本文關(guān)鍵詞：生物降解復(fù)合材料聯(lián)合頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)不同類型骨缺損修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：牙周病是常見的口腔疾病,主要造成牙齒支持組織的破壞。目前牙周再生技術(shù)已被廣泛用于促進(jìn)牙支持組織的愈合。而再生技術(shù)的關(guān)鍵之一——植骨材料,通常用來治療骨缺損。現(xiàn)在臨床上主要的植骨材料包括自體骨、異體骨、異種骨和合成材料。自體骨是理想的植骨材料,但缺點(diǎn)是造成二次創(chuàng)傷、獲取有限、易吸收等;異體骨具有良好的骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)作用,但有免疫排斥和疾病傳染的風(fēng)險(xiǎn);異種骨Bio-Oss和合成材料殼聚糖是良好的生物活性支架材料,在人體內(nèi)具有良好的生物相容性。近年來,殼聚糖由于其生物相容性好、可降解、具有抗炎作用等受到越來越多的關(guān)注。它被廣泛用于支架材料、藥物載體、傷口愈合等方面。Bio-Oss植骨材料是一種碳酸鹽磷灰石結(jié)晶體,通過將牛骨特殊加工處理,去除其蛋白質(zhì)和其他有機(jī)成分,并保持天然骨的無機(jī)結(jié)構(gòu),從而得到特別的骨引導(dǎo)支架,有助于新骨的形成,促進(jìn)血管的再生和血凝塊的穩(wěn)定。目前天然高分子復(fù)合材料在骨組織工程中發(fā)揮著越來越重要的作用。下一代生物支架應(yīng)當(dāng)具備生物活性和生物降解特點(diǎn),包括模擬自然骨的生理作用和激活體內(nèi)組織再生過程。復(fù)合材料則是基于上述要求,將可降解高分子材料和生物活性支架結(jié)合于一身,比如將殼聚糖和Bio-Oss組合。殼聚糖的機(jī)械強(qiáng)度低于自然骨,不能承重和支撐外力,并且其自身不具有骨誘導(dǎo)作用,這就需要加入生物活性支架改善機(jī)械強(qiáng)度和骨誘導(dǎo)性。目前有很多材料加入殼聚糖中能改善其機(jī)械和生物特性,比如羥基磷灰石、β-三磷酸鈣、硫酸鈣、藻酸鹽等。這樣的復(fù)合材料具有特定的物理、生物、機(jī)械性能和可控制的降解性。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)是骨組織工程中成熟的種子細(xì)胞,具有多向分化潛能。大部分已有研究的BMMSCs來自長骨或髂骨骨髓。由于其獲取方便,體外擴(kuò)增鑒定簡單,被用來和多種生物材料復(fù)合共同促進(jìn)再生。但目前很多研究表明,頜骨來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(jaw bone-derived BMMSCs,JBMMSCs)相對(duì)髂骨來源BMMSCs具有更強(qiáng)的生物學(xué)特性。將生物材料與干細(xì)胞復(fù)合后形成的新型材料是否就能達(dá)到理論上的先進(jìn)性?實(shí)用臨床效果如何?目前仍無定論;尤其是人體應(yīng)用受到諸多條件和倫理所限,無法觀察到是否形成了真正的組織學(xué)再生過程。所以本研究將通過體外材料和細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)和定量組織學(xué)實(shí)驗(yàn)來系統(tǒng)觀察和評(píng)估殼聚糖/Bio-Oss復(fù)合材料與人頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Human jaw bone marrow mesenchymal stem cells,h JBMMSCs)促進(jìn)組織愈合的可行性以及前景。目的1、制備不同比例的殼聚糖/Bio-Oss復(fù)合材料并比較其理化性能;體外比較復(fù)合材料對(duì)hJBMMSCs粘附、增殖等生理特性的影響;2、觀察殼聚糖/Bio-Oss復(fù)合材料聯(lián)合h JBMMSCs在大鼠顱骨缺損中的骨再生潛能;3、比較篩選一種合適的牙周骨缺損組織修復(fù)模型;4、將殼聚糖/Bio-Oss復(fù)合材料聯(lián)合hJBMMSCs植入所篩選的牙周骨缺損中評(píng)價(jià)其促牙周再生能力;5、為開發(fā)新型復(fù)合材料促進(jìn)牙周和口腔組織再生提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法1、殼聚糖/Bio-Oss復(fù)合材料理化性能檢測按照殼聚糖和Bio-Oss粉的比例(100:0、75:25、50:50、25:75)將Bio-Oss粉加入殼聚糖/β-GP溶液中,凍干后用掃描電鏡觀察材料的孔徑及孔隙率,測定材料的抗壓強(qiáng)度、溶脹率、降解率。