襲實驗52
• 2.3 Transwell遷移實驗52-53
• 2.4 劃痕實驗53
• 2.5 高內(nèi)涵運動實驗53-54
• 3 結(jié)果54-58
• 3.1 KBU2046對結(jié)腸癌細胞活性的影響54-55
• 3.2 KBU2046對結(jié)腸癌細胞侵襲能力的影響55
• 3.3 KBU2046對結(jié)腸癌細胞遷移和運動能力的影響55-58
• 4 討論58-61
• 第三部分Genistein和KBU2046對原位種植結(jié)腸癌體內(nèi)轉(zhuǎn)移的抑制61-87
• 1 材料61-62
• 1.1 實驗動物61
• 1.2 細胞系61-62
• 1.3 動物實驗所需手術(shù)器械及用品62
• 1.4 生化試劑62
• 1.5 儀器設(shè)備62
• 2 方法62-66
• 2.1 慢病毒感染建立HCT116-Luc細胞系62-63
• 2.2 原位移植瘤模型的建立63-64
• 2.3 Genistein及KBU2046灌胃64
• 2.4 小動物活體成像及遠處轉(zhuǎn)移程度評估64
• 2.5 原位腫瘤大小測量64-65
• 2.6 HE染色65
• 2.7 免疫組織化學染色及結(jié)果分析65-66
• 3 結(jié)果66-81
• 3.1 慢病毒感染建立HCT116-Luc細胞系66-67
• 3.2 裸鼠原位種植模型的建立67-70
• 3.3 Genistein和KBU2046對原位腫瘤大小的影響70-73
• 3.4 Genistein和KBU2046對遠處器官轉(zhuǎn)移的影響73-77
• 3.5 Genistein和KBU2046對小鼠的毒性作用77-78
• 3.6 腫瘤大小與遠處器官轉(zhuǎn)移的相關(guān)性78-79
• 3.7 Genistein和KBU2046對原位腫瘤中Ki67的表達水平的影響79-80
• 3.8 Genistein和KBU2046對原位腫瘤中CD34的表達水平的影響80-81
• 4 討論81-87
• 第四部分Genistein和KBU2046抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的分子機制研究87-108
• 1 材料87-88
• 1.1 組織芯片和組織切片制備87
• 1.2 生化試劑87-88
• 1.3 主要儀器88
• 2 方法88-94
• 2.1 PCR array88-92
• 2.2 q PCR92-93
• 2.3 Western blot93
• 2.4 免疫組織化學染色93-94
• 2.5 免疫組織化學染色的結(jié)果評估94
• 3 結(jié)果94-105
• 3.1 PCR array對Genistein和KBU2046處理后腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的篩選94-98
• 3.2 PCR array篩選結(jié)果的驗證98-101
• 3.3 結(jié)腸癌患者中FLT4表達與臨床病理資料和患者預后的相關(guān)分析101-104
• 3.4 Genistein和KBU2046對蛋白激酶磷酸化的影響104-105
• 4 討論105-108
• 小結(jié)108-109
• 參考文獻109-127
• 附錄127-142
• 個人簡歷和研究成果142-144
• 致謝144-146

  本文關(guān)鍵詞：Genistein及其改構(gòu)體KBU2046抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的作用和分子機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：404603