2、殼聚糖/Bio-Oss復(fù)合材料與hJBMMSCs體外共培養(yǎng)的生物學(xué)特性評(píng)價(jià)采用組織塊法分離培養(yǎng)原代h JBMMSCs,有限稀釋法純化細(xì)胞;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記物;細(xì)胞克隆形成能力;成脂、成骨誘導(dǎo)檢測細(xì)胞多向分化能力;CCK-8法檢測細(xì)胞在材料上的增殖;掃描電鏡觀察細(xì)胞在材料表面的粘附;試劑盒檢測材料對(duì)細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響。3、殼聚糖/Bio-Oss復(fù)合材料聯(lián)合h JBMMSCs修復(fù)大鼠顱骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究將hJBMMSCs與殼聚糖/Bio-Oss復(fù)合材料共培養(yǎng),植入8mm直徑的SD大鼠極限顱骨缺損,8周后觀察大體情況、Micro-CT檢測缺損修復(fù)情況、HE染色和Masson's trichrome染色觀察缺損愈合情況,免疫組化觀察細(xì)胞植入后成骨細(xì)胞分化相關(guān)蛋白(骨鈣素)表達(dá)情況。4、不同牙周骨缺損類型對(duì)引導(dǎo)組織再生術(shù)的組織修復(fù)能力的影響分別制備不同大小的1-,2-,3-壁牙周骨缺損和水平型III°根分叉骨缺損,植入Bio-Oss骨粉和Bio-Gide膜,8周后觀察大體牙周愈合情況、Micro-CT檢測骨缺損修復(fù)情況、HE染色和Masson trichrome觀察牙周組織修復(fù)情況。篩選出適合評(píng)估牙周組織再生的骨缺損模型。5、殼聚糖/Bio-Oss復(fù)合材料聯(lián)合h JBMMSCs修復(fù)犬1壁牙周骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究將h JBMMCs與殼聚糖/Bio-Oss復(fù)合材料共培養(yǎng),植入1壁牙周骨缺損,8周后觀察大體情況、Micro-CT檢測骨缺損修復(fù)情況、HE染色和Masson trichrome觀察骨缺損愈合情況、免疫組化觀察細(xì)胞植入后成骨細(xì)胞分化相關(guān)蛋白(骨鈣素)表達(dá)情況。結(jié)果1、單純殼聚糖組(C組)的孔徑、孔隙率、溶脹率和降解率均高于三組殼聚糖/Bio-Oss復(fù)合材料[C/B(75:25)、C/B(50:50)、C/B(25:75)],而C/B(75:25)組和C/B(50:50)組的孔隙率、溶脹率和降解率均高于C/B(25:75)組;同時(shí)C/B(75:25)組的降解率高于C/B(50:50)組;在抗壓強(qiáng)度方面,三組殼聚糖/Bio-Oss抗壓強(qiáng)度均高于C組,其中C/B(25:75)、C/B(50:50)組高于C/B(75:25)組。2、h JBMMSCs體外原代培養(yǎng)后,細(xì)胞貼壁培養(yǎng),呈長梭形,并具有自我增殖和細(xì)胞克隆能力。細(xì)胞能陽性表達(dá)CD90、CD105、CD29、CD146、STRO-1等間充質(zhì)來源干細(xì)胞標(biāo)志,陰性表達(dá)CD34和CD45造血干細(xì)胞標(biāo)志。成骨誘導(dǎo)可見鈣化結(jié)節(jié)沉淀,成脂誘導(dǎo)可見脂滴形成。h JBMMSCs在三種材料(殼聚糖、殼聚糖/Bio-Oss、Bio-Oss)表面均能良好的粘附、生長,且三種材料對(duì)細(xì)胞的ALP活性影響無明顯差異。3、第8周時(shí),大體觀察及Micro-CT示:比較新骨體積分?jǐn)?shù),實(shí)驗(yàn)組(C/B+cell、C+cell、B、C/B、C)高于對(duì)照組(p0.05),B組和C/B+cell組高于C+cell組、C/B組和C組(p0.05);組織學(xué)觀察及定量分析示(p0.05):比較新骨面積,實(shí)驗(yàn)組(C/B+cell、C+cell、B、C/B、C)的新骨量高于對(duì)照組(p0.05),B組、C/B+cell組、C/B組、C+cell組高于C組(p0.05)。免疫組化顯示,植入細(xì)胞組(C/B+cell、C+cell)新生骨周圍及內(nèi)部可見OCN陽性表達(dá)細(xì)胞,無細(xì)胞組(C、C/B、B、對(duì)照組)新生骨周圍表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于加細(xì)胞組。4、第8周時(shí),大體觀察及Micro-CT示:1-,2-,3-壁骨缺損和III°根分叉缺損實(shí)驗(yàn)組的新骨量均高于各組對(duì)應(yīng)的對(duì)照組(p0.05);組織學(xué)觀察及定量分析示:比較新骨高度和面積,1-,2-,3-壁骨缺損和III°根分叉骨缺損實(shí)驗(yàn)組均高于對(duì)應(yīng)的對(duì)照組(p0.05);而對(duì)于結(jié)締組織附著、結(jié)合上皮長度、新生牙骨質(zhì)及新生牙周膜指標(biāo)等,只有1壁骨缺損的實(shí)驗(yàn)組均優(yōu)于各種對(duì)應(yīng)的對(duì)照組(p0.05)。5、第8周時(shí),大體觀察及Micro-CT示:比較新生骨量,所有實(shí)驗(yàn)組(C、C+cell、C/B、C/B+cell、Bio-Oss)均高于對(duì)照組(p0.05),B組高于C組、C+cell組、C/B組(p0.05);組織學(xué)觀察及定量分析示:比較新骨高度和新骨面積,C組、C+cell組、C/B+cell組、B組和C/B組高于對(duì)照組(p0.05),B組、C/B組和C/B+cell組高于C組(p0.05);新生牙周膜、新生牙骨質(zhì)的指標(biāo)中,C/B+cell組和B組高于C/B組、C+cell組、C組、對(duì)照組(p0.05);免疫組化顯示:植入細(xì)胞組(C/B+cell、C+cell)新生骨周圍及內(nèi)部可見OCN陽性表達(dá)細(xì)胞,無細(xì)胞組(C、C/B、B、對(duì)照組)新生骨周圍表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于加細(xì)胞組。結(jié)論1、殼聚糖和Bio-Oss復(fù)合后能明顯提高殼聚糖的抗壓強(qiáng)度、降低其降解性能。殼聚糖和Bio-Oss質(zhì)量比為50:50時(shí),其孔徑、抗壓強(qiáng)度、溶脹率、降解率等方面性能較好。2、hJBMMSCs在殼聚糖/Bio-Oss復(fù)合材料上能良好的生長和增殖,殼聚糖/Bio-Oss復(fù)合材料對(duì)h JBMMSCs的ALP活性無明顯影響,具有良好的生物相容性。3、牙周骨缺損模型中,1壁骨缺損與2壁、3壁骨缺損及水平III°根分叉骨缺損相比,雖然病損體積更大,組織修復(fù)的來源少,卻在牙周再生的各項(xiàng)指標(biāo)中具有更大的可比性,更適合作為評(píng)估牙周再生動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?、殼聚糖/Bio-Oss復(fù)合材料聯(lián)合hJBMMSCs,部分hJBMMSCs分化為成骨細(xì)胞,與體內(nèi)自身細(xì)胞共同促進(jìn)了大鼠顱骨缺損、犬牙周1壁骨缺損的修復(fù),并且與單純殼聚糖和殼聚糖/Bio-Oss相比具有更強(qiáng)的促進(jìn)成骨及促牙周組織再生能力。雖然在骨量方面沒有超過單純Bio-Oss材料,但從材料存留量以及生物學(xué)修復(fù)基礎(chǔ)等多方面綜合考量其應(yīng)有更強(qiáng)的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：殼聚糖 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 Bio-Oss 顱骨缺損 牙周骨缺損
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R783.1
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-12
• 英文摘要12-18
• 前言18-20
• 文獻(xiàn)回顧20-40
• 實(shí)驗(yàn)一 殼聚糖/Bio-Oss復(fù)合材料的制備和理化性質(zhì)的測定40-48
• 1 材料40-41
• 2 方法41-43
• 3 結(jié)果43-45
• 4 討論45-48
• 實(shí)驗(yàn)二 殼聚糖/Bio-Oss復(fù)合材料與h JBMMSCs體外共培養(yǎng)的生物學(xué)特性評(píng)價(jià)48-56
• 1 材料48-49
• 2 方法49-51
• 3 結(jié)果51-54
• 4 討論54-56
• 實(shí)驗(yàn)三 殼聚糖/Bio-Oss復(fù)合材料聯(lián)合h JBMMSCs修復(fù)大鼠顱骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究56-66
• 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑設(shè)備56
• 2 方法56-58
• 3 結(jié)果58-62
• 4 討論62-66
• 實(shí)驗(yàn)四 不同牙周骨缺損類型對(duì)牙周再生能力的影響66-77
• 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑設(shè)備66
• 2 實(shí)驗(yàn)方法66-69
• 3 結(jié)果69-75
• 4 討論75-77
• 實(shí)驗(yàn)五 殼聚糖/Bio-Oss復(fù)合材料聯(lián)合h JBMMSCs修復(fù)犬1 壁牙周骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究77-91
• 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑設(shè)備77
• 2 方法77-80
• 3 結(jié)果80-86
• 4 討論86-91
• 小結(jié)91-92
• 參考文獻(xiàn)92-109
• 個(gè)人簡歷和研究成果109-110
• 致謝110

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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6 戴l，

本文編號(hào)：400905